基因工程原理课件.ppt

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1、基因工程原理DNA与RNA基因指能产生一条肽链的DNA片段。包括编码区和其上下游区域（引导区和尾部），以及在编码片段间（外显子）的割裂序列（内含子）5’3’原核生物基因结构RNA转录子蛋白编码区终止子序列启动子/调控区域3’非翻译区转录起始位点5’非翻译区真核生物基因结构β-珠蛋白基因为例β-珠蛋白基因外显子内含子真核生物与原核生物基因表达基因工程定义基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒、或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定地繁殖。工具酶限制性内切酶修饰酶限制性内切酶的分类与命名细菌的限制与修饰系统分类Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ

2、型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶命名第一个字母是属名的第一个字母（大写），后两个字母是种名前两个字母（小写），有时也包含菌株名称，第一次分离到的内切酶为Ⅰ，其次为Ⅱ等。例如：HindIIIHaemophilusinfluenzaeRd.限制性内切酶与黏末端5’overhang5’overhang5’overhang3’overhangbluntend修饰酶DNA聚合酶RNA聚合酶磷酸酶激酶核酸酶连接酶载体用途1、克隆载体2、表达载体来源1、质粒2、噬菌体3、黏粒载体4、病毒5、细菌人工染色体6、酵母人工染色体载体应具备的条件能自我复制具有选择标记具有多克隆位点质粒质粒载体目的基因的获

3、取人工合成基因组文库cDNA文库PCREcoRIPartialdigestion基因组文库Infectcells基因组DNAcDNA文库mRNAcDNA双链cDNA克隆到载体中转化细菌逆转录酶DNA聚合酶基因组文库cDNA文库PCR一对引物扩增模板dNTP耐高温DNA聚合酶PCR循环高温变性低温退火中温延伸PCR重组DNA分子的构建重组DNA分子导入受体细胞转化转染电穿孔基因枪显微注射根癌农杆菌介导（T-载体）脂质体载体法重组体的筛选与鉴定抗药性记号插入失活筛选β-半乳糖苷酶显色反应筛选菌落或噬菌斑杂交筛选表达载体产物的免疫化学检测法利用营养缺陷型进行筛选重组体的筛选与鉴定抗药性记

4、号插入失活筛选β-半乳糖苷酶显色反应筛选菌落或噬菌斑杂交筛选表达载体产物的免疫化学检测法利用营养缺陷型进行筛选MCSX-gal重组体的筛选与鉴定抗药性记号插入失活筛选β-半乳糖苷酶显色反应筛选菌落或噬菌斑杂交筛选表达载体产物的免疫化学检测法利用营养缺陷型进行筛选BacterialcoloniescontainingclonedsegmentsofforeignDNARadioactiveDNATransfercellstofilter1SolutioncontainingprobeTreatcellsonfiltertoseparateDNAstrands2Add

5、probetofilter3ProbeDNAGeneofinterestHydrogen-bondingAutoradiography4DevelopedfilmColoniesoflivingcellscontaininggeneofinterestCompareautoradiographwithmasterplate5MasterplateFilterpaper重组体的筛选与鉴定抗药性记号插入失活筛选β-半乳糖苷酶显色反应筛选菌落或噬菌斑杂交筛选表达载体产物的免疫化学检测法利用营养缺陷型进行筛选目的蛋白表达形式细胞内表达细胞外表达诱导表达组成型表达定位表达非定位

6、表达谢谢！