免疫沉淀(ip)常见问题分析

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1、问题可能原因解决办法高背景吸取了不溶于去污剂中的蛋白（沉淀）离心后立刻吸取上清，如果发生了重悬，则需要再次离心洗涤不完全在洗涤过程中将试管盖好盖子，倒转混匀几次保证洗涤充分后再离心非特异蛋白结合到珠子上了珠子没有被充分封闭。确定使用所有BSA(fractionV)是新鲜配制的，用1％BSA的PBS封闭新鲜准备的珠子1hr。进行IP前使用PBS洗涤3-4次所用抗体纯度不够使用亲和纯化的抗体，有限预吸附过的抗体抗体用量过多导致非特异性结合确认推荐的抗体用量，减少抗体用量细胞数过多/裂解物中蛋白含量过高导致洗脱液中含有大量非特异性蛋白减少细

2、胞/裂解物用量，推荐使用10-500ug细胞裂解物非特异性蛋白结合抗体减少上样量。也可以在进行IP前将裂解物和珠子预孵育从而达到预纯化裂解物的目的。也有人使用和抗体来源及Ig亚型相同的无关抗体对裂解物进行预纯化在免疫沉淀过程中蛋白降解了保证标本裂解时使用新鲜配制的蛋白抑制剂抗体洗脱过多靶蛋白中含有过多的洗脱抗体降低抗体用量；在进行IP前将抗体交联到珠子上；使用梯度glycine缓冲洗脱液.洗脱液中检测不到靶蛋白标本中无靶蛋白表达，或者表达量非常低根据蛋白表达资料确定检测标本中有靶蛋白的表达。如果蛋白表达水平很低，可以考虑增加裂解物的用

3、量，但这样会增加非特异性结合。因此建议在进行IP前先对裂解物进行预纯化所有抗体量不足，难以捕获靶蛋白根据推荐量使用抗体，并根据实验结果优化抗体的用量.靶蛋白没有从珠子上洗脱下来确定使用正确的洗脱液并保证洗脱液的强度和pH值是适用于靶蛋白的抗体没有和免疫吸附的珠子结合根据抗体的亚型确定所用珠子是否合适（参照IP的方法部分）所用裂解缓冲液不适合根据说明书确定该抗体检测的是变性还是天然蛋白；然后保证所用裂解液是恰当的（参照IP的方法部分）