文昌鱼胚胎原位杂交.doc

《文昌鱼胚胎原位杂交.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、文昌鱼胚胎原位杂交试剂配制DEPC处理水：在ddH2O中加入DEPC，使浓度为0.1%，充分摇匀，再在37℃放置12h以上，然后高压灭菌；（DEPC可破坏各种蛋白，是Rnase的强抑制剂）4%多聚甲醛-MOPS固定液：该溶液含4%（质量体积比）多聚甲醛，0.5MNaCl，2mMEGTA，0.1MMOPS，DEPC处理水新鲜配制；NaPBS溶液：称取6.57gNa2HPO4.12H2O，0.235gNaH2PO4.2H2O，9gNaCl，加ddH2O至1L，调pH至7.4，0.1%终浓度DEPC处理，高压灭菌；NaPBSTw：NaPBS溶液加Twee

2、n-20，使Tween-20的浓度为0.1%，新鲜配制；4%多聚甲醛-NaPBSTw溶液：将固体多聚甲醛溶于NaPBSTw至终浓度为4%（质量体积比）新鲜配制；5mg/mL蛋白酶K：将蛋白酶K溶于PBST，配成终浓度为5mg/mL溶液，-20℃保存；（储存浓度为5mg/ml,用时只需取1ul加入1mlPBST）10%甘氨酸：用DEPC处理水配制，使终浓度为10%（质量体积比），-20℃保存；(甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂)2mg/mL甘氨酸-NaPBSTw：用NaPBSTw溶液配制，使终浓度为2mg/mL，-20℃保存；（20ul10%甘氨酸加入1ml

3、PBST）0.1M三乙醇胺：用DEPC处理水配制，使终浓度为0.1M，调pH至8.0，-20℃保存；（135ul加入10mlDEPC处理水）20×SSC：该溶液用DEPC处理水配制，含0.3M柠檬酸三钠，3MNaCl，调pH至7.0，4℃保存；(SSC缓冲液中的盐离子Na+可中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。)50×Denhardt's溶液：购于Sigama公司,-20℃保存；杂交缓冲液：该缓冲液中含有50%去离子甲酰胺，100mg/L肝素，5×SSC，0.1%Tween-20，5mMEDTA

4、，1×Denhardt's，lmg/mL酵母总RNA，用DEPC处理水配制，然后分装1mL/支，-20℃保存（一般采用去离子甲酰胺调节孵育温度,有报道反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。但是不同的实验条件与实验室需要确定自己的杂交条件。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，具有强酸性，并高度带负电荷）杂交缓冲液配方如下：ContentquantityFinalconcentration100%deionizedformamide50ml50%10mg/mlHeparin（肝

5、素）1ml100µg/ml20XSSC25ml5X100%Tween100µl0.1%0.5MEDTA1ml5mM50xDenhardt’s2ml1X100mg/mlYeasttotalRNA1ml1mg/mlDEPCH2OTo100mlWashBuffer:WashsolutionⅠ(Total50ml)componentvolumefinalconcentrationdeionizedformamide25ml50%20XSSC12.5ml5X10%SDS5ml1%DEPCH2O7.5mlWashsolutionⅡ(Total50ml)comp

6、onentvolumefinalconcentrationdeionizedformamide25ml50%20XSSC5ml2X10%SDS5ml1%DEPCH2O15mlWashsolutionⅢ(Total50ml)componentvolumefinalconcentration20XSSC5ml2XTween-2050µl0.1%DEPCH2O45mlWashsolutionⅣ(Total50ml)componentvolumefinalconcentration20XSSC0.5ml0.2XTween-2050µl0.1%DEPCH2O

7、49.5mlWashsolutionV：1mg/mlblockingreagent用1XNaPBS配置，0.1%Tween-20，4℃保存；(用50ml离心管称取0.05gblockingreagent，加PBST至50ml,65℃水浴至溶解，4℃保存)羊血清：新购买的羊血清需置55℃预处理30min以灭火补体，然后1mL/管分装，-20℃保存；杂交封闭阻断液：溶液含10%羊血清，1mg/mlblockingreagent，NaPBS配制；（100ul羊血清+900ul洗液V）1:3000碱性磷酸酶偶联抗DIG抗体液(6ml)：秤取6mgblock

8、ingreagent于800uLNaPBS/0.1%TritonX-100中70℃加热30min溶解后再加入200uL20