课题3 血红蛋白的提取和分离ppt课件.ppt

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1、2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究1.分离生物大分子的基本思路是什么？2.蛋白质的分离和提取的原理是什么？提取分离方法？3.凝胶色谱法的概念？凝胶色谱法的原理？4.缓冲溶液的概念、作用？5.电泳法的原理？6.聚丙稀酰胺凝胶电泳原理？SDS作用机理？1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性

2、质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识3、提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法二、凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据相对分子质量的大小，来分离蛋白质的方法。1.概念3.凝胶色谱法的原理①大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快②小分子通过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分

3、子流动慢收集大分子收集小分子三、缓冲溶液(洗脱剂)1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外界少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。3.作用:NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO32、组成:弱酸和强碱盐通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。思考：在本课题中使用的缓冲液是:__________,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液4.缓冲溶液的配制:其目

4、的是:四、电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：许多生物大分子，都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。不同分子带电有差异，分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。4、测定蛋白质分子量的常用方法在一定PH下，使蛋白质带上正电或负电，加入带负电荷的SDS，形成“蛋白质-SDS复合物”，使蛋白质迁移速度仅取决于分子大小。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳二、实验操作血液血浆水分固体物质：

5、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团2.思考：血液有哪些成分？1.思考:用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：1、红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.目的:操作：将血液离心，去上层黄色血浆，取下层红细胞盐水洗涤2、血红蛋白的释

6、放：蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。（一）样品的处理低速短时间离心高速长时间离心1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）纯化--凝胶色谱操作（四）纯度鉴定（二）粗分离---透析目的：除去样品中分子量较小的杂质和离子。操作：装入透析袋并置于磷酸缓冲液（PH=7）透析思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他

7、蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。血红蛋白提取和分离步骤样品处理：红细胞的洗涤、释放、分离粗分离：除去分子较小的杂质（透析）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定1、凝胶色谱柱的制作：步骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→