质粒DNA的提取、酶切及检测ppt课件.ppt

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1、质粒DNA的提取、酶切及检测相关知识基因工程又称DNA重组技术外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞常用到的工具酶限制性内切酶连接酶聚合酶逆转录酶DNA酶和RNA酶结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性）独立的复制单位种类：质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）载体质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能

2、自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1~n个）松弛型复制（20个以上）实验目的和要求学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。第一部分　质粒DNA的提取碱裂解法一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。二、实验原理在EDTA存在的条件下，经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解

3、，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（pH8.0）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。含有质粒DNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。三、主要试剂溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；Tris-Cl控制溶液的pH，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，溶液II，0.2NNaO

4、H/1%SDS；NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化所导致。SDS是为下一步操作做的铺垫。溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。因为基因组DNA太长了。醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。平衡酚：氯仿（1：1）作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚

5、/氯仿始终在下层，方便水相的回收。乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA四、实验步骤接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中12000rpm、离心2s，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）3min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置3min裂解菌体加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管上

6、清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），室温2min12000rpm，离心5min沉淀用70%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心2min沉淀风干沉淀用20uLTE溶解，-200C保存第二部分质粒酶切实验目的理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具掌握酶切的基本操作实验原理制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶酶

7、切，再经过DNA连接酶连接，便可获得携带外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。限制性内切酶是能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：EcoRⅠ:G↓AATTC;HindⅢ:A↓AGCTT。G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性核酸内切酶的命名法用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，

8、即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。