《生物化学实验技术》PPT课件

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1、生物化学实验技术生物化学实验技术实验一、双缩脲法测定蛋白质含量实验二、紫外分光光度法测定蛋白质含量实验三、血清γ-球蛋白的分离与纯化实验四、碱性磷酸酶Km值测定实验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响实验六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析实验七、SGPT活性测定实验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶实验九、RNA的分离与鉴定实验十、DEAE纤维素离子交换层析法分离蛋白质实验十一、质粒的提取与鉴定实验一双缩脲法测定蛋白质含量【目的要求】掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。【实验器材】中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光

2、光度计【方法步骤】取中试管3支，按下表操作。试剂（ml）标准管样品管空白管蛋白质标准待测液蒸馏水双缩脲试剂0.1————5.0——0.1——5.0————0.15.0各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。【注意事项】1．正确使用微量加样器。2．取液要准确。3.做好标记，不要将试管号弄混。【思考题】1．分光光度计的使用及计算原理。实验二紫外分光光度法测定蛋白质含量【目的要求】①了解分光光度法的基本原理；②能较熟练使用紫外分光光度计。【实验器材】1．紫外分光光度计。2．微量加样器。3．蛋白标准液（1mg/ml

3、）。【方法步骤】1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓度为1mg/ml的蛋白质溶液。2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作管号123456蛋白标准液（ml）生理盐水（ml）0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.0混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制标准曲线。3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml

4、混匀，按上述方法测其吸光度。【结果与分析】1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质浓度。如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。【注意事项】1．加量要准确。2．比色皿的正确应用。3．结果重复3次，取平均值。【思考题】1．为何要同时测定蛋白280nm和260nm处的光吸收值？（一）血清γ-球蛋白的分离与纯化实验三1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3．掌握

5、离心机的正确使用方法。【实验目的】【仪器试剂】试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。【实验原理】1.盐析：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素①电荷(同种电荷相斥）②水化膜（隔离）Pr++++++Pr++++++中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度

6、降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？（2）盐析的影响因素蛋白质的浓度、盐浓度、pH值、温度等。本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。2.层析：待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。3.检测分离效果（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+与其反应呈现黄色或橙色。（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与其呈现红色或紫红色。1．盐析⑴血清2ml放入离

7、心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白）。【实验操作】⑵将离心管中的沉淀用1mlPBS搅拌溶解，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000rpm10分钟（注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。⑴装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。2.脱盐：注意：装

8、柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整（2）加样：