《质粒DNA提取》PPT课件

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1、小规模制备质粒DNA的技术分析一、实验目的(1)学习小规模制备质粒DNA的技术。二、实验原理质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，

2、每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)启始复制子（ori

3、,Originofreplication)；多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。载体的结构：InsertEcoRIXhoI1.9kb三.质粒提取的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNADNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。原理：质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解

4、；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态；将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用

5、下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以

6、复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。四、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于LBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中10000rpm、离心1min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（轻轻混匀），室温（或冰浴）2min加入250uL溶液II（轻轻混匀,反复4-6次），室温静置1min，裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），室温静置,冰上放置5min，质粒D

7、NA复性12000rpm，离心15min，将上清转至另一离心管中备用向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀，10000rpm，离心10min，将上清转至另一离心管中备用向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min12000r/min离心10min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。用500μL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。加入适量（30μL）的TE其中含有20ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解－20℃保存。☆原理示意图相关原理相关原理

8、解释溶液I的作用控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠