DNA提取和制备解读ppt课件.ppt

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1、第一部分DNA提取总论一、提取DNA总的原则：1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。二、样本来源：理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取最常见的样本血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上DNA提取前样本采集、预

2、处理和保存：（一）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差（二）血浆和血清血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测.三、DNA的收率样本类型基因组DNA收率20mg肝脏组织8g100mg豆苗10g100l全血2

3、g2106培养细胞10g四、DNA提取的基本步骤1、核酸的释放：破裂细胞释放核酸（机械法与非机械法）2、核酸的分离与纯化3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤4、DNA鉴定：浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定五、DNA提取试验中常遇到的问题基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全……DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时

4、加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度不可忽视的细节—血液基因组提取天根生化科技（北京）有限公司没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:构建文库PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取原则1：DNA片段长度没有严格要求常规PCR严格要求产物纯度存档、产物长期保存Southern杂交荧光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比较基因组杂交)DNA提取原则2：DNA产物纯度基因组提取方法溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法

5、：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。样本保存和前处理－抗凝血液保存柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。2.抗凝血提取前需要彻底

6、混匀后再吸取实验所需的体积。样本保存和前处理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！样本保存和前处理－白膜层保存全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用

7、红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。2.冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液还是必要的，但用量减半。4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。样本保存和前处理－血清/血浆保存现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理1.冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混

8、匀。2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃