《生物化学技术实验》PPT课件

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1、生物化学技术实验部分(2010版)生物化学研究的核心任务：阐明生命现象的分子机理。生物大分子物质制备的基本过程：确定测定方法材料的选择与处理抽提浓缩纯化有效成分纯度和性质的分析电泳前处理浓缩、粗分离细分离生物组织无细胞提取液破碎、溶解、差速离心、过滤沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤吸附层析蛋白质的制备：一、蛋白质的性质：（1）两性解离的性质：pI（2）胶体性质：不能通过半透膜（3）具有沉淀作用：等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等（4）变性、复性（5）紫外吸收二、分离纯化蛋白质的主要方法（一）根据溶解

2、度差异分离：选择性沉淀法等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法。降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■有机溶剂沉淀法Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有机溶剂Solvent%=hydroph

3、ilic有机溶液沉淀法的优缺点优点分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。缺点易使某些蛋白质或酶变性。常用的有机溶剂乙醇、丙酮丙酮沉淀能力比较强用有机溶剂沉淀法时应注意的问题①温度的控制②有机溶剂的选择③pH值的选择④离子强度的选择⑤分离溶液浓度的控制⑥及时处理沉淀物温度的控制全部操作过程应在低温条件进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷。pH值的选择pH值影响蛋白质在有机溶剂中溶解度，分级沉淀时更应严格控制pH值。应选择pH值在等电点（PI）附近。离子强度的选择离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶

4、在有机溶剂中的溶解度。离子强度≤0.05mol/L为好，过大则需更多的有机溶剂来沉淀。由盐析法沉淀得到的蛋白质或酶，用有机溶剂沉淀前，一定要先透析除盐。分离溶液浓度的控制蛋白质浓度愈大，加入有机溶剂后，蛋白质沉淀量就愈多。蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。浓度过大，共沉淀现象增加，不利于分级沉淀。及时处理沉淀物沉淀物要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。（二）、根据分子大小和形状的差异分离①透析和超滤法：除去小分子物质半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分

5、子酸等）。施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析②密度梯度离心法凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）③凝胶过滤法支持物的选择：（三）根据电荷性质的差异分离1、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳支持物：PAGE、琼脂糖胶等Po

6、lyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Moleculesareseparatedbysizeandchargeinanelectricfield.IsoelectricFocusingreliesonthemigrationofchargedproteinsinanelectricfield等电聚焦法2、离子交换层析法基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂电荷基团：阳离子交换剂（四）配体亲和力的差异：亲和层析利用生物大分子能和其配体（例：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体）通过次级键专一性结合

7、，而在一定的条件下又可解离的原理进行层析的方法。用这种层析方法，一次可将物质提得很纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。■亲和层析作用机理：(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB配体XBAA亲和吸附剂的制备分离纯化一定数量的游离配体载体活化配体与载体偶联Activity■亲和层析图谱：ElutionvolumeProteinpH2.05*（五）HPLC（highperformance/pressureliquidchromatography)HPLC的特点：1.支持介质颗粒细，比表面积

8、大。2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。HPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。纯化方案的评价比活力：活力单位数/mg蛋白纯化倍数：每步的比活力/粗抽提液的比活力回收率：每步的总活力/粗提液的总活力×100%亲和层析纯化胰蛋白酶手脑并用，知行合一胰蛋白酶的制备目前工业上提取胰蛋白酶主要有二种途径：1、从动物胰脏中直接提取。2、从