11-金黄色葡萄球菌pfge方案

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1、金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序编号PN-SOP-11执行日期2010年12月15日第一天1.菌悬液的制备1）在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约1-2mlCSB缓冲液。2）在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称。3）用棉棒从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于CSB中，用eppendorf分光光度计测其OD值，调整至5.5～6.5之间。注：如果样品数量多，调完OD后先存放于4℃。4）取250µl菌悬液于相应的1.5mleppendorf管中。5）加入2µl溶葡萄球菌酶（1mg/ml），用移液枪充分吹打。不需振荡摇匀。2.胶块的制

2、备1）准备10ml的1%SKG（称取0.1gSKG溶于TE，用微波炉加热至完全溶解，放在53℃～56℃水浴中）。2）取250µl预热（53℃～56℃）的SKG，与250µl菌悬液混合，用移液枪轻轻吹打5次左右至液体混匀，避免产生气泡。混合前菌悬液可在水浴里预热10秒，并摇匀。3）将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10～15分钟或置于4℃冰箱5分钟。3.细胞的裂解1）在50ml的screw-captube上做好标记。2）配制细胞裂解液（CLB），参见表1。蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。表1样本数量CLB蛋白酶K（20mg/ml）14ml30µl1040ml

3、300µl3）每个管子加入4ml蛋白酶K/CLB混合液。保证胶块在液面下而不在管壁上。4）将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。5）将纯水和TE放在54℃水浴中预热。4.洗胶块1）从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap，轻轻倒掉CLB。2）每管中加入15ml预热的纯水。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回54℃水浴摇床中，摇15分钟。3）倒掉水，加入15ml预热的TE，在54℃的水浴摇床中重复洗3次，时间分别为15分钟，15分钟，30分钟。4）倒掉TE，加入5mlTE，放在4℃冰箱保存备用。第二天5.胶块内DN

4、A的酶切1）准备30℃和37℃水浴。在1.5mleppendorf管上标记好相应样品的名称。2）按照表2，配制SmaI的稀释缓冲液，混匀。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。表2试剂（Takara）µl/胶块µl/7胶块µl/12胶块纯水160µl1120µl1920µl10×TBuffer20µl140µl240µlBSA（0.1％）20140240总体积200µl1400µl2400µl3）按照表3，配置XbaI的稀释缓冲液。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。表3试剂（Promega）µl/胶块µl/3胶块纯水178µl534µlBufferD20

5、µl60µlBSA（10mg/ml）26总体积200µl600µl4）在每个1.5mleppendorf管中加入200µl稀释缓冲液。5）用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6）用同样的方法处理标准株H9812的胶块，放入XbaI缓冲液中。7）将XbaI管子放在37℃水浴中，SmaI管子放在30℃水浴中孵育10-15分钟。8）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。表4试剂（Takara）µl/胶块µl/7胶块µl/12胶块纯水155µl1085µl1860µl10×TB

6、uffer20µl140µl240µlBSA（0.1％）20140240SmaI53560总体积200µl1400µl2400µl表5试剂（Promega）µl/胶块µl/3胶块纯水173µl519µlBufferD20µl60µlBSA（10mg/ml）26XbaI515总体积200µl600µl9）孵育完，用移液枪吸出液体，吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。10）每管加入200µl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。11）将XbaI管子放在37℃，SmaI管子放在30℃水浴中孵育3～4小时。6.制备1％胶1）称取1gSKG，溶于100ml0.5×TBE缓冲液中

7、。15孔模具需配制150ml体积的胶。2）微波炉加热约2分钟，每20妙混匀，直至完全溶解。3）放在53℃～56℃水浴，5～6分钟。7.加样1）调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2）从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。用枪头吸出酶切混合液，枪头应贴至管底，避免损伤或吸出胶块。3）每管加入200µl0.5×TBE，用枪头冲洗胶块。4）把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上，若为15个齿的梳子则放在第1、5、10、15个齿上。5）把梳子放