PCR原理及操作幻灯片课件.ppt

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1、PCR原理及操作主要内容一、PCR技术的基本原理二、PCR反应体系及反应条件三、PCR在HLA-SBT中的策略四、检测流程及操作注意事项五、实验结果分析变性退火延伸二、PCR反应体系及反应条件琼脂糖凝胶电泳三、PCR在HLA-SBT中的策略HLAClassI(A,BandC)SBT:HLAClassII(DRB1,DQB1)SBT:位点ABCDRDQAKBKCKDR1-1DR1-3片段大小（bp）3k2.9k3k300左右3.5k2k2k2k检测外显子2~42~42~422323232313常规HLA配

2、型位点信息PCR反应参数的设置A、B、CDRB1常规DQB196oC2min2min95oC2min95oC30sec30sec93oC15sec60oC30sec30sec60oC30sec72oC3min30sec68oC3.5min15oCferverferver15oCferver四、检测流程及操作注意事项MIX配制配制MIX前先将所需的试剂准备好，使用前振荡并离心。将移液器、枪头等实验用品按要求摆放整齐MIX的配制中酶最后加入。为防止漏加或重复加样，每加入一种试剂后，在该试剂用量数字后打勾做标

3、记。模板分装根据《PCR反应表》所编的模板位置来编排相应的PCR板。加模板前将DNA振荡离心，按照对应的DNA条码号在离心管架上排列好存放模板的离心管的顺序，并复核一遍，以确保模板顺序与《PCR反应表》一致。样品应加到反应孔底部，并注意不同样品要换枪头。加完样品后检查是否加错或漏加MIX分装反应板上所标的位点选择相应的MIX；加MIX时移液器保持垂直，加同样的MIX时可不更换枪头；若枪头尖端有较多试剂悬挂，应让枪头贴壁后更换新枪头，防止接触到模板而造成污染;分装完成后，从孔板底部观察是否有漏孔，若有漏加

4、应选用相应位点的MIX补加;胶垫方向与反应板一致，列数编号对应。电泳五、实验结果分析（1）不出现扩增条带原因：1、模板质量（含有抑制物，浓度纯度低）2、引物质量（错配，引物降解）3、人为原因（体系错配，扩增程序有误）对策：1、纯化模板或重提或加大模板用量2、更换新引物3、重做（2）出现非特异性扩增带原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶的质量差或量过高4、Mg2+浓度过高5、退火温度偏低6、循环次数过多对策：1、重新设计引物2、降低模板或引物浓度3、减少酶量，更换另一种酶4、降低Mg2+浓度

5、5、提高退火温度6、减少循环次数（3）出现片状拖带或涂抹带原因：1、模板不纯2、buffer不合适3、退火温度偏低4、酶量过多5、dNTP、Mg2+浓度偏高6、循环次数过多对策：1、纯化模板2、更换buffer3、适当提高退火温度4、适量用酶5、适当降低dNTP、Mg2+浓度6、减少循环次数PCR操作中出现的错误、原因及后果PCR操作中出现的错误、原因及后果由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而影响实验结果。实验前后都要做好清洁工作，如实验前桌面用清水酒

6、精擦拭，实验后擦次氯酸钠，照紫外，通风，垃圾处理等。注意事项注意事项检查程序上机前要检查程序是否有更改。上样要保持在同一高度上，保证受热均一以避免边缘效应。热盖应压紧以免硅胶垫不紧导致样品蒸干，但不可拧得过紧导致反应管变形。