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1、VOl.22高等学校化学学报NO.92OO1年9月C~EMICALJOURNALOFC~INESEUNIVERSITIES1492~1495二茂铁标记DNA电化学探针的研制及性质研究徐春蔡宏何品刚方禹之(华东师范大学化学系,上海2OOO62)摘要以乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)为偶联活化剂,利用缩合反应分别将电化学活性物质氨基二茂铁(AminOferrOcene,AFC)和醛基二茂铁(FerrOcenecarbOxaldehyde,FCA)成功地标记在变性小牛胸腺DNA片段上,制备成二茂铁标记DNA探针.分
2、别采用电化学~紫外~红外光谱等方法研究了二茂铁标记DNA探针的性质,计算了二茂铁的标记效率,变性小牛胸腺DNA的反应效率以及二茂铁化合物与变性小牛胸腺DNA的反应比率.实验表明,氨基二茂铁和醛基二茂铁与DNA上的磷酸基是以1=1比率进行的反应,该标记反应不影响DNA链碱基的紫外吸收,二茂铁标记DNA探针在石墨电极上有良好的电化学响应.将制备好的二茂铁标记DNA电化学探针置于冰箱中冷冻(温度低于15)保存3个月后用于测定,峰电流仅下降1.2%.关键词二茂铁;标记反应;DNA电化学探针中图分类号O657文献标识码A文章编号O251
3、-O79O(2OO1)O9-1492-O4基因工程日益受到重视,而核酸的结构分析和测试是基因工程中首要解决的问题之一[1],核酸的分子杂交技术是解决这一问题的重要手段[2][3].通常是将单链DNA小片段用同位素~酶~荧光分子~化学发光试剂[4]或电化学活性物质[5]予以标记,然后同被检测DNA中的同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA.这些方法的关键都是要将某种小分子物质标记在DNA片段上,而传统的标记方法存在一些弊端,如检测能力不够,标记方法过于繁杂,使用放射性物质造成污染或者设备昂贵等.而电化学方法具有仪器简单~廉价
4、,测定准确~快速,方法灵敏度高等特点,在核酸的分析识别中日益受到人们的重视.我们[6~8]已报道了几种DNA电化学传感器在DNA分子识别与测定等方面的研究.本文以乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)为偶联活化剂,利用缩合反应,分别将电化学活性物质氨基二茂铁(AFC)和醛基二茂铁(FCA)成功地标记在变性小牛胸腺DNA片段上,制备成二茂铁标记DNA探针.采用不同方法讨论了标记反应的进行,标记效率,变性小牛胸腺DNA片段与二茂铁化合物的反应比率以及二茂铁标记DNA探针在石墨电极上的电化学响应,探针的重现性和寿命,结果
5、令人满意.实验表明,该二茂铁标记DNA电化学探针制备方法快速~简便,标记的效率高,重现性好,寿命长.为DNA电化学探针在特定序列DNA片断的识别~检测和DNA的损伤与保护研究方面奠定了坚实的基础.1实验部分1.1仪器与试剂C~I63OElectrOchemicalAnalyzer(C~IInstrumentsInc.,USA);BransOnJB-1型搅拌器;CS5O1型超级恒温仪(上海实验仪器厂);CG5O型超声波清洗皿(上海必能信超声有限公司);TDL-16B型离心机;VarianCaryWinUV5O型紫外分光光度计(美
6、国);NicOlet5SXCFT-IR红外光谱仪(美国).小牛胸腺DNA(北京百泰生化技术公司),醛基二茂铁和氨基二茂铁(日本东北大学赠送),乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC,美国Sigma公司),三羟甲基氨基甲烷(Tris,美国Sigma公司),咪唑(江苏太仓光耀试剂厂).收稿日期,2OOO-O5-O5.基金项目,国家自然科学基金(批准号,29875OO8)资助.联系人简介,方禹之(1931年出生),男,教授,博士生导师,主要从事电分析化学和生物电化学研究.NO.9徐春等:二茂铁标记DNA电化学探针的研制及性
7、质研究1493################################################################TE缓冲溶液(p~=8.0):10mmOl/LTris-~Cl+1mmOl/LEDTA醋酸缓冲溶液(p~=5.2)咪唑缓冲溶液(p~=6.8).其它试剂均为分析纯实验所用溶液均用二次蒸馏水配制.1.z实验方法1.2.1二茂铁标记DNA电化学探针的制备在1mL0.1mOl/L咪唑缓冲溶液中加入1mL变性小牛胸腺(质量浓度为0.04mg/mL)使DNA上的磷酸基活化充分反应后对于氨基二茂铁在
8、偶联活化剂EDC的存在下直接加入浓度为2.5>104mOl/L的氨基二茂铁溶液0.5mL;对于醛基二茂铁则先加入乙二胺使DNA上经活化的磷酸基与乙二胺连接后再在偶联活化剂EDC的存在下加入42.5>10mOl/L醛基二茂铁0.5mL.控制温度为(250.5)均匀搅拌反应1h从
