多聚酶链式反应(PCR)技术

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1、实验八多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术一．实验目的及背景多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的

2、特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：１．ＤＮＡ模板：反应中

3、ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定

4、因素。８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。二．实验试剂及仪器１０×buffer:500mMKCl100mMTris-HCl(pH9.0)0.1%明胶1%TritonX-100MgCl22.5mM４×dNTP:1mM引物：TGGCCGAGCTG5.0uM模板：20ng/μlTaq酶：5u/μlPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统三.实验方法１．向无菌的500μlEppendorf管中依次加入以下溶液。反应物体积10×buffer2.5μl4×dNTP(1mM)2.5μlMgCl2(25mM)2.5μl无菌水10.5μlTaq酶(1U/ul)1μl引物2μl模板ＤＮＡ(20

5、ng)4μl总体积25μl2．反应体系混匀，离心3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环９4℃变性１分钟36℃退火１分钟72℃延伸２分钟经过40个循环4．７２℃延伸反应7分钟。5．取20μl反应液加4μlLoadingbuffer在6.１．５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。7.在凝胶成像系统上观察记录实验结四.结果分析１．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增产物分子量。问题与讨论：１．简述ＰＣＲ基本原理２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意哪些问题。