PCR技术及其发展和应用-PPT课件.ppt

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1、PCR技术及其发展和应用张雪梅检验系临床生化教研室主要参考书CW迪芬巴赫、GS德弗克斯勒［美］主编。《PCR技术实验指南》黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方法及应用》尹一兵主编。《分子诊断学》目录PCR技术的原理PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA　　　0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（

2、℃）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本

3、原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550

4、,417PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制然而，采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错

5、PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪实验步骤（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer

6、22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2O16.315.3Total2020（2）PCR反应程序(1)94℃变性5min，(2)94℃变性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。(5)72℃延伸10min。重复(2)-(4)30次PCR结果：1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）PCR产物的电泳鉴定PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，

7、1～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA（1）模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100ngDNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应的影响因素1)反应体系Lambda DNA，模板量分别为100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10f