南师大蛋清中提取溶菌酶实验.doc

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1、蛋清中提取溶菌酶南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE研究材料与实验方法1.柱层析前的准备工作实验材料：树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1MNaOH，0.1MHCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，

2、铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。1.1预处理724型阳离子交换树脂碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1NNaOH或者0.1NHCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0先配制1MNa2HPO4

3、57.7mL，1MNaH2PO442.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。1.4平衡离子交换树脂0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。2.柱层析法提取溶菌酶实验材料：起始缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：50mMNaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mMNaCl溶液150mL（溶剂：起始缓冲液）再生溶液：0.5MNaOH溶液仪器：磁力搅拌器等其他材料：新鲜鸡蛋2.1样品的预处理取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布

4、过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。2.2静态吸附和洗涤①静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取200μL上清于dorf管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。②洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取200μL洗涤液于dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。2.3动态洗脱①用少量起始缓冲液将树脂调匀，

5、重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用50mMNaCl洗脱液恒速洗脱杂质。（流速约2~3mL/min)。②洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。在洗脱峰吸光值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“4”）③收集溶菌酶：更换500mMNaCl洗脱液，同样记录，同样在吸光

6、值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“5”），不同的是，此时是溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，4度保存。2.4再生树脂、洗涤管道、绘制层析图谱用0.5MNaOH溶液（约1倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。管道系统连接好，用约100mL70%乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用LP层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶实验材料：溶液：0.5MNaOH溶液透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（p

7、H7.0）其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。3.1超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过2.0bar），收集透过液，回流液（吸取200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。3.2盐析在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL溶液中35g硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。3.3透析除盐取少量0.1M磷酸钠缓冲液（pH7

8、.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量