临床免疫学荧光免疫技术

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1、第九章　荧光免疫技术　本章考点　　1.荧光的基本知识　　2.荧光抗体技术　　3.荧光免疫测定　　荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于l941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。　　第一节　有

2、关荧光的基本知识　　　　一、荧光现象　　一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光指的是当一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻发光，停止能量供给，发光瞬间即停止的一种发光。荧光产生的原理：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光能量后，分子呈激发态而极不稳定，当其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，这种幅射现象称为发光。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光。而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引

3、起的荧光称为致荧光。由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。　　　　二、荧光物质　　（一）荧光色素　　许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：　　1.异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿

4、色荧光少于红色。　　2.四乙基罗丹明（RB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。256　　3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。　　4.藻红蛋白（R-RE）：本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色

5、荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。　　（二）其他荧光物质　　1.酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。　　2.镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+

6、螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。　　　　三、荧光技术中有关的概念和参数　　发射光谱：指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。　　激发光谱：指固定检测发射波长，在不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。　　荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率=发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度），发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与

7、激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长最接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波长在接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。　　荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。　　荧光的猝灭：指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间照射后会发生减弱的现象。这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能