第二章 各种工具酶ppt课件.ppt

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1、第二章各种工具酶内容提要第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶(聚合酶I/Taq聚合酶/反转录酶)第一节限制性核酸内切酶Restrictionendonuclease（RE）一、限制性核酸内切酶的概念二、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的类型四、影响限制性酶活性的因素五、限制性内切酶对DNA的消化一、概念1.定义是一类能够识别双链DNA中的特定核苷酸序列，并在特定位点切割双链DNA的内切酶。2.来源细菌的限制性内切酶。3.功能(1)限制Restriction侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，从而保护自身的

2、DNA不被降解。图细菌的限制系统细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。①Dam甲基化酶在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。(2)修饰Modification图细菌的修饰系统图甲基化位点：DNA上的A/C二、限制性内切酶的命名1973年Smith等提出酶的命名原则。用属名的第一个字母和种名的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示。用一个大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如

3、EcoRI。限制酶的命名图几种重要的限制酶图几种限制酶的识别位点三、限制性内切酶的分类分为I型、II型和III型。1.I型限制性内切酶1968年，首先由M.Meselson和R.Yuan在大肠杆菌B株和K株分离。如EcoB和EcoK。（1）识别序列未甲基化修饰的特异序列：EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点切点距离识别位点约400~7000bp。不在识别位点。随机切开一条单链。如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化。如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。需ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸。2.II

4、I型限制性内切酶与I型酶有甲基化功能。能在DNA链上的特异位点切割。其切割位点在识别位点以外。反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。基因工程中用途不大。如EcoP15:CAGCAG------3.II型限制性内切酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血菌中分离出HindⅡ。（1）识别序列与特点双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。识别序列长度4~8bp。多数是回文结构。IIs型除外。（2）酶切位点在识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端或平齐末端。图Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列(3)平齐末端bluntendEcoRV：产生平齐

5、末端。5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’(4)粘性末端stickyend含有几个核苷酸的单链末端。①5´端突出EcoRI：形成5’-粘性末端。5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’②3´端突出PstI：形成3’-粘性末端。5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’EcoRI：5’端凸出CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCPstI：3’端凸出③粘性末端的意义

6、连接方便不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。图粘性末端连接5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。四、同裂酶Isoschizomers识别位点的序列相同的限制性内切酶。①完全同裂酶识别序列相同和切点相同。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-

7、AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’②不完全同裂酶识别序列相同，但切点不同。五、同尾酶Isocaudamers1.定义识别序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI等为同尾酶。2.特点同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCT

8、AGA-5’BglⅡ5’-G3’-CCTAGGAT