2015年第10讲+细胞膜的生物物理学-02.ppt

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1、MembraneBiophysics021MembraneTopology膜蛋白的拓扑学2为什么要了解膜蛋白的拓扑学？蛋白质的结构决定功能膜蛋白的功能具有跨膜方向性了解膜蛋白的功能必须了解其膜拓扑学3什么是膜蛋白拓扑学？(membraneproteintopology)1.蛋白质序列中的跨膜片断那些部位插膜2.蛋白质在膜上的取向那些部分位于细胞膜的内侧，那些部分位于细胞膜的外侧4膜蛋白拓扑取向的基本原理疏水性原则脂双层的碳氢链区是高度疏水的区域蛋白质的跨膜区域必定是高度疏水区域蛋白质一般以-螺旋形式跨膜跨膜-螺旋的长度一般

2、为20个氨基酸以20个氨基酸为单位，计算蛋白质序列的疏水性蛋白质中疏水性大的序列，即为可能的跨膜区域53.1膜蛋白拓扑取向的基本原理3.1.2正电荷氨基酸向内原则对大量已知结构的膜蛋白统计分析表明，荷正电的氨基酸倾向于位于膜的内侧此规则只适用于长度小于60个氨基酸的片断随片断长度的增加，正电荷氨基酸位于内侧的几率降低62.2.1.2化学势和溶质浓度的关系假设溶液为理想溶液混合焓变H=0混合熵变由简单统计规则给出自由能变化为另一方面所以式中为纯物质的化学势，Xi为该物质在溶液中的摩尔分数7转移自由能与溶解度的关系考虑烃类分

3、子形成的相与水相两相共存系统烃类在有机相的化学势为烃类在水相的化学势为8疏水性的定量计算Go>0，表示氨基酸难从有机相转移至水相，即疏水Go<0，表示氨基酸易从有机相转移至水相，即亲水Go用来代表氨基酸的疏水性Xi为该物质在溶液中的摩尔分数9氨基酸的疏水性疏水性氨基酸：Phe,Met,Ile,Leu,Val,Cys,Ala亲水性氨基酸：Arg,Asp,Lys,Glu,Asn,Gln,His10膜蛋白拓扑学的研究方法蛋白质疏水性分析1.以10-20个连续的氨基酸为计算单位，计算该肽段疏水指标之和（eg.1-10,2-11,

4、3-12,etc.）作为该肽段的疏水指数（hydropathyindex）2.以疏水指数对氨基酸序号作图3.具有高的疏水指数的一个20个氨基酸的肽段即为可能的跨膜螺旋片断11细菌视紫红质的结构预测实测12作业:水通道蛋白，AQP1,哪段是跨膜区域？AA:212-231？AA:120-139？13膜蛋白拓扑学的研究方法酶解法蛋白质包埋在脂双层中可抵抗水解酶的作用利用水解法可判断蛋白质暴露于膜外的部分选择水解酶的作用方式可判断蛋白的取向外侧加水解酶：蛋白向外部分发生水解内侧加水解酶：蛋白向内部分发生水解14膜蛋白拓扑学的研究方法

5、酶解法制备蛋白取向一致的膜囊泡加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶）加入酶抑制剂终止反应SDS-PAGE分析15酶解法16膜蛋白拓扑学的研究方法酶解法蛋白酶抑制剂必须有效保证有限酶解，不是完全酶解应用多种水解酶，互相印证结果阴性结果说明蛋白质没有膜外部分或膜外部分无水解酶切位点检测方法：如所研究蛋白占大部分，可直接分析如所研究蛋白占少部分，须应用抗体或其它标记方法分析17膜蛋白拓扑学的研究方法同位素标记法制备蛋白取向一致的膜囊泡125I标记SDS-PAGE放射自显影分析选择标记方式可判断蛋白的取向外侧标记：蛋白向外部分被标

6、记内侧标记：蛋白向内部分被标记18膜蛋白拓扑学的研究方法免疫学方法制备蛋白取向一致的膜囊泡加入胶体金标记的针对特定肽段的单克隆抗体电子显微镜观察分析19膜蛋白拓扑学的研究方法化学标识法极性试剂不能插膜：标记蛋白质膜外部分非极性试剂可以插膜：标记蛋白质膜内部分将化学标识物事先用放射性同位素标记，反应后用放射自显影检测20膜蛋白拓扑学的研究方法特殊部位定位法糖基化位点：位于细胞膜的外侧磷酸化位点：位于细胞质一侧通过分析蛋白质上的这些位点即可推知相应修饰位点的拓扑取向21膜蛋白拓扑学的研究方法融合蛋白法原理：特定蛋白质在特定的

7、细胞器内方有活性将待定蛋白基因与报告蛋白基因融合将融合基因在适当宿主细胞中表达测定报告蛋白的定位优点：原位细胞器定位缺点：融合蛋白可能破坏原蛋白的拓扑取向融合蛋白可能破坏原蛋白的构象及生化活性22