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1、微生物挑战性实验方法 1.0目的新产品防腐效果的测试2.0范围公司新产品3.0参考：4材料与方法4.1 化妆品中常用的防腐体系[6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4.2 微生物挑战性实验4.2.1 受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括:黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中,于37℃(细菌
2、)或28℃(霉菌)下培养。细菌培养在2天后,霉菌培养在3-5天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌(1×108个/ml)或混合霉菌悬液(1×107个/ml),置于4℃贮放备用。4.2.2 一次加菌的28天微生物挑战试验 此方法参照美国药典(第21版)上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g,加入混合细菌或混合霉菌悬液,每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3×105个霉菌。然后充分混匀,置于28℃下。在接菌的0、7、14、21和28天取样分析:准确称取3g样品,加到含有玻璃小珠的灭菌
3、锥形瓶内,加入27ml灭菌生理盐水,充分震荡混匀,此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量,细菌培养是37℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为:当每克样品中一次接菌(1×106细菌和1×105霉菌)后,在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0.1%,以后逐渐减少,在28天为0。符合标准为防腐剂有效(通过测试),不符合为防腐剂无效(不通过测试)。分析与检测4.2.3 重复3次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CTFA（国际化妆品、香
4、精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g,每隔2周加菌一次(即实验的第1、3和5周),每次加细菌量为1×106～1×107个/g样品和霉菌1×105个/g～1×106个/g 样品。在加菌后的0天、7天和14天(后一次加菌前)采样分析样品中含菌量,方法同前。此方法可将受检样品分为三类:(1)防腐效果优良(W),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量减少至不高于起始浓度的0.01%(即≤100个/g或ml）样品,通过测试)。(2)防腐效果尚可(M),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量减少
5、至不高于起始浓度的0.1%,(即≤1000个/g或mL样品,通过测试)。(3)防腐效果差(P),即三次加菌后,在每次加菌后的第7天或14天时,存活菌量>mL样品(不通过测试)。5、结果判断 受试样品一次加菌和3次加菌后,在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准,将8种防腐体系的防腐效果评判列于表5。从结果看,两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致,三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别:防腐优良(W:We preservative)和防腐尚可(M:Marginapreservative)。此外,
6、在一次加菌后1～2周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0.1%,可通过3次加菌实验,如防腐体系5和8对细菌的防腐力;但若大于0.1%,即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0的趋势,可能亦很难通过3次加菌实验,如防腐体系7对细菌的防腐力。 参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示）(注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍
7、稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总
8、数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数CTFA(美国化妆品香料香精协会) 推荐化妆品微生物挑战用菌 种类菌种名称拉丁名称推荐菌种编号要求
