细菌分离培养和保存技术ppt课件.ppt

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1、实验二细菌分离培养和保存技术苏州大学附属第二医院谢小芳1实验程序一、实验目的二、实验材料三、实验方法（一）接种与分离工具（二）接种与分离方法（三）细菌的培养方法四、实验内容2一、实验目的1、掌握细菌的分离培养和接种技术；2、掌握培养基的制备过程。31、工具：接种环、接种针、移液器、酒精灯。2、培养基：（1）血平板、巧克力平板和中国蓝平板（2）双糖、半固体、枸橼酸盐、6.5%Nacl肉汤3、菌株：大肠埃希菌、粪肠球菌。4、恒温培养箱。二、实验材料4三、实验原理为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制

2、作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。5接种与分离工具（1）接种环（2）接种针（3）涂布棒（4）无菌棉拭子（一）接种与分离工具6（二）培养基按性状可分为：固体培养基半固体培养基液体培养基培养基按用途可分为：基础培养基营养培养基选择培养基鉴别培养基厌氧培养基L型培养基7（三）接种与分离方法81．平板划线分离法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法（2

3、）连续划线分离法（二）接种与分离方法9（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。划线时接种环与平皿约成30-40度角，轻轻接触，以腕力在琼脂表面轻快滑动，不能划破琼脂。第一次划线应占平皿面积的1/5，以后每次划线约占面积的1/4—1/5。划线为连续划线，不能间断应占满平皿，划线不能交叉重复。每次划完后接种环应灭菌。（二）接种与分离方法10分区划线分离法：（1）分区划线分离法：以四区划线最常用。实验一（二）接种与分离方法（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板

4、上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。（二）接种与分离方法13（2）连续划线分离法：14思考题1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污

5、染环境和感染操作者。152.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。162、斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯菌种进行鉴定和保存菌种等。（1）普通斜面:用接种环挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。（2）高层斜面：用接种针挑取待

6、鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上底部向上划一条直线，然后由下至上曲折划线接种。17斜面划线分离法：183．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。194．液体接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造

7、成实验室污染。205．涂布接种法本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。21涂布接种法226．倾注平板法本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。