幽门螺杆菌培养方法及其尿素酶纯化的研究

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1、幽门螺杆菌培养方法及其尿素酶纯化的研究硕士研究生：刘建东导　　　师：周曾芬　教授单位：昆明医学院第一附属医院消化内科中文论文摘要目的：探讨大量培养幽门螺杆菌（H.pylori）的方法，从H.pylori标准菌株NCTC11639中提取与纯化尿素酶（Urease）。方法：采用单因子试验统计分析技术对H.pylori固体和液体培养技术进行优化筛选。以哥伦比亚培养基（CAB）为基础培养基进行固体培养，在复苏和传代培养中，分别观察不同添加剂（10%冻融羊血（SB）、10%绵羊血清（SBS）和0.1%β环糊精（β-CD

2、））、不同室温下空气中暴露时间（1h和3h）和不同抽气负压（-0.075Mpa、-0.070Mpa和-0.065Mpa）对H.pylori培养质量（产量和形态）的影响；以BHIB为基础培养基进行液体培养，观察四种不同添加剂（5%小牛血清（CBS）、10%CBS、10%SBS和0.1%β-CD）对H.pylori液体培养产量的影响。比较不同固、液培养体系的效费关系。用旋涡振荡和冻融法粗提尿素酶，再用QSepharoseFF阴离子交换层析、PhenylSepharoseHP疏水相互作用层析和Source30SSe

3、pharose阳离子交换层析进行纯化，测定纯化出的尿素酶的活性和纯度，计算蛋白浓度和总蛋白回收率。用SDS-PAGE和Westernblotting进行鉴定。结果：H.pylori固体培养复苏4天后，添加10%SB、10%SBS和0.1%β-CD的CAB平板每块分别可获得0.0618g、0.0576g和0.0335g菌量，传代培养3天后，每块分别可获得0.0802g、0.0922g和0.0447g菌量。无论复苏或传代，H.pylori产量在10%SB和10%SBS培养基之间均无明显统计学差异（P>0.05），

4、但均优于0.1%β-CD培养基（P<0.01）；在空气中不同暴露时间（1h和3h）和抽至不同负压（-0.075Mpa、-0.070Mpa和-0.065Mpa），H.pylori的产量均无统计学差异（P>0.05）。固体培养时，以0.1%β-CD作添加剂的平板上，更易观察到较典型的H.pylori形态。液体培养3天后，添加5%CBS、10%CBS、10%SBS和0.1%β-CD的四种液体培养基的OD650值分别为0.2532、0.3705、0.3173和0.2336，每100mlH.pylori产量分别为0.1

5、01g、0.148g、0.127g和0.093g，10%CBS与10%SBS组H.pylori产量均高于0.1%β-CD组（P<0.05），10%CBS组H.pylori产量高于5%CBS组（P<0.01），10%CBS与10%SBS之间、5%CBS和0.1%CD之间、5%CBS和10%SBS之间均无统计学差异（P>0.05）。每产1gH.pylori，10%SB、10%SBS和0.1%β-CD三种固体培养的费用分别为26.28元、24.23元和38.37元，需要的相对培养批次数分别为1.14次、1.00次、

6、2.04次；5%CBS、10%CBS、10%SBS和0.1%β-CD的四种液体培养费用分别为100.40元、89.27元、86.85元和70.11元，需要的相对培养批次数分别为1.50次、1.00次、1.15次和1.67次。最后纯化得到的尿素酶酶活性为19.7urea/mg/min，纯度在95%以上，总的蛋白回收率为2.58%，SDS-PAGE显示出尿素酶亚单位的分子量66kDa（UreB）和30kDa（UreA），Westernblotting显示其可以与兔抗H.pylori全菌血清发生反应。结论：添加10

7、%SB和10%SBS的CAB培养基可获得较高的H.pylori产量，最高可获0.092g/平板，可用于H.pylori的大量培养；采用旋涡振荡和冻融法粗提H.pylori尿素酶得率高，使用离子交换层析（阳离子和阴离子）和疏水相互作用层析的三步纯化法，可大量快速地纯化尿素酶。本研究在云南地区首次建立了H.pylori液体培养体系，这为在云南地区进行H.pylori大量培养及H.pylori相关基础与临床研究奠定了基础。关键词　幽门螺杆菌　尿素酶　培养　纯化　方法英文论文摘要CultureandUreasePur

8、ificationofHelicobacterpyloriMasterCandidate:JiandongLiuSupervisor:Prof.ZengfenZhouUnit:GastroenterologyDepartmentoftheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollegeDetailedAbstractObjectiveToexploreal