细胞培养

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1、GoodMorning1第5章细胞培养2获得单细胞的方法悬浮培养单细胞培养细胞培养内容包括两方面悬浮培养单细胞培养促进细胞生长和生物合成促进细胞生长和形成完整植株3植物组织培养探索阶段（1902-1929年）Haberlandt：观点：首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞4《关于单离植物细胞培养实验》我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。1.取材问题－高度分化

2、的细胞。2.培养基问题－过于简单，没有诱导成熟细胞分裂所必须的生长激素5一、单细胞的分离由完整的植物器官分离单细胞由培养组织中分离单细胞61、由完整的植物器官分离单细胞机械法酶解法叶片是分离单细胞的最好材料71-1、机械法Ball&Joshi(1965)、Noggle(1967)、Joshi&Ball(1968)研究者和时间：研究材料：花生成熟叶片第一种方法：用刀片刮叶片8具体方法撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞9第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心10只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时

3、用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。111-2、酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心121-3、机械法和酶解法比较机械法酶解法细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。132、由培养组织分离单细胞茎段步骤：1诱导产生愈伤组织；2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；14步骤：摇床用于振荡继代悬浮3（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物

4、优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。15注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间链状互锁结构）16二、悬浮培养Suspensionculture特点细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。171、起始悬浮液的制备愈伤组织液体培养基摇床振荡悬浮培养质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养转速30

5、-150rpm2-3cm冲程防细胞破裂18192、悬浮培养的基本形式分批培养连续培养202-1、分批培养/成批培养（Batchculture）2.1.1含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。212.1.2特点培养基体积固定培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。必须适当搅拌222.1.3继代的方法和最佳时期继代方法：用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新

6、鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。23继代24最佳继代时期：了解细胞数目增长变化S形曲线后，选择对数生长期和直线生长期！252.1.4细胞生长曲线在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线26培养时间培养细胞数目12345S形曲线27细胞生长各个时期的特点：缓慢期滞后期（延迟期）细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关对数生长期细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期细胞生长和发育最明显的时期生长逐渐缓慢：培

7、养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少静止期生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。28滞后期对数生长期直线生长期缓慢期静止期培养时间培养细胞数目123451234529讨论（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。30操作注意事项：

8、对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。31观察细胞染色体在对数生长期18chromosomes322-2、连续培养（Continuousculture）加入培养基排出培养基及其培养物二者体