PCR技术及其应用ppt课件.ppt

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1、第六章PCR技术及其应用§1PCR技术原理§2PCR技术应用第一节PCR技术原理一、PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA

2、引物PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及

3、70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.Mullis<

4、ginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环二、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引

5、物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–Temperatur

6、eislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetS

7、equenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。TargetAmpl

8、ificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,