小鼠胚胎原位杂交.ppt

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1、小鼠胚胎原位杂交李艳梅定义：切片原位杂交整体原位杂交原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridizationISH)是应用已知碱基,(比如转录所用的NTP的U碱基标记有DIG辛),顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号。分类：石蜡切片冷冻切片应用：原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Genemapping),转基因检测,基因表达定位、

2、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输，复制和细胞的分类(Sortingofcells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenataldiagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biologicaldosimetry)和病毒学的病原学诊断等。进行整体原位杂交的优点：整体原位杂交具有易操作、周期短、整体效果明显等特点，是一种较新的组织原位杂交方法。胚胎是个体发育的最初阶段，整体原位杂交作为检测胚胎发育过程中基因表达整体效果的快速、有效手段，已在果蝇，小鼠，线

3、虫，斑马鱼，鸡等少数几种动物中应用。杂交所需试剂的配置探针的制备及纯化杂交前胚胎的处理杂交后胚胎的处理显色及结果保存杂交前探针长度和固定剂的选择探针的长度一般应用于ISHH(原位杂交组织化学)探针的最佳长度应在50～10个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针仍可应用，如超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。探针长度３００－１０００bp比较好的选择.进行原

4、位杂交的组织或细胞标本常需经固定处理。尽管许多化学物质对组织/细胞有固定作用，但核酸原位杂交的理想固定液应具备如下特点：①能很好地保持组织细胞的状态；②对核酸无抽提、修饰及降解作用；③不改变被检核酸分子在组织细胞内的定位；④对核酸及探针的杂交过程无阻碍作用；⑤固定液本身对杂交信号无遮蔽、掩盖作用，如不使本底增加等；⑥理化性质稳定、价格低廉。本实验选用4%的多聚甲醛。因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会影响探针穿透入细胞或组织.小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置10XPBS(1liter):80gNaCl

5、、2gKCl、14.4gNa2PO4、2.4gKH2PO4(adjusttopH7.4withHClandbringto1literwithwater)PBT:1XPBSplus0.1%or1%Tween-20NOTE:Formouseembryos,itisrecommendedthatallsolutionswithTweencontain1%,ratherthan0.1%.Tweenisroutinelyusedat0.1%inhechickprotocol.Hybridizationsolution:

6、50%formamide，5XSSC,pH4.5，1%SDS50mg/mlyeasttRNA50mg/mlheparinSolutionI:50%formamide5XSSC,pH4.5，1%SDSSolutionII:0.5MNaCl,10mMTris-HCl,0.1%Tween-20SolutionII加RNaseA.目的是消化未杂交上的ＲＮＡ.SolutionIII:50%formamide2XSSC,pH4.5Sheepserum:inactivatebyheatingto70°Cfor30minut

7、es,storeinaliquotsat-20°C.10XTBS(for1liter):80gNaCl、2gKCl、250ml1MTris-HCl,pH7.5小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置小鼠整体原位杂交所需主要试剂的配置TBST:1XTBSplus0.1/1%Tween-20、2mM(0.5mg/ml)Levamisole(左旋咪唑)NTMT:100mMNaCl、100mMTris-HCl,pH9.550mMMgCl20.1/1%Tween-202mM(0.5mg/ml)Levamisole左旋咪唑20

8、0XNBT:50mg/mlNBTin70%DMF200XBCIP:25mg/mlBCIPinwater要临时配制的试剂有：PBT,用PBT配制的梯度甲醇，6%的过氧化氢，2毫克/毫升的甘氨酸溶液，4%paraformaldehyde和0.2%glutaraldehyde，TBST，封闭溶液（用TBST配制而成的10%的热灭活的羊血清另加0.1%的封闭剂，抗体的稀释（用2%的封闭剂/TBST稀释，每次