猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立.pdf

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1、猪脑心肌炎病毒的分离鉴定及RT-LAMP快速检测方法的建立IsolationandIdentificationofPorcineEncephalomyocarditisVirusandDevelopmentofRapidDetectionbyaRT-LAMPMethod学位申请人：张岭岭指导教师：孙继国教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：；n-I：ig农业大学答辩日期：二。一一年五月二十九日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特

2、别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盎些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：彩毡必t次签字日期：2口ff年6月f日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑宴垦壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑刍垦垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索

3、，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：劾b驺铭导师签名：勃切卿签字日期：Do／／年占月f日签字日期：a，／年夕月／日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要Illlqlll11111111111111111[11111111Y1897294脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus，EMCV)引起的多种脊椎动物以脑炎、心肌炎、心肌周围炎及繁殖障碍为主要临床特征的急性人畜共患传染病。临

4、床上，脑心肌炎病毒感染最严重和最广泛的动物是猪，可引起仔猪致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可达100％；导致怀孕母猪流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎。人感染后可呈现轻度脑炎症状。脑心肌炎不仅给养猪业带来巨大的经济损失，同时也危害着人类的健康。本研究对河北地区发病猪场疑似猪脑心肌炎病料进行大量采集并处理，接种到BHK-21细胞上进行病毒的分离培养，通过RT-PCR技术，序列测定，病毒感染力的测定及理化特性实验进行鉴定。实验结果：分离得到的病毒能够在BHK-21细胞上生长，细胞出现圆缩、崩解等病变；RT-PCR

5、扩增结果得到286bp的目的片段，与预期的结果一致；序列测定分析结果与预期的结果相同，其核酸序列及氨基酸序列与GenBank公布的其他EMCV毒株的序列同源性为100％；该株EMCV不耐酸，对氯仿和胰蛋白酶不敏感，不耐热，该毒株在50℃，lh的条件下丧失活性。环介导等温扩增技术(100p．mediatedisothermalamplification，LAMP)通过具有链置换特性的BstDNA聚合酶完成靶序列的扩增，仅需恒温就能扩增DNA，并可通过核酸染料染色观察结果。对RNA病毒不需要单独进行反转录反应，可

6、以直接在同一反应管中进行反转录和扩增(RT-LAMP)反应。本研究将RT-LAMP技术用于EMCV的检测中，根据GenBank公布的猪脑心肌炎病毒基因序列，对其进行序列比对筛选保守序列。最后针对GenBankX74312毒株的保守序列(6232bp-6441bp)筛选并验证RT-LAMP特异性引物。引物合成后初步建立RT-LAMP反应，对反应结果用HinfI限制性内切酶进行酶切鉴定，并对所建立的RT-LAMP反应体系及条件进行优化；对RT-LAMP方法的灵敏度和特异性以及重复性与稳定性进行了检验。同时，分别用

7、本试验建立的RT-PCR和RT-LAMP方法对36份提取的RNA样品进行检测。实验结果表明，RT-LAMP最佳反应温度是63℃，反应时间为50min；最佳反应体系(251xL)为：内引物(FIP和BIP)各2．5pL，外引物(F3和B3)各0．5“L，3uLdNTPs(2．5mM)，2．5lxLMgCl2(25mM)，2．5uL10×BstDNABuffer，1．5HLBstDNA聚合酶，2¨LRNA提取物和6儿DEPCH20；其敏感性是普通PCR的100倍；具有较高的特异性；具有很好的可重复性和稳定性。综上

8、所述，本研究成功分离出猪脑心肌炎病毒，并命名为BD2株；并建立了一种灵敏度高、特异性好的EMCV-I盯．IAMP快速检测方法。关键词：猪脑心肌炎病毒；分离与鉴定；环介导等温扩增技术；检测IsolationandIdentificationofPorcineEncephalomyocarditisVirusandDevelopmentofRapidDetectionbyaRT-LAMPMethodAu