全血分离获得血清的方法及步骤

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1、全血分离获得血清的方法及步骤材料与方法1.1血清采集MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70℃冰箱冷冻保存备用。1.2主要试剂固相pH梯度干胶条IPGstrip（Amersham公司产品，非线性pH3～10，7cm）。3-〔3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸盐｛3-

2、〔（3-cholamidopropyl）dimethylamino〕-1-propanesul-fonate，CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），三丁基膦（tributylphosphine，TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N，N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetram-ethyl-ethylenediamine，TEMED），过

3、硫酰胺（am-moniumpersulfate，APS），三羟甲基氨基甲烷〔tris（hydroxymethyl）aminomethane〕、甘氨酸（glycine，Gly）和十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。1.3主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，AmershamBiosci-ences公司产品;P-20

4、00分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-DaltonicsAutoFlexTOF-TOFLIFTMassSpectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQDecaXPPlus，美国ThermoFinnigan公司产品。1.4双向电泳1.4.1血清总蛋白质的提取及定量血清-70℃反复冻融

5、4次后，用AgilentMultipleAffinityRe-movalColumn处理去除高丰度蛋白。使用Agilent5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70℃保存。用裂解液（9mol/L尿素、4%CHAPS、65mmol/LDTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。1.4.2等电聚焦自-20℃取出的胶条，室温下平衡10min，以500μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8mol/L尿素、2%CHAPS、1%Bio-lyte和1%TBP）以及标准蛋白质分子，

6、上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30V12h，500V1h，1000V1h，8000V6h。恒温20℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base50mol/L、尿素6mol/L、甘油30%、SDS2%、溴酚蓝0.002%和DTT100mg）中于振荡器上振荡15min;然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用400mg碘乙酰胺代替100mgDTT）同样于振荡器上振荡15min。1.4.3SDS-PAGE垂直电泳采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水23.2ml，30%丙烯酰胺

7、溶液32.46ml，1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.820ml，10%SDS0.8ml，10%APS0.4ml，TEMED3.76μl，胶总体积80ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris5mmol/L，Gly192mmol/L和SDS0.1%）。初始电流为每块胶40mA，电泳20min，然后以每块胶60mA电流，直至溴酚蓝前沿。1.4.4银染色电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停

8、显及脱色，至背景清晰。1.5图像分析每个样品常规进行3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取Ratio≥1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS12.0软件，统计学分析采用t检验。1.6基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析用手术刀片切下胶上目