HPLC法测定饲料中的维生素E.doc

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1、HPLC法测定饲料中的维生素E测定参数维生素E原理HPLC适用产品含维生素E的全价饲料、补充剂和预混料检测限量1mg/kg方法来源SchneiderJ,BetzR,ChenJ.AnimalNutritionTechnicalService,BASFCorporation,Wyandotte,MI48192.实验室联系人姓名：Dr.J.Schneider公司：BASFAG仪器和试剂（及适用来源）（1）带磨口锥形瓶，500ml。（2）圆底烧瓶，500ml。（3）回流冷凝设备（带N2气进口）。（4）分液漏斗，500ml。（5）回流液设备，0-10ml和0-100ml。（6）移

2、液管。（7）容量瓶。（8）旋转蒸发器。（9）甲醇（试剂级）。（10）异丙醇（HPLC级）。（11）乙醇（紫外光纯级）。（12）50％KOH溶液（W/V）。（13）硫化钠溶液：3.6gNa2S溶于10ml水中，并用甘油稀释至100ml。（14）10％碳酸氢钠溶液（W/V）。（15）丁基羟基甲苯（BHT）。（16）石油醚：沸点40-60℃（Merck货号909）。（17）饱和氯化钠溶液。（1）无水硫酸钠。（2）dl-α-生育酚乙酸酯，USP级，作校准用。仪器设备（及适用来源）（1）ABI783型，或ABI980型，荧光检测器。（2）柱子：NovapakC18,长5m，内径8

3、mm，RCM-100Waters。（3）洗脱溶剂：100％甲醇。（4）流速：1.2ml/min。（5）波长：对紫外，290nm对荧光，激发波长290nm，发射波长325nm。（6）积分仪：Waters840数据系统。标准溶液（1）标准溶液I①准确称取100mgdl-α-生育酚乙酸酯（USP级，纯度100％）置于100ml容量瓶，用乙醇定容。②紫外对照标准溶液I：吸上标准液10ml，用乙醇稀释至50ml，用分光光度计在284nm下，以乙醇为对照测消光度。式中，E284为1cm比色杯在284nm波长处所测消光强度；E/为43。（2）标准溶液Ⅱ（操作标准）取5ml标准溶液I根

4、据操作步骤条件进行皂化，萃取液最后用甲定容100ml，含α-生育酚0.0455mg/ml（相当于α-生育酚乙酸酯0.05mg/ml）。取上液2ml和5ml，分别用甲醇定容10ml，含α-生育酚浓度为分别为0.0091mg/ml和0.0228mg/ml（相当于含α-生育酚乙酸酯浓度0.01mg/ml和0.025mg/ml）。取原来萃取液和两个稀释液各50ul重复注进色谱仪中，校正因子Ef可以从每种溶液的α-生育酚乙酸酯浓度及其峰面积计算出来。式中，C为α-生育酚乙酸酯浓度（mg/ml）；PS为峰面积。操作步骤（1）称25g样品放在500ml磨口锥形瓶中，加入100ml甲醇

5、、40ml50％KOH、5ml正己烷、2ml碳酸氢钠液，2mlNa2S液和100mgBHT混匀，烧瓶接上回流冷凝管并通入氮气情况下在90℃水浴中回流20min进行皂化，不时地振摇烧瓶中样液，皂化后在流动水冲淋下冷至室温后，加进150ml水、100ml石粙醚，盖上磨口塞，用力振摇1min，上层有机相倾倒入一个预先加有100ml饱和盐水的500ml分液漏斗，保留在烧瓶中的水相，用100ml石油醚萃取3次，上层有机相每次都倾倒在分液漏斗里，合并萃取液并略微摇动，然后静置至少10min。（2）下层盐水相仍放回烧瓶中，再加50ml石油醚用力振摇萃取2次，石油醚层仍倾倒入分液漏斗中

6、，再用70ml饱和盐水洗一次，二份70ml水洗二次，水相要小心分离并弃去。石油醚相经无水硫酸钠脱水后,转移到500ml圆底烧瓶里置60℃水浴上并在强氮气流保护下旋转浓缩近干，残留物用甲醇溶解并转移到一个50ml容量瓶（维生素E浓度小于10mg/kg时用20ml容量瓶），并用甲醇定容.α-生育酚的浓度应调节在0.005～0.05mg/ml范围。取此液50µl进样二针测定。计算样品中维生素E含量计算以dl-α－生育酚乙酸酯表示，根据α－生育酚的峰面积为（P）、样品重量（W）、萃取液的最后定容体积（V）、平均校正因子（Ef）计算而得出。维生素E（mg/kg）＝式中，P为峰面积

7、Ef为校正因子W为样品重量（g）V为最后萃取液体积（ml）维生素E要以α－生育酚表示时需乘以0.91.注意事项（1）本操作步骤可将α－生育酚与天然的β-、γ-和δ–生育酚分离，用它们的标准纯品，以同样的条件均能测定β-生育酚、γ-生育酚和δ–生育酚纯品可购自德国MerckAG，Cot，No，15496），但dl-α－生育酚出峰保留时间相同。（2）在皂化步骤中，偶尔会发生乳化现象，可将提取溶剂由石油醚换成乙醚，并且在萃取时振摇不宜过分剧烈，大多数情况下可解决这一问题。（1）建议全部避光操作，应一律使用琥珀色的防光玻璃器皿。（2）制备标准溶液