《质粒DNA提取》PPT课件.ppt

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1、质粒DNA提取生物实验培训系列之七质粒基础知识一目录2提取方法及条件三提取流程四常见问题解答五质粒的构建及应用二31.质粒的定义2.质粒的分类质粒基础知识一目录提取方法及条件三提取流程四常见问题解答五质粒的构建及应用二1.1质粒的定义质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。41.1质粒的定义大部分的质粒都是环状构型。1984年，在放线菌中发现线形质粒。存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。5天然质粒的DNA长度从数千碱基

2、对至数十万碱基对都有。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。1.1质粒的定义1.2质粒的分类种类代表菌1.接合性质粒E.coli的F质粒2.抗药性质粒*葡萄球菌属3.产细菌素和抗生素质粒梭菌属4.具生理功能的质粒①利用乳糖、蔗糖、尿素、固氮等肠道细菌②降解辛烷、樟脑、萘、水杨酸等假单胞菌属③产生色素Erwinia(欧文氏菌)④结瘤和共生固氮根瘤菌属5.产毒质粒①外毒素，K抗原(荚膜抗原)，内毒素Escherichiacoli②致瘤根癌土壤杆菌③引起龋齿变异链球菌④产凝固酶、溶血素、溶血纤维蛋白酶和肠毒素

3、金黄色葡萄球菌*抗各种抗生素，抗重金属离子(汞，镉，镍，钴，锌，砷)81.质粒、载体的特点2.质粒的构建3.质粒的应用质粒基础知识一目录提取方法及条件三提取流程四常见问题解答五质粒的构建及应用二2.1质粒的特点质粒具有自我复制的能力。质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。质粒可自行丢失与消除。质粒的转移性。质粒可分为相容性与不相容性两种。质粒的特征2.1载体的特点具有复制起点。携带易于筛选的选择标记。具备合适的酶切位点。具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。质粒作为基因工程载体必须具备的条件2.2质粒的构建质粒构建流程分（分离目的基因）切

4、（切割目的基因和载体）接（连接目的基因和载体）转（转化宿主细胞）筛（筛选标记基因）表（表达目的基因）（DNA分子克隆）2.3质粒的应用运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。例：王丽群，孟祥晨.双歧杆菌质粒载体的研究与应用[J].中国乳品工业,2008,36(8):44-50.载体的功能2.3质粒的应用基因工程质粒载体分类克隆载体表达载体用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。例如：pBR322质粒载体，pUC18,pUC19,pGEM-3Z/4Z….例：樊颖伦，赵开军等.大片段克隆载

5、体研究进展[J].中国生物工程杂志,2004,24(3):12-15.添加了强启动子，及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件，用于生产蛋白质。例：杜旻，吴晓俊等.发根农杆菌Ri质粒及其在植物基因工程中的应用[J].药物生物技术,2005,12(3):193-196.2.3质粒的应用目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20~30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124COlE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr151.提取方法2.试剂3.耗材4

6、.设备质粒的定义及分类一目录提取方法及条件三提取流程四常见问题解答五质粒的构建及应用二3.1提取方法氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染1.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.加CsCl和溴乙锭4.超速离心过夜5.在紫外灯下吸取cccDNA6.稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs3.1提取方法沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间1.用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体2.加溶菌酶裂解细菌细胞壁3.沸水浴40秒钟4.离

7、心，用无菌牙签挑去沉淀物5.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA3.1提取方法碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便3.2试剂产品组成溶液P1（BufferP1）溶液P2（BufferP2）溶液P5（BufferP5）漂洗液PWT（BufferPWT）洗脱缓冲液TB（BufferTB）RnaseA(10mg/mL)TIANRed吸附柱CP3（SpinColumnsCP3)收集管（CollectionTubes2mL)3.2耗材各种规格枪头、移液枪PCR管1.5mLEP管PCR板双面板3.3仪器超净工作台离心机高压灭菌锅电热恒温鼓风干燥箱3.3仪器水平电泳仪摇

8、床3.3仪器凝胶成像系统微波炉3.3仪器251.提取流程2.注意事项质粒基础知识一目录提取方法及条件三提取流程四常见问题解