第二章.基因工程主要技术原理-PCR技术.ppt

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1、第三节PCR技术原理PCR（polymerasechainreaction）是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。返回目录返回第二章2.3.1核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，

2、使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。2.3.2聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理类似于DNA的体内复制。开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，由于该酶不耐热，因此，每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR具有划时代意义，Mullis

3、等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金2.3.3PCR原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNApolyTemplate:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等Substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpolymerase使用的是来自高温微生物的DNApolymerase5’amplicon3’3’5’94℃37℃72℃Cycle12分子Cycle24分子Cycle38分子2.3.4PCR反应过程①变性。将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；②退火。将反

4、应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对；③延伸。将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。denaturedsDNAssDNA92-96℃annealing37-72℃50-58℃extension72℃94℃94℃2min4℃+72℃2min72℃2min65℃1min变性退火延伸这三个热反应过程的重复称为一个循环一般需使用一对引物新合成的链又可作为模板2.3.5PCR反应体系缓冲液buffer（1×）50mMKCl引物退火10mM

5、Tris.HClpH8.3-9.01.5mMMgCl2(0.5-2.5)dNTP终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0）4种dNTP应平衡，提高忠实性使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系如序列分析和制备探针时，用20-40μm引物各1μm，即1pmol/μlOD260dsDNA50μg/ml（molecularcloning）SsDNA40μg/mloligo33μg/ml引物长度至少16bp，通常20-30bpTm=81.5-16.6log[J+]+0.041(G+C)%-(600/N)N：链长J：单价离子浓度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L，则：Tm

6、=81.5-20.3+22.6-30=53.8简单计算Tm=（G+C）×4+（A+T）×2（用于较短引物）还可从internet计算避免二级结构的形成二聚体二级结构G/C和A/T分布尽管均匀，一般G+C%45-55%OligodT/oligodC除外其它，如5’末端，限制酶位点的长度随机引物6nt10-12nt模板μgorng102-1051μg人类单拷贝基因组DNA3×105targets10ngteastDNA3×1051ngE.coliDNA3×1051ng1kbDNA9×1061%M13plaque106名　　　称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感

7、性、特异性，分析突变复合PCR同时检测多个突变或病原反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR扩增未知基因组DNA单侧引物PCR通过已知序列扩增未知cDNA锚定PCR分析具备不同末端的序列增效PCR减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR有利于产物的分离2.3.6PCR的相关技术连接介导PCRDNA甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR扩增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色体基因原位PCR研究表达基因的细胞比例等臆断PCR