第十二讲 DNA文库的构建教学文稿.ppt

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1、第十二讲DNA文库的构建2基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库噬菌体文库黏粒文库人工染色体文库3构建基因组文库应满足的条件3.1文库的完整性要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因组文库3.2基因组信息的可重建性通过建立叠连群(contig)重建完整序列信息。3.3文库的大小即文库中应包含的独立重组子数。一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，

2、越少。4基因组文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。5基因组DNA文库构建的程序(噬菌体基因组文库的构建)⑴基因组DNA的分离制备不同来源的DNA制备方法不同。一般来说，有液相法和固相法两种。液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。大相对分子质量(

3、highmolecularweight,HMW)基因组DNA的提取方法⑵基因组DNA的片段化①酶切部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。②DNA分子的物理剪切DNA溶液的小孔喷射超声波处理高速搅拌⑶载体的制备要求：载体的去磷酸化处理载体的纯度⑷重组连接按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。⑸噬菌体离体包装⑹重组噬菌体感染大肠杆菌6基因组文库的扩增筛选⑴文库的扩增基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并形成噬菌斑以实现增殖。风

4、险：在进行文库扩增时，很难保证重组分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。⑵文库的筛选噬菌斑原位杂交PCR文库筛选基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装第二节cDNA文库构建高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。1概念cDNA文库：将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在

5、该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。2cDNA文库优点⑴cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。⑵cDNA文库的筛选比较简单易行。⑶每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。⑷可以在原核中表达。3对cDNA文库质量评价3.1文库的代表性文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。3.2重组cDNA片段的序列完整性。4cDNA文库构建的步骤⑴分

6、离mRNA；⑵富集mRNA；⑶cDNA的合成；⑷黏性末端片段与载体的连接；⑸离体包装获得重组噬菌体；⑹检测重组噬菌体效价。cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA4.1细胞总RNA的提取和mRNA的分离RNA：tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；oligo(dT):polyA杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。4.2cDNA第一链的合成①oligo(dT)引导的DN

7、A合成法利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。②随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。4.3第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一

8、步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法置换合成法引导合成法引物－衔接头合成法①自身引导合成法获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引