核酸杂交的定义.ppt

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1、SouthernBlot核酸杂交的定义杂交（Hybridization）：如果把不同的DNA链放在同一溶液中做变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，只要有某些区域（当然也可以是链的大部分）有成立碱基的可能，它们之间就可形成局部的双链，这一过程称为核酸杂交。SouthernBlot:检测DNANorthernBlot:检测RNASouthernBlot的原理DNA经过标准琼脂糖电泳按分子大小分离，再经原位变性，从胶上转到固相支持物上。附于膜上的DNA可以与标记的DNA，RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影可以确定与

2、探针互补的条带位置。尼龙膜（阳性电荷）：400-500g核酸/cm2变性转移液：0.4mol/LNaOH、1mol/LNaCl水相缓冲液杂交溶液：6*SSC预杂交液：6×SSC（或6×SSPE）5×Denhardt试剂0.5%SDS1g/mlpolyA100g/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA探针SouthernBlot操作流程1、将DNA转移至尼龙膜;2、尼龙膜洗涤、固定；3、与探针杂交；4、成像或显色。1、将DNA转移至尼龙膜1）电泳结束后，将凝胶转移至一玻璃干燥皿，用刀片修除凝胶的无用部分，切去凝胶右下角，以便帮助在以后的

3、操作中辨认凝胶的方位。2）将凝胶置变性转移液（0.4mol/LNaOH、1mol/LNaCl中浸泡15分钟并不断温和地摇动例如置旋转平台上）使DNA变性，更换溶液并继续浸泡20分钟，注意缓慢地摇动之。3）凝胶浸于变性－转移液中的同时，按如下方法准备尼龙膜：a．用一干净解剖刀或切纸刀裁制一张长度和宽度均比凝胶约大1mm的膜。处理膜时应戴手套并用平头镊子（如Millpore镊子）操作。b．将膜漂浮于一盘去离子水的液面上直至由下而上完全湿润，然后将其浸入变性转移液中至少5分钟，用一干净的解剖刀片切去膜的一角，以便与凝胶的切角相对应。4）从变性

4、液中取出凝胶，将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。5）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流短路现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因。6）在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气

5、泡。7）用2×SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。8）切一叠（5～8cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的变性DNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。9）使上述DNA转移持续进行8～24小时，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。10）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于

6、一张干的3MM滤纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。2．膜的洗涤、固定1）从膜上剥除凝胶并弃去，将膜置于0.5mol/LTris·Cl（pH7.2）、1mol/LNaCl中，于室温浸泡15分钟，如此对膜进行中和并除去粘附在其上的琼脂糖。2）将膜从中和液中提出，待拖带的多余液体流去，使膜平铺于一张纸巾上，于室温干燥30分钟以上。3）从如下两种方法中任选一种，将DNA固定在膜上：a．将干燥的膜放至两张3MM滤纸之间，在真空烧箱或普通烘箱内于80℃烘烤0.5－2小时。b．将尼龙膜携带DNA的一面暴露于一紫外光源（254

7、nm）之下。3、杂交1）配制手头实验所需的适量预杂交液。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜约需预杂交液0.2ml。2）将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜漂浮于一盘6×SSC（或6×SSPE）的液面上，待其由下至上完全湿润，将滤膜浸入液体内泡2分钟。3）将湿润滤膜装入可加热封接的袋中，按每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。尽可能将袋内空气压挤出来，用加热封接机封住袋子开口的一边，将其浸入适当温度（以水为溶剂用68℃；以50%甲酰胺为溶剂用42℃）的水浴中温育1～2小时。4）如果放射性标记的探针为双链，则于100℃

8、加热5分钟使其变性，迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性。5）从水浴中取出装有滤膜的杂交袋，动作要迅速，用剪刀剪去袋的一角，向预杂交液中加入经变性的探针，然后尽可能将袋内所有空气压挤出去，用加热封接机