高效液相色谱分析法课件.ppt

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1、3高效液相色谱法仪器分析定义：以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪；采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。组成部分：高压输液系统进样系统分离系统检测系统本实验室的高效液相色谱仪（岛津LC-10A）3.1流程液体流动相高压输液泵色谱柱进样器检测器废液信号输出3.2特点特点：高压、高效、高速、高灵敏度适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析具有极大的优势。3.3主要部件(1)高压输液泵主要部件之一，用于输送液体流动相。高柱效的固定相粒度很小（<10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效

2、液相色谱的特点之一,由高压输液泵实现。可单泵使用，也可双泵使用，双泵可实现梯度洗脱。信号采集/转换器A泵B泵检测器(2)梯度洗脱装置利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。可以根据设定的程序改变溶剂配比，从而改变流动相的极性。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(3)进样装置a.准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环；b.进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。分离柱填充物的种类多样，分

3、离机理各不相同，可将高效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解）(5)液相色谱检测器a.紫外-可见光检测器应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率：A=lg(1/T)=kcA--吸光度c--样品浓度b.光电二极管阵列检测器用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波长紫外光。它具有以下优点:可得任意波长的色谱图，极为方便;可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用，从而得到时间-波长-吸光度的三维图谱。紫外光进入流动池，从流动池出来的光再经分光系统、狭缝照射到一组(1024个）光

4、电二极管上，数据收集系统实时记录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱图。c.示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器；每种物质具有不同的折光指数；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比。d.荧光检测器检测对象：对具有荧光特性的物质进行检测；有的物质本身无荧光，但可与荧光试剂发生反应生成荧光衍生物，可用于检测。高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有明显优势。1.流动相特性（a）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（b）亲水性固定相常采用疏水性

5、流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（c）若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。（6）液相色谱流动相常用正相柱：固定相为极性，官能团主要有-CN,-NH2等，后者常称为氨基柱，主要用于极性物质的分离纯化，如蛋白质、氨基酸等。常用反相柱：固定相为非极性，最常用的有ODS柱（C-18柱）填料为十八烷基硅烷，在反相色谱可完成高效液相色谱70～80%的分析任务，在生物化学分析工作中应用的最为广泛。2.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、非极性；按使用方式分：固

6、定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：乙腈、甲醇、水、乙醇、己烷、乙酸乙酯等。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。3.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)4.选择流动

7、相时应注意的几个问题（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。）（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。1液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograp