免疫荧光化学技术gppt课件.ppt

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1、免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons等(1950)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器(FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细

2、胞水平定位的敏感性与准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜观察标本时，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。免疫荧光细胞化学的原理紫外光激发荧光物质放射荧光示意图用荧光抗体示踪

3、或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法。一、直接方法(directmethod)㈠检查抗原方法用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。直接用于细胞或组织抗原的检查，这是最简便、快速的方法，此法特异性强，常用于肾穿刺和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。直接法㈡检查抗体方法将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。二、间接方法(indirect

4、method，又称sandwichmethod)㈠检查抗体方法此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。㈡检查抗体方法用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是常检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。㈢检查抗原法此

5、法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原－抗体－荧光抗体的复合物。同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。间接法三、补体法㈠直接检查组织内免疫复合物方法用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原－抗体－补体复合物—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光

6、的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。㈡间接检查组织内抗原方法常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原－抗体－补体—荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。补体法四、双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，加在标本上

7、孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。五、对照试验为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验：㈠直接方法1.标本自发荧光对照标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光。2.抑制试验：可分为二步方法和一步方法⑴二步抑制方法标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。⑵一步抑制方法先

8、将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性，此法效果较二步法好，并且简便。3.阳性对照用已知阳性标本用直接法免疫荧光细胞化学染色，结果应呈阳性荧光。结果：如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。㈠间接方法1.自发荧光对照：同直接法。2.荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。3.抑制试验：同直接法。4.