第二章基因工程主要技术原理-电泳、杂交.ppt

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1、1第二章基因操作的主要技术原理第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节PCR基因扩增第四节基因定点诱变第五节DNA核苷酸序列分析第六节研究DNA与蛋白质相互作用的方法返回目录2分子生物学主要技术密度梯度超速离心和电子显微镜技术DNA分子的切割与连接核酸分子杂交、凝胶电泳、DNA序列结构分析以及基因的人工合成、基因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。DNA分子的切割与连接，是基因操作的核心部分返回第二章返回目录3第一节核酸的凝胶电泳1.基本原理2.琼脂糖凝胶电泳3.脉冲电场凝胶电泳返回第二章返回目录42.1.1原理电泳及迁移率核苷酸链多聚阴离子在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架

2、中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA几乎具有等量净电荷无反应活性的稳定的介质降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。52.1.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨范围为0．2～50kb之间.6不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3％琼脂糖50000～10000.7％琼

3、脂糖20000～10001.4％琼脂糖6000～3004.0％琼脂糖1000～10010％琼脂糖500～2520％琼脂糖50～17电泳装置8凝胶电泳的优点它不单是一种分析的手段，同时也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。在这方面，低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶较为方便。LMP琼脂糖是一种熔点为62～65℃的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。9常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电

4、泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，在1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液.作用有①增加样品密度.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，加样操作更方便指示剂10溴化乙锭染色溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr），是一种具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合并在300nm紫外光照射下放射出，可显现凝胶中0.05ug的微量

5、DNA方法：加入凝胶中，凝胶浸泡重要的特性：荧光强度同DNA片段的大小或数量成正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。11电泳照片12银染银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收13LMP琼脂糖回收DNA分子将凝胶在65℃下加热数分钟，然后向液态琼脂糖溶液中加入过量的酚液抽提DNA，这样在离心所得的上清液中便含有除去了琼

6、脂糖的DNA分子。另外，一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37℃下，那么就可以直接进行一定的酶催反应。据此，人们可以对业经电泳分离的DNA酶切片段进行第二种酶切消化反应。将这种混合物加到另一个凝胶槽上，待凝固之后，再进行第二次电泳1415变性胶电泳方法用途162.1.3脉冲电场凝胶电泳DNA大分子的分离：实验表明，即便是浓度为0.1％～0.2％的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子。原核生物，其染色体基因组DNA超过4000kb，哺乳动物DNA达数千kb。常规凝胶，超过一定大小范围的所有的双链DNA分子，都按相同速率迁移。因为它们在单向恒定电场的作用下，仅以“一端向前

7、”的方式游动穿过整个胶板。1984，Schwartz和Cantor：脉冲电场凝胶电泳（pulsed－fieldgelelectrophoresis，简称PFGE）技术，可分离整条染色体。大分子量DNA需更多次数更换构型和方位，以便按新方向游动。迁移速率慢，可分离到107bpDNA大分子。17“电泳”思考题电泳的原理是什么请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、Southern杂交比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线