细胞技术第六次课

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1、第六次课细胞的复苏、细胞周期测定、真核细胞转染一、原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度

2、大，易穿透细胞。实验七细胞的复苏二、操作步骤1、准备一个37℃水浴箱（或一只茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水）。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中（预先加有10ml完全培养液），吹打均匀。4、1000rpm离心5分钟，弃去上清液。5、沉淀加适当培养基吹打均匀后，将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。流式细胞术（FlowCytometry简称FCM）是一种快速测定单个细胞物理、化学、生物特

3、性的仪器。商品仪器的测量速度约每秒1000—3000个细胞，这种技术与现代一系列高技术的发展有密切关系。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、总蛋白、RNA含量、表面抗原、染色体、膜的完整性、DNA合成速率等。已广泛用于细胞学、肿瘤学、遗传学、免疫学、血液学和若干临床的领域中，其应用的范围有不断扩大的趋势。实验七细胞周期测定什么是细胞周期？由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫细胞周期。分为4个期：G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。S期(synthesispha

4、se)，指DNA复制的时期。G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。M期又称D期(mitosisordivision)，细胞分裂开始到结束。EucaryoticCellCycleAtypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM（一）原理细胞通过用DNA结合染料进行染色，如PI。DNA图示：能够作出对细胞在细胞周期G1/G2，S和G2/M阶段的产量的评估；不能很好地提供有关

5、细胞通过细胞周期的运动信息；能够较易地进行免疫荧光结合染色。碘化丙锭（PropidiumIodide，简称PI），为核酸嵌入型染料，可嵌入双股螺旋多核苷酸结构，故DNA和RNA均可着色。PI不能穿过活细胞膜，故活细胞拒染；但能穿过死细胞膜，使之着色。（二）试剂和器材RNA酶APIC6细胞流式细胞仪（三）操作步骤1．单细胞悬液用计数器计数后，取总数约2×106个细胞，用70%冷酒精，在4℃固定1天。2．离心1500转/分，10分钟，去上清，用PBS冲洗，打散、摇匀。3．再次离心，去上清，留0.2ml左右，加入R

6、NA酶A，每个样品要求加入3000—5000单位，37℃孵育30分钟。4．将样品放入冰中，冷却后每个样品加入大约1.5ml的PI（PI浓度为50μg/ml，用PBS溶解），再次放入冰中避光染色20分钟。5．染色后的样品在4小时内上机测量，测试结果以DNA直方图表示。6．有计算机软件时，可做进一步的DNA分布分析。流式细胞仪测定细胞周期分期实验结果一、原理将外源性基因(或基因组DNA)采用分子生物学技术人工地导入细胞，观察它在细胞中的表达，研究其生物学特性和功能，这种把基因导入细胞中的技术称为基因转导(gene

7、transfer)或称基因转移，也简称为导入。是研究基因表达、结构和功能的重要研究手段。主要方法有：磷酸钙沉淀法、电击法、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒等病毒介导法等。实验八真核细胞转染脂质体(lipofectinregeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或

8、贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。二、实验材料1、宿主细胞C6（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE2000（invitrogen公司）3、96孔细胞培养板4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒三、操作步骤1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到培养板上。（接种密度是3~4×