生物化学实验课件生物化学实验.ppt

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1、实验六小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定实验目的掌握小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活力测定的原理和方法酶活力：在最适反应条件（25℃）下，每分钟内催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1U=1mol/min。酶的比活力：代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。比活力=活力（U）/蛋白（mg）=总活力（U）/总蛋白（mg）酶活力的测定方法：分光光度法；荧光法；同位素测定法；电化学法基本知识蛋白质（酶）的分离纯化根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等。性质方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤溶解度等电点

2、沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷电泳、离子交换层析吸附性质吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水层析）配体分子亲和层析的生物亲和力1、粗分级分离主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。（1）盐析向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分

3、子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。分段盐析不同蛋白分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不同，因此调节盐浓度，可使不同的蛋白质分别沉淀，如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%饱和度完全饱和析出析出常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在具半透膜（玻璃纸、火绵纸等）性质的透析袋里，放在蒸馏水中进行透析，可不断更换蒸馏水直至杂质被除去。透析袋蛋

4、白质溶液蒸馏水蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐来进一步提纯。脱盐常用透析法。（2）等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。原因？降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。极性有机溶剂与蛋白质争

5、夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。常温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。因此，先将有机溶剂冷却，然后不断搅拌、逐渐加入蛋白质溶液中，以防局部浓度过高，解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2、细分级分离一般蛋白质样品经粗制分级后，进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构

6、分析之用。3、酶的活力测定在酶的制备过程中，每一步骤都应测定酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。总活力=活力单位/ml酶液×总体积（ml）比活力=总活力单位数/总蛋白（mg）纯化倍数=每次比活力/第一次比活力回收率（产率）=（每次总活力/第一次总活力）×100%实验原理小牛肠碱性磷酸酶分子量为145000，等电点为5.7。在体外可催化底物对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，后者在405nm光波长下有最大吸收，通过测定吸收值的变化率，即可测定碱性磷酸酶的活力。实验器材：新鲜小牛肠、匀浆机、离心管、剪刀、载玻片、离心

7、机、滤布、762型分光光度计。试剂：正丁醇、丙酮（-20℃预冷），1mol/LHAc，1mol/LNaOH，硫酸铵，对硝基苯磷酸二钠。平衡缓冲液：0.01mol/LTris-HCl（pH8.0），含1.0×10-3mol/LMgCl2和1.0×10-5mol/LZnCl2。底物缓冲液：1mol/L二已醇胺-盐酸缓冲液（pH9.8），含0.5×10-3mol/LMgCl2。酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液。实验步骤1、取新鲜小牛肠，用剪刀纵向剖开，用载玻片刮小肠粘膜到烧杯里。2、所有组都倒入匀浆机里，加1.5倍体积冷

8、蒸馏水，搅拌均匀，高速匀浆三次，量总体积。取出2ml测酶活和蛋白质