引物设计-例子.pptx

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1、常见生物医学软件操作1.引物设计2.graphpadgrism5数据分析3.endnoteX7插入文献4.lightcycler@96实时定量1.引物设计采用PrimerPremier5.0进行引物设计首先打开PrimerPremier5.0，输入序列从NCBI里面搜索基因序列，方法如下PCR引物设计的原则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2.引物长度一般在15~30碱基之间。3.引物GC含量在40%~60%之间，上下游引物Tm差值不大于4度。4.引物3′端要避开密码子的第3位5.引物3′端不能选择A，最好选择T。6.碱基要随机分

2、布。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应

3、当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰10.扩增产物的单链不能形成二级结构。11.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。点开红色所指图示