实验十二 血清肌酸激酶测定与应用学习资料.ppt

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1、实验十二血清肌酸激酶测定与应用1实验目的⑴了解血清肌酸磷酸激酶测定的方法。⑵掌握其测定的应用与意义。2实验原理肌酸激酶（Creatinephosphokinase，简称CK）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，肝脏和红细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富，占全身总量的96%之多。肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要，它催化下列反应：上述反应保证肌肉收缩时的能量供应和运动后ATP和肌酸磷酸的再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌细胞透过细胞膜进入血液的结果，其活力很小。正常值每升血液中100活力单位以下。运动训练能使血清肌酸酸

2、磷酸活性升高。其原因一般认为运动时缺氧,代谢产物积累，供能相对不足等原因，引起肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤，促使CK从细胞内释放增加，进入血液循环，其中以肌肉牵拉的机械性损伤或产生血肿等原因最为重要。滑雪运动和马拉松赛跑后，血清CK的活性较高，特别是大强度的马拉松赛跑最高。在运动后4小时升高，8-16小时达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动，冲击性运动，也易引起CK活性升高。大运动量的训练和100m、200m跑比赛后，血清中CK活性都显著升高，尤其是在比赛时，升高更为显著。应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时，一般认为2-

3、3天取血测定一次,在负荷后经常处于100-200国际活力单位/L。如果超过200IU/L，就是运动量过大，身体尚未恢复，此时应调整运动量。3实验器材与试剂⑴器材⑴器材试管、分光光度计、分析天平、采血装置（注射器）、水浴箱、离心机⑵试剂⑵试剂①混合底物pH7.4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）2.4g，加蒸馏水至100ml，再加入0.2N盐酸88.8ml及无水硫酸镁0.34g，调节pH至7.4。此液在室温下可保存数月。0.012M磷酸肌酸溶液：称取磷酸肌酸钠（C4H8O5-O4PNa3·6H2O）4

4、36mg，加蒸馏水至100ml，调节PH至7.4，保存于-25℃或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。0.001MADP溶液：称取ADP钠盐0.233g，加蒸馏水至100ml，调节PH至7.4，保存于-25℃或冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。临用前，取上述（1）（2）（3）试剂各10ml混合。在此混合底物液30ml中，加入盐酸半胱氨酸0.105g，调节PH至7.4。此试剂最好新鲜配制，也可以保存于冰盒中。一般可放5-7天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。②0.3N氢氧化钡溶液称取氢氧化钡（Ba(OH)2·8

5、H2O）4.73g，加蒸馏水使之溶解（可加热助溶），并稀释到100ml。③5%硫酸锌溶液称取硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.82g，加蒸馏水溶解，并稀释到100ml。上述2、3两种溶液配好后，需进行滴定，即吸取5%硫酸锌溶液5ml，放入50ml三角烧瓶中，加入酚酞指示剂2滴，用0.3NBa(OH)2溶液滴定至出现粉红色30秒钟不褪色为止。Ba(OH)2用量与ZnSO4相等，如不相等，可稀释较浓的溶液。④标准肌酸溶液（1.7μM/ml）准确称取无水肌酸22.3mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱

6、中保存，可用数日。⑤双乙酰液先配成1%溶液，置棕色瓶中放冰箱保存。临用时用蒸馏水稀释20倍。⑥贮存碱溶液称取30gNaOH，无水碳酸钠（Na2CO3）64g，加蒸馏水使溶解并稀释至500ml，室温低时可析出沉淀，此时应放于37℃水浴中待沉淀溶解后再使用。⑦α-萘酚溶液称取α-萘酚1g，用上述贮存碱液使溶解，并稀释到100ml，此液必须新鲜配制，否则空白管光密度读数增高。4实验方法与步骤⑴肌酸磷酸激酶显色法⑴肌酸磷酸激酶显色法。①测定CK活性原理：利用上述反应所生成的肌酸与α-萘酚和双乙酸反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色

7、深浅与肌酸含量成正比，与同样处理的肌酸标准液比色，求得酶的活力。加入物（ml）空白管标准管测定管混合底物0.750.750.75血清－－0.1标准肌酸（1.7μM/ml）－0.1－蒸馏水0.1－－置37℃水浴保温30minBa(OH)2溶液0.50.50.5ZnSO4溶液0.50.50.5蒸馏水0.50.50.5混匀，离心5-10min②测定操作步骤（如下表3-14）：表3-14单位：ml上清液0.50.50.5α-萘酚溶液111双乙酰液0.50.50.5置37℃水浴保温15min蒸馏水333离心3~5min，520nm波长处

8、进行比色读取各管的光密度计算：⑵肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：①原理ATP+葡萄糖葡萄糖-6-磷酸+ADP为作用酶葡萄糖-6-磷酸+NADP+6-磷酸-葡萄糖+NADPH+H+为作用酶②器材与试剂：试管、可见光分光光度计、电子分析天平、采血装置（注射器）、水浴锅、离心机、试剂盒测