黑龙江哈尔滨地区部分鸟类、哺乳动物三种肠道原虫分子流行病学研究

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中图分类号学校代码１０２２４密级公开学号１４０６１０４８３硕士学位论文黑龙江哈尔滨地区部分鸟类、哺乳动物三种肠道原虫分子流行病学研究作者，＿黎巧导师李巍教授学位类别农学硕士所在学院动物医学学院一级学科兽医学二级学科预防兽医学二〇一七年六月＞？ｒ 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宂成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书＃＿用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。＆学位论文作者签名：日期：年月６日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：日期：年如乙日导师签名日期年６淨日３Ｐ＼ ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNo.140610483DissertationfortheMasterDegreeMolecularEpidemiologicInvestigationofThreeImportantEntericProtozoainBirdsandMammalsfromHarbin,HeilongjiangProvinceCandidate:LiQiaoSupervisor:Prof.LiWeiDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:CollegeofVeterinaryMedicineFirstleveldiscipline:VeterinaryMedicineSecondleveldiscipline:PreventiveVeterinaryMedicineHarbinChinaJune2017 目录目录摘要...............................................................................................................................................................I英文摘要....................................................................................................................................................III1引言..........................................................................................................................................................11.1三种肠道原虫概述.........................................................................................................................11.1.1隐孢子虫概述..........................................................................................................................11.1.2隐孢子虫基因分型工具.........................................................................................................11.1.3隐孢子虫分子流行病学.........................................................................................................21.1.4毕氏肠微孢子虫概述.............................................................................................................41.1.5毕氏肠微孢子虫基因分型工具............................................................................................41.1.6毕氏肠微孢子虫孢子虫流行病学........................................................................................51.1.7芽囊原虫概述..........................................................................................................................61.1.8芽囊原虫基因分型工具.........................................................................................................71.1.9芽囊原虫流行病学.................................................................................................................71.2研究意义和目的.............................................................................................................................82材料和方法.............................................................................................................................................92.1材料..................................................................................................................................................92.1.1粪便样本采集..........................................................................................................................92.1.2主要试剂................................................................................................................................122.1.3主要仪器设备........................................................................................................................132.2方法................................................................................................................................................132.2.1粪样DNA提取.....................................................................................................................132.2.2三种原虫虫种和基因型的鉴定..........................................................................................142.2.3毕氏肠微孢子虫多位点序列分型研究.............................................................................152.2.4PCR产物检测及测序...........................................................................................................152.2.5测序结果分析........................................................................................................................162.2.6系统进化分析........................................................................................................................163结果.......................................................................................................................................................173.1隐孢子虫........................................................................................................................................173.1.1隐孢子虫感染率...................................................................................................................173.1.2隐孢子虫虫种和基因型鉴定及系统进化分析.................................................................173.2芽囊原虫........................................................................................................................................203.2.1芽囊原虫感染率...................................................................................................................203.2.2芽囊原虫亚型鉴定及系统进化分析..................................................................................213.3毕氏肠微孢子虫...........................................................................................................................233.3.1毕氏肠微孢子虫感染率及基因型鉴定.............................................................................23I 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.2毕氏肠微孢子虫多位点序列分析......................................................................................233.4三种肠道原虫混合感染情况......................................................................................................254讨论.......................................................................................................................................................274.1隐孢子虫感染情况、基因型分布和公共卫生学重要性.......................................................274.2芽囊原虫感染情况、亚型分布和公共卫生学重要性............................................................294.3毕氏肠微孢子虫感染情况、基因型分布和公共卫生学重要性...........................................305结论.......................................................................................................................................................32致谢............................................................................................................................................................33参考文献...................................................................................................................................................34附录............................................................................................................................................................48攻读硕士学位期间发表的学术论文.....................................................................................................49II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese...................................................................................................................................IAbstractinEnglish.................................................................................................................................III1Introduction............................................................................................................................................11.1Introductionforthreeprotozoans...................................................................................................11.1.1BriefintroductionforCryptosporidiumspp..........................................................................11.1.2GenotypingtoolsforCryptosporidiumspp...........................................................................11.1.3MolecularepidemiologyofCryptosporidiumspp................................................................21.1.4BriefintroductionforE.bieneusi...........................................................................................41.1.5GenotypingtoolsforE.bieneusi.............................................................................................41.1.6MolecularepidemiologyofE.bieneusi..................................................................................51.1.7BriefintroductionforBlastocystisspp...................................................................................61.1.8GenotypingtoolsforBlastocystisspp....................................................................................71.1.9MolecularepidemiologyofE.bieneusi..................................................................................71.2Purposeandsignificanceofthisresearch......................................................................................82Materialsandmethods.........................................................................................................................92.1Materials............................................................................................................................................92.1.1Preparationforspecimens........................................................................................................92.1.2Mainreagents..........................................................................................................................122.1.3Instrumentsandequipments..................................................................................................132.2Methods...........................................................................................................................................132.2.1DNAextraction.......................................................................................................................132.2.2Detectionofthreeprotozoans...............................................................................................142.2.3MultilocussequencetypingofE.bieneusi..........................................................................152.2.4SequencingpositivePCRproducts.......................................................................................152.2.5Sequenceanalysis...................................................................................................................162.2.6Phylogeneticanalysis.............................................................................................................163Results....................................................................................................................................................173.1Cryptosporidiumspp......................................................................................................................173.1.1PrevalenceofCryptosporidiumspp.....................................................................................173.1.2GenotypedistributionandphylogeneticanalysisofCryptosporidiumspp......................173.2Blastocystisspp..............................................................................................................................203.2.1PrevalenceofBlastocystisspp..............................................................................................203.2.2GenotypedistributionandphylogeneticanalysisofBlastocystisspp..............................213.3E.bieneusi.......................................................................................................................................233.3.1PrevalenceofandgenotypedistributionofE.bieneusi.....................................................23III 东北农业大学农学硕士学位论文3.3.2Phylogeneticanalysisofmicrosatelliteandminisatellitemarkers........................................233.4Prevalenceofthreeintestinalprotozoainfecalspecimens.......................................................254Discussion..............................................................................................................................................274.1Prevalence,genotypedistribution,andpublichhealthconcernsofCryptosporidiumspp.....274.2Prevalence,genotypedistribution,andpublichhealthconcernsofBlastocystisspp.............294.3Prevalence,genotypedistribution,andpublichhealthconcernsofE.bieneusi......................305Conclusion.............................................................................................................................................32Acknowledgement...................................................................................................................................33References................................................................................................................................................34Appendix...................................................................................................................................................48PaperspublishedintheperiodofPh.M.education........................................................................49IV 摘要摘要隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）、芽囊原虫（Blastocystisspp.）和毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）是能感染人、多种鸟类和哺乳类动物的重要人兽共患肠道寄生虫。这三种肠道寄生虫感染呈世界性分布，均能引起宿主不同程度的腹泻，能使免疫抑制宿主发生严重腹泻甚至死亡。因此这三种肠道原虫对公共卫生、畜牧业经济发展造成了严重的威胁。目前在中国东北地区关于这三种肠道原虫的流行病学研究主要针对人群和家畜，而忽视了与人类休闲生活密切相关的宠物市场和动物园。这些地方动物数量大、种类多、人员流动量大且人类与动物直接接触机会多，大大增加了人兽共患寄生虫病传播的机率。本研究以哈尔滨地区宠物市场和动物园中鸟类和哺乳类动物为调查对象，对这三种肠道原虫的流行情况、虫种和基因型分布进行研究。本研究采用巢氏PCR针对隐孢子虫和芽囊原虫小亚基核糖体RNA（ribosomalsmallsubunit，SSUrRNA）基因内部多态区、毕氏肠微孢子核糖体内部转录间隔区（ribosomalinternaltranscribedspacer，ITS）进行扩增，并进行测序分析。在74个品种，共357份鸟类和哺乳类动物粪便样本中共鉴定出24个隐孢子虫阳性，阳性率为6.7%（24/357），共鉴定出8个虫种或基因型，分别为贝氏隐孢子虫（C.baileyi，10/24）、火鸡隐孢子虫（C.meleagridis，3/24）、泛在隐孢子虫（C.ubiquitum，2/24）、鼠隐孢子虫（C.muris，2/24）、鸡隐孢子虫（C.galli，1/24）、隐孢子虫鸟基因型V（CryptosporidiumaviangenotypeV，2/24）、隐孢子虫雪貂基因型（Cryptosporidiumferretgenotype，3/24）和隐孢子虫鼠基因型I（CryptosporidiumratgenotypeI，1/24）。发现三个具有人兽共患潜力的虫种：火鸡隐孢子虫、泛在隐孢子虫和鼠隐孢子虫。这三个隐孢子虫虫种已在多个国家和地区的人、鸟类、哺乳类动物和水样中均有报道，具有重要的公共卫生学意义。本研究在357个粪便样本中共鉴定出28个芽囊原虫阳性，阳性率为7.8%（28/357）。28个芽囊原虫阳性中22个阳性鉴定为亚型ST1、ST2和ST17。基于SSUrRNA基因序列对亚确定亚型的分离株进行亚型分型，显示其与亚型ST5和ST7亲缘关系最近，亚型ST1、ST2、ST5和ST7均有人兽共患潜力。在357份样本中仅在一份猕猴粪便样本中鉴定出毕氏肠微孢子虫阳性，阳性率为0.3%（1/357），为已知基因型D。据先前依据ITS位点的进化分析表明，基因型D分布在具有人兽共患潜力的进化组Group1中。对本研究还对鉴定出的8个隐孢子虫虫种和基因型以及毕氏肠微孢子虫基因型D在世界范围内的宿主范围进行了总结归纳。确定本研究首次在金丝雀、虎皮鹦鹉、乌骨鸡和画眉鸟粪便中鉴定出C.baileyi；首次在费氏情侣鹦鹉和牡丹鹦鹉粪便中鉴定出CryptosporidiumaviangenotypeV；首次在鹩哥和刺猬粪样中鉴定出C.ubiquitum，首次在虎皮鹦鹉粪便中鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype；首次在蓝喉金刚鹦鹉粪便中鉴定出C.muris及首次在火鸡粪便中鉴定出CryptosporidiumratgenotypeI，结果扩大了隐孢子虫的宿主范围。另外，本研究在八哥、鹩哥、原鸽、虎皮鹦鹉、刺猬和毛丝鼠中首次鉴定出芽囊原虫亚型ST17。本研究鉴定出具有人兽共患潜力的隐孢子虫虫种：火鸡隐孢子虫、鼠隐孢子虫和泛在隐孢子虫；芽囊原虫亚型ST1和ST2；毕氏肠微孢子虫基因型D。本研究鉴定出的具有人兽共I 东北农业大学农学硕士学位论文患潜力的虫种、基因型和亚型都具有广泛的宿主范围，在世界范围内的多个国家和地区的人、水、鸟类和哺乳类动物中均有报道，说明宠物市场和动物园中的动物可能是人、鸟类和哺乳类动物隐孢子虫病、芽囊原虫病和毕氏肠微孢子虫病的贮存宿主或潜在感染来源。本项研究涉及的宠物市场和动物园中的动物种类较多且人与动物之间直接接触机会较多，若不加强宠物市场和动物园管理力度和提高人们对人兽共患肠道寄生虫病的重视，可能会增加这三种机会性肠道原虫病在人与动物之间的传播机率。本研究为人和动物隐孢子虫病、芽囊原虫病和毕氏肠微孢子虫病的预防和控制提供了科学依据。关键词：隐孢子虫；芽囊原虫；毕氏肠微孢子虫；鸟类动物；哺乳动物；分子流行病学II AbstractMolecularEpidemiologicInvestigationofThreeImportantEntericProtozoainBirdsandMammalsfromHarbin,HeilongjiangProvinceAbstractCryptosporidiumspp.,Blastocystisspp.,andEnterocytozoonbieneusiareimportantzoonoticintestinalparasiteswhichcaninfecthuman,birds,andmammals.Thesethreekindsofentericprotozoacanbethecausativeagentsofseverediarrhea.Theycanevenleadtothedeathofhost(especiallytheimmunosuppressiveindividuals),whichposesaseriousthreattothepublichealthandeconomicdevelopmentofanimalhusbandry.Atpresent,epidemiologicalinvestigationonthosethreekindsofintestinalprotozoainnortheastofChinamainlyfocusedonhumansandlivestockwhicharecloselyrelatedtopublichealthandeconomy.However,similarstudieshaverarelybeenconductedontheanaimalslivinginpetmarketsandzoos.ThisstudywasconductedtoinvestigatetheprevalenceandgenetictraitsofthethreeimportantparasitesinbirdsandmammalsfrompetmarketsandzoosinHarbin.NestedPCRwasemployedtoamplifythepolymorphicregionofSSUrRNAforCryptosporidiumspp.andBlastocystisspp.andtheITSregionofEnterocytozoonbieneusi,followedbysequenceanalysis.Among357fecalspecimens,24specimens(6.7%)werepositiveforCryptosporidiumspp..EightCryptosporidiumspecies/genotypeweredeterminedin20of24PCR-positivespecimens.C.baileyi(10/24)arethepredominantspecies,followedbyC.meleagridis(3/24),C.ubiquitum(2/24),C.muris(2/24),C.galli(1/24),CryptosporidiumaviangenotypeV(2/24),Cryptosporidiumferretgenotype(3/24),andCryptosporidiumratgenotypeI(1/24).C.meleagridis,C.ubiquitum,andC.murisarezoonoticspecieswhichhavebeenreportedinhumans,watersystems,andavarietyofbirdsandmammalsaroundtheworld,includingChina.Thus,theyareofpublichealthimplications.Inthisstudy,twenty-eightBlastocystisspp.wereidentifiedin357fecalspecimens(7.8%).DNAsequenceanalysisoftheSSUrRNAgeneindentified3knownsubtypes(ST1,ST2,ST17)from22PCR-positivespecimens.SubsequentphylogeneticanalysisindicatedthattheisolatesofundeterminedsubtypetypesweregeneticallyrelatedtoST5andST7.Inthisstudy,E.bieneusiwasidentifiedonlyinaRhesusmacaque.SequenceanalysisoftheITSsequencerevealsitbelongstogenotypeD.ThisgenotypewasthememberofGroup1,thushaszoonoticimportance.ThisisthefirststudyrevealingthepresenceofC.baileyiinatlanticcanary,budgerigarandsilkyfowl,C.ubiquituminincommonhillmynaandhedgehog,C.murisinblue-throatedMacaw,CryptosporidiumaviangenotypeVinfischer'sLovebirdandrosy-facedlovebird,CryptosporidiumIII 东北农业大学农学硕士学位论文ferretgenotypeinbudgerigarandCryptosporidiumratgenotypeIinturkey.TheresultexpandshostrangeofCryptosporidiumspp..Inaddition,thisisthefirststudyidentifyingST17ingundi,CrestedMyna,CommonHillMyna,Rockdove,Budgerigar,Hedgehog,andChinchilla.Inconclusion,thisstudydeterminedzoonoticCryptosporidiumspeciesincludingC.ubiquitum,C.muris,andC.meleagridis,BlastocystissubtypesST1andST2,andE.bieneusigenotypeDinanimalsinpetmarketsandzoos.Theseidentifiedspecies,genotypes,andsubtypesallhaveabroadhostandgeographicrange,whichhadbeenfrequentlyreportedinhumans,watersystems,birds,andmammalsworldwide.Itisthusinferredthatbirdsandmammalsinpetmarketsandanimalzooscouldserveasthepotentialreservoirsandsourcesofhumancryptosporidiosis,blastocystis,andmicrosporidiosisinChina.Thus,effortsshouldbemadetoreducecontactbetweensusceptiblehumanpopulationsandanimalsinpetmarketsandzoos.Thesefindingsofthisstudymightprovidenewinsightsintothecontrolandpreventionofhumancryptosporidiosis,blastocystis,andmicrosporidiosis.Keywords:Cryptosporidiumspp.;Blastocystisspp;Enterocytozoonbieneusi;Birds;Mammals;EpidemiologyCandidate:LiQiaoSpeciality:PreventiveVeterinaryMedicineSupervisor:Prof.LiWeiIV 引言1引言1.1三种肠道原虫概述隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）、芽囊原虫（Blastocystisspp.）和毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）是三种常见的胃肠道原虫[1-3]。呈世界性分布，能通过粪口途径直接感染人和多种动物，也能通过被污染的食物和水传播。其导致的疾病分别称为隐孢子虫病（cryptosporidiosis）、芽囊原虫病（blastocystosis）和毕氏肠微孢子虫病（microsporidiosis）。免疫功能正常宿主无明显的临床症状或者出现自限性腹泻，但免疫功能低下或缺陷的宿主，则会出现严重的慢性腹泻和营养不良症状，严重情况下甚至出现死亡。1.1.1隐孢子虫概述隐孢子虫生活史简单，为单宿主寄生虫，是一种重要的引起人和动物腹泻的机会性致病原虫。能寄生于鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及哺乳类动物[4-7]。隐孢子虫卵囊被食入消化道后，在消化液作用下子孢子脱囊进入肠道，无性生殖发育为感染性阶段的滋养体，其主要寄生于宿主肠道上皮细胞。不同免疫能力的隐孢子虫病者表现出不同临床症状，婴幼儿和免疫力低下者多表现为自限性腹泻，有时也表现为慢性间隙性腹泻。艾滋病患者感染隐孢子虫多表现为慢性非自限性腹泻、脱水及严重营养不良，大大增加了艾滋病患者的死亡率[8]。1.1.2隐孢子虫基因分型工具目前不同类型的分子诊断工具已用于区别一些隐孢子虫虫种、基因型和亚型。已确定的隐孢子虫种共有27种，但是2016年，NikolaHolubová认为在生物信息学上，隐孢子虫鸟基因型V（CryptosporidiumavianV）和已知的其它隐孢子虫种存在差别，因此提议将CryptosporidiumavianV更名为Cryptosporidiumavium[9]。基于小亚单位核糖体RNA（smallsubunitribosomalRNA，SSUrRNA）基因序列多态性的基因分型工具已经广泛用于来自人、动物和水中隐孢子虫的基因分型。SSUrRNA基因由于其基因序列多拷贝性、具有半保守区和高变区的特性、便于设计属特异性引物，常被用于隐孢子虫的基因分型[8]。其中常用的技术方法有：一、运用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-RFLP）技术通过扩增SSUrRNA约830bp的目的片段和利用SspI和VspI限制性内切酶进行基因分型[10,11]；二、应用巢氏PCR（nestedPCR）实验技术对提取的DNA进行扩增[12,13]；三、用实时荧光定量PCR（quantitativeReal-timePCR，简称qPCR）技术，通过对荧光探针和熔解曲线分析对隐孢子虫进行分型[14-20]；四、FISH技术通过荧光标记的寡核苷酸探针来检测隐孢子虫卵囊；五、多重PCR（multiplexPCR）。除了SSUrRNA基因序列外，还有一些结构基因、持家基因、抗原基因等基因也用于隐孢子虫的基因分型，比如相关粘附蛋白TRAP-C1和TRAP-C2基因、热休克蛋白（HSP70、HSP90）基因、隐孢子虫卵囊壁蛋白（COWP）基因、DHFR基因、actin基因、β微管蛋白基因、乙酰辅酶A合成酶1 东北农业大学农学硕士学位论文基因、Cpn60基因、AOX基因、PNO基因、ITS-1和ITS-2基因、Poly-T等。近几年，基于其它基因的分子诊断工具，例如基于卵囊壁蛋白基因，用于隐孢子虫的基因分型已减少许多，甚至有的已经几乎不用。基于这些基因的PCR分型工具一般仅用于扩增微小隐孢子虫、人隐孢子虫、火鸡隐孢子虫等与微小隐孢子虫关系密切的隐孢子虫虫种或基因型。运用这些基因分型工具研究人、动物、环境中隐孢子虫虫种和基因型时，隐孢子虫种的多样性要更低一些。并且，在有些情况下，利用卵囊壁蛋白基因分型工具时，除了会在普遍感染C.parvum的动物宿主中，也会在一些意想不到的动物宿主中发现C.parvum。基于COWP基因的分型工具由于特异性较差，越来越少地用于隐孢子虫的基因分型研究[21-28]。隐孢子虫亚型分型工具广泛地用于C.hominis、C.parvum以及火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）和泛在隐孢子虫（C.ubiquitum）传播机制研究[8,29]。分型工具依据的基因主要有：微卫星gp60、小卫星HSP70、ML1、ML2、CP47、MSC6-5等。其中最流行的亚型分型工具是基于60-kDa糖蛋白（gp60）基因，也被称为gp40/15基因[8]。gp60基因序列在5，端具有编码丝氨酸的三核苷酸（TCA、TCG、TCT）串联重复序列，再加上其非重复区域的序列差异对亚型进行分型[8]。但是基于gp60的亚型分型也存在缺陷，不能用于C.ubiquitum、猫隐孢子虫（C.felis）、犬隐孢子虫（C.canis）等一些与C.parvum和C.hominis系统进化关系相差较大的虫种[29,30]。后来，又建立了MLT和MLST亚型分型工具，主要是用于隐孢子虫群体遗传学结构分析，从而对其群体遗传结构进行评价[31]。分子工具的应用提高了隐孢子虫鉴定的敏感性，也已经越来越多地用于研究隐孢子虫在人和动物中的传播途径、传播动态以及对传染源的追踪。分子流行病学的研究让我们更能重视隐孢子虫虫种或基因型在不同动物中的公共卫生意义，并且提高了对人们对具有人兽共患潜力隐孢子虫或虫种的认识。让我们对隐孢子虫在人和动物中的流行病学有了更为深入的了解。1.1.3隐孢子虫分子流行病学1.1.3.1人目前，据报道约有20种隐孢子虫种/基因型能够感染人，包括C.hominis、C.parvum、C.ubiquitum、C.meleagridis、C.felis、C.canis、C.viatorum、鼠隐孢子虫（C.muris）、安氏隐孢子虫（C.andersoni）、猪隐孢子虫（C.suis）、袋鼠隐孢子虫（C.fayeri）、牛隐孢子虫（C.bovis）、C.scrofarum、C.erinacei、泰泽隐孢子虫（C.tyzzeri）、兔隐孢子虫（C.cuniculus）、隐孢子虫马基因型（Cryptosporidiumhorsegenotype）、和隐孢子虫花栗鼠基因型I（CryptosporidiumchipmunkgenotypeI）、隐孢子虫臭鼬基因型（Cryptosporidiumskunkgenotype）[8,32-35]。其中C.parvum和C.hominis最常见，尤其是在工业化国家。在大多数国家的隐孢子虫流行病学调查研究中，超过90%的人隐孢子虫病例都是由C.hominis和C.parvum感染引起，但是，在有些地区C.meleagridis和C.parvum在人中的感染率一样高，例如：秘鲁利马、泰国曼谷的研究中，C.meleagridis在人中的感染率与C.parvum感染率都在10%-20%。研究报道显示C.meleagridis、C.felis、C.canis、C.cuniculus、C.ubiquitum和C.viatorum在人中的感染率低于C.hominis和C.parvum，其余的虫种/基因型只是偶尔在人中有报道。2 引言1987年，在中国南京首次在人发现隐孢子虫[36]。现在湖北、上海、安微、江苏、黑龙江山东等省市也都报道了人感染隐孢子虫病例[37-40]。戎等对黔南地区人粪便样本进行隐孢子虫镜检，阳性率为2.11%（41/1946）。其中城镇居民阳性率为0.29%，农村居民阳性率为2.5%，显著高于城镇居民；儿童隐孢子虫感染率（5.55%）显著高于成年人（0.95%）[41,42]。同样，王等对安徽地区隐孢子虫感染情况进行了调查，平均感染率2.5%，但是发现隐孢子虫感染者大多数为儿童、有腹泻症状者和免疫功能低下者，并且农村感染率高于城市[43]。一项对哈尔滨及周边地区腹泻婴幼儿隐孢子虫感染情况进行调查，结果同样是农村患儿感染率（2.68%）高于城镇患儿（0.39%）[44]。这些数据表明隐孢子虫的感染可能与生活条件和环境、安全卫生意识、身体免疫能力等因素密切相关。1.1.3.2鸟类Tyzzer于1929年首次在鸡法氏囊中检测到隐孢子虫。Slavin于1955年首次在鸟类动物火鸡中发现隐孢子虫，并命名为C.meleagridis[45]。1986年，Current等人对家鸡感染的隐孢子虫进行了生活周期描述，并把该隐孢子虫命名为贝氏隐孢子虫（C.baileyi）[45]，鸡隐孢子虫（C.galli），作为感染鸟类的三类有效隐孢子虫之一，由Pavlásek于1999年首次在鸡前胃中发现。隐孢子虫作为一种重要的能感染鸟类动物的原虫，能导致大量鸟类出现消化道和呼吸道病症。隐孢子虫感染在多种鸟类中都有报道[46]。隐孢子虫中C.meleagridis、C.baileyi、C.galli、鸟基因型I-V（aviangenotypesI-V）、鹅基因型I-V（goosegenotypesI-V）、黑鸭基因型（blackduckgenotype）、鹅基因型I-V（goosegenotypesI-V）和eurasianwoodcockgenotype常在鸟类动物中报道，除此外，C.hominis、C.parvum、C.serpentis、C.muris、C.andersoni和muskratgenotypeI感染鸟类的病例也偶尔有报道[46]，可能是因为偶然摄入带有这些虫种或基因型的卵囊[47]。但最常见的鸟类隐孢子虫虫种只有C.meleagridis、C.baileyi、和C.galli。这三种虫种在宿主体中寄生的部位不同，C.meleagridis和C.baileyi大多寄生在小肠、大肠和法氏囊中，但卵囊在大小上有很大的差异，且C.baileyi也在呼吸道组织（结膜、鼻窦、气管）有发现[46]。C.baileyi目前为感染鸟类最常见的虫种，已在几十多种鸟类中有发现[48,49]。C.meleagridis能感染人和哺乳动物，具有人兽共患潜力，与C.parvum和C.hominis在系统发育上亲缘关系较近[8,35,50]。C.galli只在腺胃中寄生[46]。C.galli首次在母鸡中分离发现，现在也能感染几十种不同的鸟类宿主。鸟类动物自然感染隐孢子虫主要会出现三种形式的病症：呼吸系统疾病、胃肠炎和肾脏疾病症状。但是在隐孢子虫病爆发时，通常只会出现胃肠炎一种形式的疾病症状。至今没有药物能治愈隐孢子虫病，因此只能依靠预防来控制隐孢子虫病。在中国，目前共有约19种不同的鸟类感染6种隐孢子虫虫种和基因型（C.meleagridis、C.baileyi、C.galli、aviangenotypesIII、aviangenotypesV和C.muris），最早是由汪等人在北京鸭中发现隐孢子虫[51]。目前，约有10个省份进行过家禽隐孢子虫的调查研究，只有少部分研究采用分子手段对粪便样本中的隐孢子虫进行检测和分型，而不是通过传统的形态学观察来确定感染率，2011年，对河南郑州地区农场和动物园的多种动物隐孢子感染情况进行调查，在鸡、北京鸭、八哥、鹦鹉、鸵鸟等多种鸟类粪便中检测到C.baileyi，感染率为3.5%3 东北农业大学农学硕士学位论文（16/452）[52]。2014年，河南郑州一鸵鸟厂303份粪便样本中，31份（10.2%）为隐孢子虫阳性，包括C.baileyi和C.muris两种虫种[53]。2014年，在浙江部分地区385份肉鸡粪样中，38份样本为隐孢子虫阳性，阳性率为10%，包括C.baileyi、C.meleagridis和aviangenotypeII三种虫种和基因型[54]。2015年，对北方311份鹦鹉血液样本，应用ELASA方法检出10份隐孢子虫阳性，阳性率为3.22%（10/311）且基因型均为aviangenotypeV[55]。1.1.3.3哺乳类及其它动物哺乳动物作为能感染隐孢子虫最大的一类群体，可能是因为更多的调查研究在哺乳动物中进行。在哺乳动物中常鉴定出的隐孢子虫有C.hominis、C.parvum、C.muris、C.andersoni、C.suis、C.canis、C.ubiquitum、C.bovis、C.felis、C.wrairi和C.fayeri。分子研究表明C.muris能够感染多种哺乳类动物，北美灰松鼠、金仓鼠、双驼峰、西伯利亚金花鼠、大林姬鼠、东非鼢鼠、蹄兔、斑纹海豹、猕猴、猪和猫等都是易感宿主[49]。在中国，河南郑州已有宠物仓鼠、西伯利亚金花鼠感染C.muris的报道[56-58]，这增加人感染C.muris的机率。C.andersoni主要感染牛等动物，在中国羚羊、双峰驼、牛、绵羊、山羊、耗牛和人中都有报道，其卵囊形态学上与C.muris卵囊相似但略小[49]。虽然有C.andersoni感染人的病例有报道，但是由于数据缺乏，其人兽共患潜力仍无法确定。C.suis主要感染猪，现已在陕西、河南、重庆、江苏、上海、黑龙江等地都有C.suis感染猪的报道[59-62]。C.canis主要感染犬，也可感染人，在上海一名儿童粪样和青岛一水样中均检测出C.canis[63,64]。在本研究黑龙江地区，一项对伴侣动物和另一项对特种经济动物狐狸、貉子和貂隐孢子虫流行病学研究中，在伴侣动物犬、特种经济动物狐狸、貉子和貂粪便样本中检测均鉴定出C.canis[65,66]。综上表明C.canis具有重要的公共卫生学意义。C.ubiquitum在多个国家的人和水样中均有发现，除人和环境水样外，主要感染牛、羊、鼠、鹿等动物[67]，在中国羱羊、犬、山羊、毛丝鼠、绵羊、藏绵羊、梅花鹿、牦牛及废水样中都有发现的报道[68-71]。在宠物动物中，已在黑龙江宠物犬、河南郑州毛丝鼠粪便样本中鉴定出C.ubiquitum[72,73]。结果说明C.ubiquitum具有重要的公共卫生学意义，我们应给予足够重视。主要感染猫，也可感染人。在黑龙江宠物猫[72]；河南、上海儿童有感染C.felis的报道[74]。偶尔有一些哺乳动物感染C.felis的报道，具有一定的宿主特异性。1.1.4毕氏肠微孢子虫概述微孢子虫是一类专性寄生于细胞内的机会性肠道原虫[2]。目前微孢子虫目包括有近1200种已命名微孢子虫，其中属于8个属的14种微孢子虫能够感染人[2]。其中毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）是在人中感染率最高的一个重要虫种。1985年，首次在海地一名艾滋病患者中诊断出，随后在家养和野生动物中陆续有发现[75]。E.bieneusi引起的毕氏肠微孢子虫病，临床上表现为胃肠道症状。对免疫力低下的群体主要导致脱水性腹泻，严重时会导致死亡[76,77]。虽然E.bieneusi被认为是一个单独的虫种，但不能在孢子形态上与其它微孢子虫区分开来，试管培养的方法也没有建立起来。因此基因型的确定只能依靠分子方法[76]。1.1.5毕氏肠微孢子虫基因分型工具4 引言由于E.bieneusi核糖体RNA（rRNA）的内转录间隔区（Internaltranscribedspacer，ITS）基因序列具有高度的多样性，因而被广泛地用于E.bieneusi的鉴定以及基因型分型。目前应用ITS分型工具鉴定出的E.bieneusi基因型已有超过200多种，根据系统进化分析形成8个遗传特征不同的分组（Group1-8）[72,76,78-80]。其中Group1又被称作人兽共患组，包括能够感染人的所有基因型以及能够同时感染人和其它动物的基因型[72]。剩下的Group2-8中基因型主要发现于一些其它特异性宿主或水源中[81]。由于基于ITS基因序列进行的毕氏肠微孢子虫基因型存在地域性差异，因此为深入了解毕氏肠微孢子虫增加了困难，比如各种基因型在人与动物或动物与动物之间的传播机制、传染源分布、传播途径、传播动态等。Feng[82]等人成功建立了基于微卫星MS1、MS3、MS7和小卫星MS4位点的MLST分型工具。且多位点分型工具（MLST）在毕氏肠微孢子虫遗传多样性研究以及群体遗传结构研究中占有绝对重要地位。许多研究发现基于ITS基因序列确定的基因型经系统进化分析不具有人兽共患潜力，但进一步进行MLST亚型分型和系统进化分析后发现该基因型处于具有人兽共患潜力的分支中，因此基因亚型分型工具的利用能够帮助我们分析新发现基因型的人兽共患潜力，对保障公共卫生安全具有重要意义。1.1.6毕氏肠微孢子虫流行病学1.1.6.1人E.bieneusi被认为是引起艾滋病患者慢性腹泻的重要病原之一。根据目前流行病学研究可以得出：免疫缺陷者，尤其是艾滋病阳性患者、CD4细胞和T细胞数量低病症者以及婴幼儿相比于健康人感染毕氏肠微孢子虫孢子虫的机率要更高。目前已有超过98个毕氏肠微孢子虫基因型在人中报道过，其中约60个基因型只在人中报道过，30多种基因型在人和动物中均有报道[76-78,83]。对泰国一孤儿院中290名儿童进行的毕氏肠微孢子虫流行病学调查显示：在12-23月龄儿童中感染率为8.89%，要高于24-35月龄的儿童，其感染率为5.3%[84]。对北美、欧洲、澳大利亚等发达国家的艾滋病患者E.bieneusi感染率的调查研究显示，E.bieneusi阳性率在2%-78%。在埃塞俄比亚的一项研究中，在214份HIV阳性伴有腹泻患者和29份HIV阴性但有腹泻症状的患者中，只在HIV阳性患者中检测到E.bieneusi[85]。另外，葡萄牙一项对有胃肠疾病的561位HIV阳性和295位阴性患者长达十年的研究也表明，免疫抑制是易感E.bieneusi的重要因素[86]。由于检测方法、地理位置、病人年龄、性别、社会地位、身体免疫能力等因素的影响，E.bieneusi在不同的调查研究中阳性率差异较大。在Group1-8中，人主要感染Group1基因型（基因型D、EbpC、typeI等），但也有少数其它基因型（基因型BEB4、I、J、Nig3-Nig5等）感染人的报道。在中国河南、上海、长春、哈尔滨进行的人毕氏肠微孢子虫流行病学调查中均发现了人兽共患的基因型，如基因型D、BEB6、EbpC、CS-4等[87-89]。1.1.6.2鸟类鸟源E.bieneusi首次在德国家禽屠宰场的鸡中发现，为基因型J[90]。随后，E.bieneusi分别在巴西、爱尔兰、荷兰、葡萄牙、波兰和西班牙的鸽子中有发现，感染率分别为7.8%（7/90）、5 东北农业大学农学硕士学位论文8.8%（13/147）、5.4%（18/331）、43.2%（19/44）、1.4%（2/139）、9.7%（12/124）[91-96]。在阿联酋捕捉的鹰粪便中鉴定出基因型D[97]，在葡萄牙和巴西的宠物鸟（鹦形目和雀形目）和鸽子中，检测到基因型Peru6和EbpA[93,95]。同样，在捷克的宠物中也发现了EbpA[98]。2014年，在吉林松原和黑龙江鸡西鸡中检测到E.bieneusi，基因型分别为Henan-IV和CC-1[99]。2016年在中国，首次在水禽（鹤）和家禽（鸭和鹅）中发现E.bieneusi（基因型Peru6、D、EbpA、BEB6和CHN-B1-CHN-B3）[83,99]。值得注意的是Peru6、D、EbpA和BEB6都属于具有人兽共患潜力的Group1。所以鸟类动物对于E.bieneusi在人和动物间的传播也有一定的影响。1.1.6.3哺乳类及其它动物在中国河北、秦岭、山西、河南、湖南、四川、广西等城市非人类灵长类动物中，鉴定出人兽共患毕氏肠微孢子虫基因型BEB4、BEB6、CS-4、EbpA、EbpC、EbpD、O、Henan-Ⅴ、Peru8和Peru11[100-103]。牛羊作为最常见的反刍动物，主要感染Group2中的基因型BEB4、BEB6、I、J等。中国青海的耗牛，新疆、吉林、河南、湖南和山东的牛，黑龙江绵羊等均鉴定出人兽共患基因型，如基因型CHN11、CHN12、BEB4、I和J等[104-107]。作为与人类接触最为密切的犬猫等伴侣动物动物主要感染基因型D、I、BEB6、CC1及CC4等[72,87,108]。在吉林兔中也发现了人兽共患毕氏肠微孢子虫基因型D[109]。猪作为重要的经济动物能感染超过40多种基因型，其中包括大多数人兽共患基因型，包括基因型D、EbpA、EbpC、Henan-I、H、Henan-III、Henan-IV等[110,111]。一小部分对野生动物E.bieneusi的研究发现其易感基因型主要是基因型D、EbpC、WL15、WL7、WL9、WL12等。也是具有人兽共患潜力的基因型[76,112,113]。1.1.7芽囊原虫概述芽囊原虫是一种常见的肠道单细胞寄生性原虫。但是在100年之前，与其它已知的肠道原虫（比如隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫）相比，芽囊原虫由于临床症状不明显并未受到重视。直到几十年之后，由于研究殖民和发展状况之间的关系，才广泛地对芽囊原虫进行流行病学研究。尽管如此，芽囊原虫致病潜力仍然处于争议中：1、感染芽囊原虫后没有临床症状的现象很普遍；2、能证明芽囊原虫具有致病性的实验中，有一部分是体外实验；3、与隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、阿米巴虫等原虫相比，芽囊原虫在形态学上没有观察到能够致病的显著结构，例如鞭毛、凝集素和棒状体等。并且机体感染芽囊原虫出现吞噬作用的现象仅在一例病例中有报道；4、没有芽囊原虫大流行的报道；5、关于芽囊原虫患者在驱除芽囊原虫后，胃肠道症状有好转的病例也仅有一例。通过对来自人和不同动物的芽囊原虫基于该位点的分型研究得到大量的核苷酸序列数据，确定了几个系统进化发育不同的分支。目前，已知的芽囊原虫至少有17种不同的亚型，ST1-ST17，这些不同的亚型也被确认为是独立的虫种[114]。ST1-ST7不仅在人中，同时也曾在动物中发现过。通过对来自人和非人类灵长类ST3亚型的基因序列进行比较分析，发现等位基因存在差异，因此关于芽囊原虫亚型是否具有宿主特异性仍不能确定。这也给芽囊原虫二命名法增加了难度。另有研究发现亚型ST5不仅在猪中发现，偶尔也在该猪舍的工作人员中6 引言发现，因此认为人与芽囊原虫阳性猪有密切接触能够增加人患芽囊原虫的机率。研究芽囊原虫亚型，尤其是研究来自不同宿主芽囊原虫亚型的等位基因，能够更加深入地了解芽囊原虫的传播以及其人兽共患潜力。1.1.8芽囊原虫基因分型工具芽囊原虫传统的检测方法主要是通过对采集的粪便样进行显微镜检查。但是这种方法相比较于普通PCR或real-timePCR等分子技术，实验敏感性比较低，并且此方法不能用于区别人源和动物源芽囊原虫。因此，PCR和测序相结合的分子生物学技术广泛的用于芽囊原虫的检测以及分型[115]。研究发现，尽管来源于人和动物的芽囊原虫卵囊不能在形态上进行区分，但是通过分子技术得到的基因序列却呈现显著的遗传多样性。关于芽囊原虫基因多态性的研究方法有很多，包括基于小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）序列分析、序列标记位点（sequencetaggedsites，STS）分析、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析、随机扩增多态性DNA（randomanamplifiedpolymorphieDNA，RAPD）分析、简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR）分析等。但是上述方法存在有一定的局限性。例如，基于SSUrRNA基因序列的研究多数情况下不能检测出多种亚型的混合感染，虽然存在缺陷，但是目前也是基于SSUrRNA基因序列对芽囊原虫进行系统进化比较分析运用的最多[114,116]。序列标记位点（sequencetaggedsites，STS）分析方法，其只能用于人源芽囊原虫（ST1-ST7）的分型，对于ST8-ST17不能用此方法进行亚型分析[116]。限制性片段长度多态性分析技术对DNA的质量要求比较高，实验操作比较繁琐，且实验中需要用到放射性核素导致实验成本较高，也限制了该技术的应用[117]。随机扩增多态性DNA技术虽然有DNA质量要求低且用量低和实验灵敏度高等优点，但是由于该技术稳定性弱、重复性差，导致实验结果可能会出现偏差，应用也受到了限制。1.1.9芽囊原虫流行病学1.1.9.1人目前已在人中发现9种亚型（ST1-ST9），其中亚型ST1、ST2和ST3在人中感染最为普遍，亚型ST4次之。流行病研究结果显示，工业化国家人芽囊原虫的平均感染率达到20%，在发展中国家感染率可超过50%。另外，对非洲塞内加尔农村地区儿童芽囊原虫感染率进行调查，感染率达到100%。面对如此高的感染率，我们应充分认识到芽囊原虫的重要性。中国安徽、江西、江苏、上海、浙江、广西、湖南等省市对不同人群芽囊原虫感染率进行调查[118]。其中广西南部沿海地区（随机抽样调查11个自然村）数据显示，各村人群芽囊原虫感染率最低为5.13%，而最高为44.72%，且0-9岁人群芽囊原虫感染率最高（34.79%）[119]。在湖南湘西进行的流行病学调查中，不同年龄段人群中，5-10岁组人群芽囊原虫感染率最高（43%），不同职业人群中，农民的感染率最高（21.19%），乡镇人群芽囊原虫感染率高于城镇人群[120]。综上可得：芽囊原虫的传播与地理分布、经济水平、卫生状况、生活习惯等因素密切相关。1.1.9.2鸟类7 东北农业大学农学硕士学位论文在法国孔雀、火烈鸟、非洲鸵鸟和美洲鸵鸟，日本鸡、鸭、鸵鸟，哥伦比亚麻雀、灰蓝裸鼻雀、巨嘴籽雀、橙黄雀鹀和美洲燕，澳大利亚鸡、鸭、鹅和鸵鸟，巴西鸡、鸭和鹌鹑，马来西亚鸵鸟等均已检测出芽囊原虫，感染率最低8.6%（6/70），最高达到100%且包括亚型有ST1、ST4、ST5和ST6[121-124]。这些亚型均为具有人兽共患潜力的亚型，因此可以推测鸟类在芽囊原虫传播中具有重要作用。1.1.9.3哺乳类及其它动物除人和鸟类外，还在许多其他动物中进行过芽囊原虫的流行病学调查，尤其是在非人类灵长类动物中[125]。常见的家畜牛、羊、猪大多感染芽囊原虫亚型ST1-ST6，伴侣动物犬猫多感染芽囊原虫亚型ST1-ST10，动物园中的一些灵长类动物主要感染芽囊原虫亚型ST1-ST10[126]。其中亚型ST1-ST7具有人兽共患潜力的芽囊原虫亚型[114,127]。1.2研究意义和目的隐孢子虫病、芽囊原虫病和毕氏肠微孢子虫病均为以腹泻为主要临床特点的人兽共患性肠道原虫病。根据世界范围内的流行病学调查研究证明，这三种肠道原虫病均能在人、鸟类和哺乳类动物中发生。具有重要的公共卫生学意义。随着中国经济的发展和生活水平的提高，越来越多的人把小型笼养鸟类和小型啮齿类动物作为生活中伴侣动物饲养，并且越来越多的人去动物园参观游玩。在城市生活中，宠物市场和动物园是动物集中地，并且城市居民可以与其中多数动物有直接的接触，动物携带的人兽共患的隐孢子虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫病原就对人类的健康构成了威胁。目前，关于动物园和宠物市场隐孢子虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫流行病学的研究只在中国中部地区开展过。对于黑龙江哈尔滨地区宠物市场和动物园动物隐孢子虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫感染情况及是否携带具有人兽共患潜力病原的情况尚不清楚。因此对黑龙江省哈尔滨市宠物市场和动物园动物这三种肠道原虫流行情况进行调查，具有重要的公共卫生学意义。本研究采用巢氏PCR技术结合测序的方法，对来自宠物市场和动物园74种动物的357份粪便样本中三种原虫的感染率、虫种/基因型和亚型分布情况进行调查研究。为人和动物隐孢子虫病、芽囊原虫病和毕氏肠微孢子虫病的预防和控制提供了理论依据。8 材料和方法2材料和方法2.1材料2.1.1粪便样本采集2015年6月21日-22日在黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路花鸟鱼市场、道外区道外花鸟鱼市场、道里区永久花鸟鱼市场和大发花鸟鱼市场共采集新鲜宠物粪便样本148份，其中在哈平路花鸟鱼市场采集粪样43份、道外花鸟鱼市场采集粪样86份、永久花鸟鱼市场采集粪样11份和大发花鸟鱼市场采集粪样8份。148份粪样中，99份粪样采集于27种鸟类；49份粪样采集于哺乳类动物。2016年10月6日在哈尔滨北方森林动物园采集169份粪便样本，其中134份粪便样本采自21种鸟类，35份采自11种哺乳动物。2016年10月7日在哈尔滨鸟语林采集40份动物粪便样本，这40份样本采自12种鸟类。具体样本信息表见2-1。宠物市场采集粪样的宠物动物都饲养在铁笼中。大多数动物都是和同品种、同年龄的动物饲养在同一铁笼中；动物园采集粪样的动物都按品种分隔饲养。采集的新鲜粪便样本装于一次性塑料手套中，标注上编号、宿主品种；同时在记录本上对应记录上采集日期、地点、年龄、性别、有无临床症状。采集的粪便样本置于实验室-20℃。本研究所有粪便样本均是在动物主人许可情况下采集。表2-1本研究中动物种类及采集地点Table2-1Animaltypessampledfrompetmarketsandzoosinthestudy分类中文名称英文名称拉丁文名称采集地点（个数）雀形目（85）八哥CrestedMynaAcridotherescristatellusNYL（1）DF（1）DW（2）HP（5）白斑黑石鵖PiedbushchatSaxicolacaprataDW（1）斑胸草雀ZebrafinchTaeniopygiaguttataHP（1）海南蓝仙鹟HainanblueflycatcherCyornishainanusDW（3）黑眉柳莺BreastedwarblerPhylloscopusrickettiDW（1）黑尾蜡嘴雀ChinesegrosbeakEophonamigratoriaDW（2）红点颏SiberianrubythroatLusciniacalliopeDW（1）HP（3）红胁绣眼鸟Chestnut-flankedwhite-eyeZosteropserythropleurusDW（1）画眉鸟ChinesehwameiGarrulaxcanorusDW（6）（转下页）9 东北农业大学农学硕士学位论文（接上页）分类中文名称英文名称拉丁文名称采集地点（个数）家八哥CommonMynaAcridotherestristisDW（2）金丝雀AtlanticcanarySerinuscanariaDW（3）蓝燕BlueSwallowHirundoatrocaeruleaDW（1）鹩哥CommonHillMynaGraculareligiosaDW（24）NYL（1）DF（3）HP（2）麻雀EurasiantreesparrowPassermontanusHP（1）铜蓝鹟VerditerflycatcherEumyiasthalassinusDW（4）乌鸫CommonblackbirdEurasianThrushDW（1）乌鸦HousecrowCorvussplendensHP（6）新疆歌鸲CommonnightingaleLusciniamegarhynchosDW（2）沼泽山雀MarshtitParuspalustrisDW（1）爪哇禾雀JavaSparrowLonchuraoryzivoraBFZ（1）DW（1）HP（3）棕背伯劳Long-tailedShrikeLaniusschachDW（1）鹦形目（39）伯克氏草原鹦鹉Bourke'sParrotNeophemabourkiiNYL（4）大紫胸鹦鹉LordDerby’sParakeetNeophemabourkiiBFZ（4）费氏情侣鹦鹉Fischer'sLovebirdAgapornisfischeriBFZ（4）DW（3）HP（3）虎皮鹦鹉BudgerigarMelopsittacusundulatusDF（1）DW（3）HP（3）黄蓝金刚鹦鹉Blue-and-YellowMacawAraararaunaBFZ（3）葵花凤头鹦鹉Sulfur-crestedcockatooCacatuagaleritaDW（1）BFZ（7）NYL（3）蓝喉金刚鹦鹉Blue-throatedMacawAraglaucogularisNYL（1）桃脸情侣鹦鹉Rosy-facedlovebirdAgapornisroseicollisDW（1）太阳锥尾鹦鹉SunConureAratingasolstitialisBFZ（1）五彩金刚鹦鹉ScarletMacawAraMacaoBFZ（1）NYL（2）（转下页）10 材料和方法（接上页）分类中文名称英文名称拉丁文名称采集地点（个数）鹳形目（60）白鹤SiberianCraneGrusleucogeranusBFZ（1）白枕鹤White-napedCraneGrusvipioBFZ（9）大鸨GreatBustardOtistardaBFZ（3）丹顶鹤Red-crownedCraneGrusjaponensisBFZ（8）NYL（1）冠鹤CrownedCraneBalearicaBFZ（16）黑冠鹤BlackCrownedCraneBalearicapavoninaBFZ（1）灰鹤CommonCraneGrusgrusBFZ（2）灰冠鹤GreyCrownedCraneBalearicaregulorumBFZ（6）火烈鸟FlamingoPhoenicopteridaeBFZ（2）蓑羽鹤DemoiselleCraneAnthropoidesvirgoBFZ（1）NYL（10）鹤鸵目（7）鸸鹋EmuDromaiusnovaehollandiaeBFZ（6）鹤鸵CasuariusSouthernCassowaryBFZ（1）隼形目（2）草原雕SteppeEagleAquilanipalensisNYL（1）秃鹫CinereousVultureAegypiusmonachusNYL（1）鸡形目（14）火鸡TurkeyMeleagrisgallopavoNYL（12）蓝孔雀CommonPeafowlPavocristatusBFZ（1）乌骨鸡SilkyfowlGallusgallusdomesticusDW（1）Brisson鸽形目（44）原鸽RockdoveColumbaliviaDW（4）BFZ（40）雁形目（2）黑天鹅BlackSwanCygnusatratusBFZ（2）佛法僧目（1）双角犀鸟GreatHornbillBucerosbicornisBFZ（1）鸵鸟目（19）非洲鸵鸟OstrichStruthiocamelusNYL（3）BFZ（16）食肉目（8）小熊猫LesserPandaAilurusfulgensBFZ（2）亚洲黑熊AsiaticBlackBearUrsusthibetanusBFZ（4）藏獒TibetanMastiffUrsusthibetanusBFZ（2）偶蹄目（16）长颈鹿GiraffeGiraffacamelopardalisBFZ（2）盘羊ArgaliOvisammonBFZ（1）小尾寒羊SmalltailedhansheepOvisariesBFZ（1）驼羊AlpacaSuriLamaglamaBFZ（11）野猪WildboarSusscrofaBFZ（1）（转下页）11 东北农业大学农学硕士学位论文（接上页）分类中文名称英文名称拉丁文名称采集地点（个数）奇蹄目（4）斑马ZebraEquusquaggaBFZ（3）马HorseEquuscaballusBFZ（1）啮齿目（26）花栗鼠ChipmunkTamiasDW（1）YJ（1）毛丝鼠ChinchillaChinchillalanigeraDW（10）YJ（4）魔王松鼠RedsquirrelSciurusvulgarisDW（2）HP（3）金丝熊HamsterMesocricetusauratusYJ（1）豚鼠GuineapigCaviaporcellusHP（4）兔形目（21）垂耳兔MiniatureLopHollandLopDF（2）、DW（2）、YJ（1）荷兰兔DutchrabbitOryctolaguscuniculusYJ（2）荷兰侏儒兔NetherlandDwarfOryctolaguscuniculusHP（2）家兔EuropeanrabbitOryctolaguscuniculusDW（2）HP（8）YJ（2）灵长目（6）猕猴RhesusMacaqueMacacamulattaBFZ（6）长鼻目（1）大象ElephantElephantidaeBFZ（1）猬形目（2）刺猬HedgehogErinaceusconcolorDW（1）YJ（1）注：BFZ代表北方森林动物园；NYL代表鸟语林；DW代表道外花鸟鱼市场；DF代表大发花鸟鱼市场；HP代表哈平路花鸟鱼市场；YJ代表永久花鸟鱼市场。Note:BFZ:Thenorthernforestzoo;NYL:Birdsworld;DW:Daowaipetsmarket;DF:Dafapetsmarket;HP:Hapinglupetsmarket;YJ:Yongjiupetsmarket.2.1.2主要试剂表2-2主要试剂Table2-2Themainreagents试剂名称来源康为世纪粪便基因组DNA提取试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司rTaq酶TaKaRa公司DL1000Marker、DL2000Marker宝生物工程（大连）有限公司玻璃珠425-600μmSigma公司琼脂糖粉BoehringerMannheim公司12 材料和方法本实验所用引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成和生工生物工程（上海）股份有限公司合成；TAE电泳缓冲液参考《分子克隆实验指南》（第三版）进行配置。2.1.3主要仪器设备表2-3主要仪器设备Table2-3Themainequipments主要仪器厂家LR56495高速离心机Thermo公司AG22331HamburgPCR仪eppendorf公司DYCⅢ型核酸电泳仪北京六一仪器厂GelDocEZ凝胶成像分析系统BIO-RAD公司METTERAE260型微量电子天平Deltalange公司Vortex-5型涡旋振荡器海门市其林贝尔仪器制造公司LX-200型掌式离心机海门市其林贝尔仪器制造公司DK-80型热恒温水槽上海一恒科技有限公司微量移液器eppendorf公司-80℃冰箱eppendorf公司2.2方法2.2.1粪样DNA提取运用康为世纪粪便基因组DNA提取试剂盒提取，提取方法根据试剂盒提取说明书进行改良，具体实验步骤如下：（1）取干净2.0EP管编号，称取0.2g玻璃珠置于EP管中。（2）从每份新鲜粪便样本中取出100mg-300mg粪样，置于EP管中。（3）向每个EP管中加入1000μlBufferSW，于涡旋振荡器上涡旋振荡3min，离心机12000rmp离心3min，弃去上清。（4）加入800μlBufferSL，涡旋振荡10min，加入600μlBufferGL，反复冻融5次，每次冻融5min，最后一次冻融10min后从水浴锅中取出。（5）水浴锅取出样本，为防止冷凝立即放入离心机，10000rmp离心2min。（6）离心后，将EP管中的上清液体可以分为多次加入吸附柱中，直至加完所有的上清液，12000rmp离心2min，弃去液体，再将吸附柱放入收集管中。（7）向吸附柱中加入500μlBufferGW1（已加入无水乙醇处理），12000rmp离心1min，弃去收集管中废液，重复一次，弃去收集管中废液。（8）向吸附柱中加入500μlBufferGW2（已加入无水乙醇处理），12000rmp离心1min，弃13 东北农业大学农学硕士学位论文去收集管中废液，将吸附柱放入收集管，12000rmp空离2min，之后将吸附柱放入到灭菌处理的1.5mlEP管中。（9）将50μlBufferGE液体悬空加入吸附柱中，室温放置5min，之后12000rmp离心1min，再室温放置5min，弃掉吸附柱，收集DNA，置于-20℃。2.2.2三种原虫虫种和基因型的鉴定通过对隐孢子虫和芽囊原虫小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）基因内部多态性区、对毕氏肠微孢子虫小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）内部转录间隔区（ITS）进行巢氏PCR，对PCR阳性结果测序分析来确定三种原虫的虫种或基因型。2.2.2.1三种原虫的巢氏PCR引物巢氏PCR扩增三种原虫所用引物见表2-4。表2-4三种原虫巢氏PCR引物Table2-4NestedPCRprimersofthethreeprotozoa病原引物名称引物序列（5’-3’）退火温度片段大小（℃）（bp）隐孢子虫CRYF1TTCTAGAGCTAATACATGCG551325CRYR1CCCATTTCCTTCGAAACAGGACRYF2GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG55830CRYR2CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA芽囊原虫BLAF1GGAAGCTTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA541800BLAR1GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACBLAF3GGAGGTAGTGACAATAAATC49600BLAR3ACTAGGAATTCCTCGTTCATG毕氏肠微EBF1GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT55410孢子虫EBR1TATGCTTAAGTCCAGGGAGEBF2AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG55392EBR2ATCGCCGACGGATCCAAGTG2.2.2.2巢氏PCR反应本研究PCR实验体系见表2-5，提取的DNA为第一轮反应模板，第一轮PCR产物为第二轮反应模板。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s，57℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min。隐孢子虫第一轮和第二轮实验均按照上述步骤进行。芽囊原虫除了把第一轮退火温度改为54℃，第二轮退火温度改为49℃外，其它不变。毕氏肠微孢子虫第一轮反应94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸40s；第二轮反应94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸40s，其它条件不变。14 材料和方法表2-5巢氏PCR扩增反应体系Table2-5NestedPCRsystem试剂第一轮反应体系（μL）第二轮反应体系（μL）灭菌双蒸水（ddH2O）12.636.5dNTP（2.5mM）2510×PCR缓冲液（1.5mMMgCl2）1.64上游引物（10μM）0.51下游引物（10μM）0.51Taq酶（5U/μL）0.30.5DNA2.5-第一轮PCR产物-2总反应体系20502.2.3毕氏肠微孢子虫多位点序列分型研究2.2.3.1多位点序列分型位点选择采用Feng等成功建立的MLST分型工具。包括三个微卫星位点（MS1、MS3和MS7）和一个小卫星位点MS4。2.2.3.2MLST分型巢氏PCR引物MLST分型所用引物、PCR反应退火温度及扩增片段大小见表2-6。2.2.3.3巢氏PCR反应对毕氏肠微孢子虫阳性结果，采用多位点序列分型法（MLST），应用巢氏PCR对进行MS1、MS3和MS7微卫星和小卫星MS4位点进行多位点分型。巢氏PCR方法退火温度见表2-6，巢氏PCR具体方法见2.2.2.2扩增隐孢子虫反应程序。反应体系见表2-5。多位点引物见表2-6。2.2.4PCR产物检测及测序根据第二轮PCR产物片段大小，配置1%-5%琼脂糖核酸凝胶。先吸取1μL的6×LoadingBuffer在一次性PE手套上，再吸取5μL二轮PCR产物与之充分混匀后加入琼脂糖核酸凝胶加样孔中。第一个加样孔中加入DNAMarker。设定核酸电泳仪电压为110V，跑电泳约25min关闭电泳仪，小心取出核酸胶放入凝胶成像分析系统中观察PCR实验结果并拍照留图保存。根据第二轮PCR电泳图，挑选平行实验中较亮的第二轮PCR产物送至北京华大基因科技有限公司测序。隐孢子虫和毕氏肠微孢子虫阳性产物进行双向测序，芽囊原虫阳性产物进行反向测序。15 东北农业大学农学硕士学位论文表2-6MLST研究中基于微卫星和小卫星位点的引物Table2-6PrimersofmicrosatelliteandminisatellitemarkersusedinMLSTstudy位点多态性引物序列（5’-3’）退火温度片段大小（°C）（bp）MS1TGC,TAA,F1:CAAGTTGCAAGTTCAGTGTTTGAA58843TAC循环和R1:GATGAATATGCATCCATTGATGTTSNPF2:TTGTAAATCGACCAAATGTGCTAT58675R2:GGACATAAACCACTAATTAATGTAACMS3TA循环和F1:CAAGCACTGTGGTTACTGTT55702SNPR1:AAGTTAGGGCATTTAATAAAATTAF2:GTTCAAGTAATTGATACCAGTCT55537R2:CTCATTGAATCTAAATGTGTATAAMS435bp小卫星F1:GCATATCGTCTCATAGGAACA551066循环和SNPR1:GTTCATGGTTATTAATTCCAGAAF2:CGAAGTGTACTACATGTCTCT55885R2:GGACTTTAATAAGTTACCTATAGT’MS7TAA循环和F1:GTTGATCGTCCAGATGGAATT55684SNPR1:GACTATCAGTATTACTGATTATATF2:CAATAGTAAAGGAAGATGGTCA55471R2:CGTCGCTTTGTTTCATAATCTT2.2.5测序结果分析用ChromasProVersion1.33将测序的原始序列进行剪切和拼接，通过与GenBank中上传的序列进行比对校对原始数据。然后应用ClustalX将校对后的序列和从GenBank上下载的参考序列比对，分析序列的多态性，从而确定虫种或基因型。应用BioEditv7.04比较基因序列与参考序列间的碱基差异，以确定是否有新发现基因序列。2.2.6系统进化分析通过Mega4（http://www.megasoftware.net/）软件，采用Neighbor-joining（N-J）方法选取Kimuratwo-parameter模型计算遗传距离，并显示在1000次以上重复（pseudoreplicates）中得到的大于60%的引导值（bootstrap）。对本研究中鉴定出的隐孢子虫和芽囊原虫基因序列和GenBank中相关基因序列间进行系统进化分析。采用Maximum-parsimony方法，对毕氏肠微孢子虫MLG序列进行进化分析。16 结果3结果3.1隐孢子虫3.1.1隐孢子虫感染率本研究通过巢氏PCR扩增小亚基核糖体RNA（SSUrRNA）基因的内部多态性区，对阳性结果测序来确定隐孢子虫虫种或基因型。部分隐孢子虫巢氏PCR第二轮产物凝胶电泳成像图见图3-1。隐孢子虫感染具体情况见表3-1。M为2000bpMarker；每个样品平行扩增两次M:2000bpMarker;ThePCRamplificationswereduplicatedoneachspecimen图3-1部分隐孢子虫基于SSUrRNA基因巢氏PCR第二轮产物电泳图Fig.3-1NestedPCRofpartialspecimensbasedonCryptosporidiumSSUrRNAgene在357份动物粪便样本中，共鉴定出24个隐孢子虫虫种和基因型，四个宠物市场中，只在道外花鸟鱼市场和哈平路花鸟鱼市场动物中鉴定出隐孢子虫阳性，总感染率为6.7%（24/357），其中道外花鸟鱼市场感染率为14.9%（13/86），哈平路花鸟鱼市场感染率为2.3%（1/43），北方森林动物园感染率为3.6%（6/169），鸟语林感染率为10%（4/40），在大发花鸟鱼市场和永久花鸟鱼市场未检测到隐孢子虫感染（表3-1）。本研究中鸟类动物隐孢子虫感染率7.7%（21/273）稍高于哺乳动物隐孢子虫感染率3.6%（3/84）。24个隐孢子虫阳性分别在一份金丝雀、画眉鸟、鹩哥、八哥、乌骨鸡、丹顶鹤、黑冠鹤、鸵鸟、蓝喉金刚鹦鹉、火鸡和蓑羽鹤；两份虎皮鹦鹉、费氏情侣鹦鹉和八哥，四份原鸽粪便中鉴定出。同时，在一份花栗鼠和一份魔王松鼠粪便样本中分别鉴定出一个隐孢子虫阳性，在一份刺猬粪便中也鉴定出隐孢子虫阳性。3.1.2隐孢子虫虫种和基因型鉴定及系统进化分析通过对24个阳性PCR结果进行测序、序列对比分析共鉴定出8个不同的隐孢子虫种和基因型，分别为C.baileyi、C.meleagridis、C.ubiquitum、C.galli、C.muris、CryptosporidiumratgenotypeI、Cryptosporidiumferretgenotype和CryptosporidiumaviangenotypeV（见表3-1）。17 东北农业大学农学硕士学位论文表3-1黑龙江哈尔滨地区宠物市场和动物园隐孢子虫感染率、虫种/基因型分布情况Table3-1Prevalence,species/genotypediatributionoftheCryptosporidiuminpetmartetsandzoosinHarbin,Heilongjiang采集地点感染率分类宿主（个数）隐孢子虫虫种/基因型（个数）道外花鸟鱼市场14.9%（13/87）鸟类（10）虎皮鹦鹉（2）C.baileyi（1）、Ferretgenotype（1）费氏情侣鹦鹉（1）AviangenotypeV（1）鹩哥（1）C.ubiquitum（1）八哥（2）C.baileyi（2）画眉鸟（1）C.galli（1）原鸽（1）C.baileyi（1）金丝雀（1）C.baileyi（1）乌骨鸡（1）C.baileyi（1）哺乳类刺猬（1）C.ubiquitum（1）（3）花栗鼠（1）Ferretgenotype（1）魔王松鼠（1）Ferretgenotype（1）哈平路花鸟鱼市场2.3%（1/43）鸟类（1）桃脸情侣鹦鹉（1）AviangenotypeV（1）北方森林动物园3.6%（6/169）鸟类（6）丹顶鹤（1）C.baileyi（1）原鸽（3）C.meleagridis（3）黑冠鹤（1）C.baileyi（1）鸵鸟（1）C.muris（1）鸟语林10.0%（4/40）鸟类（4）蓝喉金刚鹦鹉（1）C.muris（1）火鸡（1）RatgenotypeI（1）蓑羽鹤（2）C.baileyi（2）在道外花鸟鱼市场一份金丝雀、原鸽、乌骨鸡、虎皮鹦鹉、两份八哥粪便样本中；北方森林动物园一份丹顶鹤和黑冠鹤粪便样本中；鸟语林两份蓑羽鹤粪便样本中共鉴定出10个C.baileyi阳性。在这10个C.baileyi阳性中，其中3个分别来自八哥、虎皮鹦鹉、原鸽的C.baileyi基因序列均与GenBank登录号为L19068的基因序列100%一致；来自北方森林动物园丹顶鹤、黑冠鹤和来自鸟语林两个蓑羽鹤的C.baileyi基因序列与GenBank登录号为KT151550（鉴定自伊拉克的鹌鹑）的基因序列同样是100%一致。另外三个来自八哥（样本编号为CHPT14）、金丝雀（样本编号CHPT48）、乌骨鸡（样本编号为CHPT49）基因序列与L19068序列相比都有碱基突变（以L19068序列的第一个碱基为第一位），从CHPT14基因序列与L19068相比在467位碱基G突变为碱基A；CHPT48基因序列与L19068相比分别在634、640和696位上发现碱基C突变为碱基T，在683位上有碱基A突变为碱基T；CHPT49基因序列与L19068相比在675位上碱基A突变为碱基G。在道外花鸟鱼市场画眉鸟（样本编号为CHPT18）粪样中得到基因序列，经序列比对确18 结果定为C.galli（见表3-1）。与GenBank基因登录号为HM116387（鉴定自中国的相思鸟）的基因序列相比有7个碱基突变，分别是23位碱基G突变为碱基A、235位上碱基A突变为碱基G、251位上碱基T突变为碱基C、261位上碱基A突变为碱基T、418位上碱基C突变为碱基T及462位上碱基T突变为碱基C和571位上碱基T突变为碱基G（以参考序列的第一位碱基为第1位）。本研究中得到的有碱基突变的基因序列已上传到GenBank，基因登录号为KU744848、KU744847、KU744846和KU744845。注：本研究中鉴定出隐孢子虫虫种/基因型用下划线标示Note:Thegenotypesidentifiedinthisstudyindicatedbyunderline图3-2基于隐孢子虫SSUrRNA基因的系统进化分析Fig.3-2PhylogeneticrelationshipofpartialSSUrRNAgenenucleotidesequencesofCryptosporidiumspp.inthisstudyandknownsubtypes19 东北农业大学农学硕士学位论文通过序列分析，在道外花鸟鱼市场一份桃脸情侣鹦鹉粪便和哈平路花鸟鱼市场一份费氏情侣鹦鹉粪便中鉴定出CryptosporidiumaviangenotypeV（见表3-1），得到的两个基因序列与GenBank基因登录号为HM116381（鉴定自中国鹦鹉）的基因序列100%一致。在鸵鸟和蓝喉金刚鹦鹉粪便中鉴定出的C.muris（见表3-1）基因序列与基因登录号GU319782（鉴定自中国猴子）的基因序列100%一致。在三只原鸽粪便中鉴定的C.meleagridis（见表3-1）基因序列与基因登录号为JX548300（鉴定自中国鸡）基因序列100%一致。道外花鸟鱼市场鹩哥和刺猬粪便样本中分均鉴定出C.ubiquitum（见表3-1）。其序列与GenBank基因登录号为AF262328（鉴定自美国的水源中）的基因序列序列100%一致。从道外花鸟鱼市场虎皮鹦鹉、花栗鼠和魔王松鼠粪便样本鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype（见表3-1），与基因登录号为AF112572（鉴定自美国的雪貂）的基因序列100%一致。从鸟语林一只火鸡粪便中鉴定出CryptosporidiumratgenotypeI与基因登录号为FJ205699（鉴定自中国废水）的基因序一致。3.2芽囊原虫3.2.1芽囊原虫感染率本研究基于芽囊原虫SSUrRNA基因对采集于宠物市场和动物园的357份粪便样本进行芽囊原虫基因型鉴定。部分芽囊原虫巢氏PCR第二轮产物阳性结果图见图3-3。在357份粪便样本中共鉴定出28个芽囊原虫阳性，阳性率为7.8%。其中道外花鸟鱼市场、大发花鸟鱼市场和永久花鸟鱼市场芽囊原虫感染率分别为18.4%（16/87）、12.5%（1/8）和8.3%（1/12），北方森林动物园和鸟语林芽囊原虫感染率分别为3.6%（6/169）和10%（4/40）（见表3-2）。鸟类动物芽囊原虫感染率为4.8%（13/273），哺乳动物芽囊原虫感染率为17.9%（15/84），高于鸟类动物芽囊原虫感染。没有在哈平路花鸟鱼市场检测到芽囊原虫。M为2000bpMarker；每个样品平行扩增两次M:2000bpMarker;ThePCRamplificationswereduplicatedoneachspecimen.图3-3部分样本芽囊原虫SSUrRNA基因巢式PCR电泳图Fig.3-3NestedPCRofpartialspecimensbasedonBlastocystisSSUrRNAgene28个芽囊原虫阳性中14鉴定自鹦形目的五彩金刚鹦鹉和虎皮鹦鹉、雀形目的八哥和鹩哥、鸽形目的原鸽、鹤形目的火烈鸟、鸡形目的火鸡及鸵鸟目鸵鸟；另外14个芽囊原虫阳性鉴定自啮齿目的毛丝鼠、灵长目的猕猴、偶蹄目的野猪、猬形目的刺猬（见表3-2）。20 结果表3-2黑龙江省哈尔滨地区宠物市场和动物园芽囊原虫感染率及亚型分布情况Table3-2Prevalence,subgenotypediatributionoftheBlastocystisinpetmartetsandzoosinHarbin,Heilongjiang采集地点感染率分类宿主（个数）芽囊原虫基因型（个数）道外花鸟鱼市场18.4%（16/87）鸟类（7）八哥（1）ST17（1）原鸽（1）ST17（1）虎皮鹦鹉（1）ST17（1）鹩哥（4）ST17（4）哺乳类（9）毛丝鼠（8）ST17（9）刺猬（1）ST17（1）大发花鸟鱼市场12.5%（1/8）鸟类（1）虎皮鹦鹉（1）ST17（1）永久花鸟鱼市场8.3%（1/12）哺乳类（1）毛丝鼠（1）ST17（1）北方森林动物园3.6%（6/169）鸟类（1）火烈鸟（1）B.hominis（1）哺乳类（5）猕猴（4）ST1（2）;ST2（1）B.hominis（1）野猪（1）Blastocystissp.（1）鸟语林10%（4/40）鸟类（4）火鸡（2）B.hominis（2）鸵鸟（1）B.hominis（1）五彩金刚鹦鹉（1）B.hominis（1）3.2.2芽囊原虫亚型鉴定及系统进化分析基于SSUrRNA基因序列扩增得到的28个芽囊原虫序列，经序列分析鉴定分别为亚型ST1（2/28）、ST2（1/28）和ST17（18/28）。在道外花鸟鱼市场虎皮鹦鹉、刺猬、鹩哥和毛丝鼠、大发花鸟鱼市场虎皮鹦鹉和永久花鸟鱼市场毛丝鼠中鉴定出芽囊原虫的亚型均为ST17。在北方森林动物园的猕猴中鉴定出亚型ST1和ST2。本研究鉴定的28个芽囊原虫分离株中22个测序成功，其中两个猴源ST1分离株基因序列分别与基因登录号为AB107968和JQ974929的序列100%一致；一个猴源ST2分离株基因序列与基因登录号为KU361315的序列相似度为99%（以参考序列第一个碱基为第一位，在264位上碱基T突变成碱基C）。鸵鸟源、火烈鸟源和两个火鸡源人芽囊原虫分离株基因序列与基因登录号为EF468654和FJ809939基因序列100%一致。两个毛丝鼠源ST17分离株基因序列与基因登录号为KC148208序列100%一致，另外13个分离自刺猬、毛丝鼠、虎皮鹦鹉、鹩哥的ST17分离株之间基因序列100%一致，但与基因登录号为KC148028的基因序列有13个碱基差异。基于芽囊原虫SSUrRNA基因序列构建系统进化树，对未能确定亚型的芽囊原虫进行分析，其中火烈鸟源（样本编号为B14）基因序列在进化树中与人源亚型ST5亲缘关系最近，五彩金刚鹦鹉（样本编号为B168）和两只火鸡（样本编号为B133和B153）基因序列与亚型ST7亲缘关系最近（见图3-4）。本研究鉴定的18个亚型ST17中，9个来自啮齿动物毛丝鼠，1个来自刺猬，8个来自八哥、原鸽、鹩哥、虎皮鹦鹉鸟类动物，其中14个亚型21 东北农业大学农学硕士学位论文ST17序列有碱基突变，其在进化树中与已知亚型ST17处于一个进化分支上，节点支持值达到100%，从而更加确定本研究鉴定出的亚型ST17确定为ST17。注：本研究鉴定的基因型用下划线标示Note:Thegenotypesidentifiedinthisstudyindicatedbyunderline图3-4基于芽囊原虫SSUrRNA基因的系统进化分析Fig.3-4PhylogeneticrelationshipofpartialSSUrRNAgenenucleotidesequencesofBlastocystisinthisstudyandknownsubtypes22 结果3.3毕氏肠微孢子虫3.3.1毕氏肠微孢子虫感染率及基因型鉴定基于毕氏肠微孢子虫ITS基因序列，在357份样本中，只在一份北方森林动物园猕猴粪样中鉴定出毕氏肠微孢子虫阳性。感染率为0.3%（1/357）。毕氏肠微孢子虫阳性结果电泳图见图3-3。测序结果经比对，与基因登录号为KX383624的基因序列100%一致，为基因型D。M为2000bpMarker；每个样品平行扩增两次M:2000bpMarker;ThePCRamplificationswereduplicatedoneachspecimen.图3-5毕氏肠微孢子虫ITS位点巢式PCR电泳图Fig.3-5NestedPCRofspecimensbasedonBlastocystisSSUrRNAgene3.3.2毕氏肠微孢子虫多位点序列分析对本研究得到的基因型D进行MLST分型研究，巢氏PCR第二轮产物核酸电泳图见图3-6。该样本在MS1、MS3、MS4、MS7位点全部扩增成功，分别与基因登录号KF305594（鉴定自中国猿猴）、KF305613（鉴定自中国食蟹猴）、KF305620（鉴定自中国猕猴）、KF305631（鉴定自中国猕猴）序列100%一致。将多位点序列和ITS位点序列进行串联，与之前对中国、印度、尼日尼亚和秘鲁人和哈尔滨地区狐狸和貉子进行毕氏肠微孢子虫研究得到的基因型A、D和IV多位点分型数据进行比较存在一个碱基差异，构建的系统进化树中本研究猕猴与人源基因型D进化距离短，亲缘关系较近，进步一说明本研究鉴定的毕氏肠微孢子虫确为基因型D，同时也表明本研究基于ITS位点扩增毕氏肠微孢子虫的方法比较可靠。M为2000bpMarker；每个样品平行扩增两次M:2000bpMarker;ThePCRamplificationswereduplicatedoneachspecimen.图3-6毕氏肠微孢子虫阳性样本微卫星及小卫星位点巢氏PCR电泳图Fig.3-6NestedPCRofpositivespecimensatmicrosatelliteandminisatellitelociofE.bieneusi23 东北农业大学农学硕士学位论文注：本研究MLG基因序列用下划线标示Note:TheMLGgenesequenceinthisstudyindicatedbyunderline图3-7毕氏肠微孢子虫MLG序列系统进化分析Fig.3-7PhylogeneticrelationshipofMLGnucleotidesequencesofE.bieneusiinthisstudyandknownsubtypesinpreviewstudies24 结果3.4三种肠道原虫混合感染情况三种肠道原虫基因型分布情况见表3-5。47个阳性样本中，有6个样本为混合感染，分别为北方森林动物园的猕猴；鸟语林的火鸡；道外花鸟鱼市场的刺猬、八哥、虎皮鹦鹉和鹩哥。其中刺猬和鹩哥均混合感染具有人兽共患潜力的隐孢子虫（C.ubiquitum）和芽囊原虫（ST17）。猕猴混合感染芽囊原虫（ST1）和毕氏肠微孢子虫（基因型D），ST1和基因型D都是具有人兽共患潜力的基因型。一个宿主同时可以携带两种病原，这增加了三种肠道原虫病在动物和人之间的传播机率。表3-3三种肠道原虫阳性情况汇总Table3-3Summaryoftheallpositivesamplesinthisstudy宿主采集地点隐孢子虫芽囊原虫毕氏肠微孢子虫火烈鸟北方森林动物园B.hominis丹顶鹤北方森林动物园C.baileyi黑冠鹤北方森林动物园C.baileyi野猪北方森林动物园Blastocystissp.猕猴北方森林动物园ST2猕猴北方森林动物园B.hominis猕猴北方森林动物园ST1猕猴北方森林动物园ST1GenotypeD鸵鸟鸟语林B.hominis蓝喉金刚鹦鹉鸟语林C.muris火鸡鸟语林RatgenotypeIB.hominis蓑羽鹤鸟语林C.baileyi火鸡鸟语林B.hominis蓑羽鹤鸟语林C.baileyi五彩金刚鹦鹉鸟语林B.hominis鸵鸟北方森林动物园C.muris原鸽北方森林动物园C.meleagridis原鸽北方森林动物园C.meleagridis原鸽北方森林动物园C.meleagridis刺猬道外花鸟鱼市场C.ubiquitumST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17（转下页）25 东北农业大学农学硕士学位论文（接上页）宿主采集地点隐孢子虫芽囊原虫毕氏肠微孢子虫毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17毛丝鼠道外花鸟鱼市场ST17八哥道外花鸟鱼市场C.baileyiST17虎皮鹦鹉道外花鸟鱼市场C.baileyiST17八哥道外花鸟鱼市场C.baileyi原鸽道外花鸟鱼市场ST17画眉鸟道外花鸟鱼市场C.galli虎皮鹦鹉道外花鸟鱼市场Ferretgenotype花栗鼠道外花鸟鱼市场Ferretgenotype魔王松鼠道外花鸟鱼市场Ferretgenotype原鸽道外花鸟鱼市场C.baileyi桃脸情侣鹦鹉道外花鸟鱼市场AviangenotypeV金丝雀道外花鸟鱼市场C.baileyi乌骨鸡道外花鸟鱼市场C.baileyi鹩哥道外花鸟鱼市场C.ubiquitumST17鹩哥道外花鸟鱼市场ST17鹩哥道外花鸟鱼市场ST17鹩哥道外花鸟鱼市场ST17费氏情侣鹦鹉哈平路花鸟鱼市场AviangenotypeV虎皮鹦鹉大发花鸟鱼市场ST17毛丝鼠永久花鸟鱼市场ST1726 讨论4讨论4.1隐孢子虫感染情况及基因型分布至今为止，在世界范围内有许多关于隐孢子虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫流行病学的研究，但是大多数研究都集中在人和家畜中，比如猪、牛、羊等与畜牧业经济发展紧密相关的动物。关于笼养宠物和动物园动物等与人接触比较密切的动物这三种肠道原虫的流行病学调查的数据较少，尤其是关于小型笼养宠物的流行病学数据十分有限，相关分子流行病学调查只在澳大利亚、巴西和中国中部城市进行过[52,128-130]。在澳大利亚和巴西进行的研究中，所调查研究的鸟类动物都是混养在一起。而在中国进行的鸟类隐孢子虫流行病学调查中，部分研究采用镜检方法进行调查，并未用分子手段对隐孢子虫种进行鉴定，这都会引起实验结果误差。本研究采用分子生物学方法对来自74种鸟类357份粪便中隐孢子虫感染率和虫种进行了调查，结果显示鸟类隐孢子虫感染率为7.7%（21/273）。齐等对河南宠物市场鸟类及Gu对安徽动物园鸟类进行的隐孢虫流行病学调查，感染率分别为8.1%（35/434）和0.97%（1/103），但上述阳性率都是通过显微镜镜检的方法得到[52,130]。另外，张等对北京和潍坊宠物鹦鹉隐孢子虫分子流行病学调查中隐孢子虫阳性率为3.22%（10/311）[55]。本研究中鸟类动物的感染率为7.7%，与上述研究的感染率差异较大，这除了与研究地域、研究季节有关外，可能还跟动物种类以及实验方法的不同有较大关系。应用分子手段检测隐孢子虫准确率和效率均要显著高于显微镜检查，更重要的是本次研究中鸟类动物种类较多，隐孢子虫也有一定的宿主特异性，本研究中采集的多种鸟在世界范围内均无有关隐孢子虫感染的报道，而上述研究中大多数动物宿主种类较单一。本研究共鉴定出8个隐孢子虫种和基因型（C.baileyi、C.galli、C.meleagridis、C.muris、C.ubiquitum、aviangenotypeV、ratgenotypeI和ferretgenotype）。目前的研究数据表明C.baileyi、C.meleagridis和C.galli为能感染鸟类动物最常见的三种，C.baileyi通常在鸡形目中发现，而C.meleagridis常常在雀形目和鹦形目中发现[46]。早先认为在所有感染鸟类动物的隐孢子虫种和基因型中C.baileyi最为普遍，至少已在超过30种鸟类动物中报道过（见附录A）。与其他研究结果相似，在本研究中，C.baileyi为优势虫种，感染了属于5个不同目的7种鸟类：鸽形目（原鸽）、鸡形目（乌骨鸡）、雀形目（金丝雀、八哥）、鹦形目（虎皮鹦鹉）、鹤形目（黑冠鹤、蓑羽鹤）。在郑州动物园进行的隐孢子虫流行病学调查结果显示，在鹤形目（丹顶鹤）和雀形目（喜鹊、家八哥、凤头百灵、胡锦鸟、红嘴相思鸟、白文鸟、斑胸草雀）中鉴定出C.baileyi，在35个隐孢子阳性结果中，18个为C.baileyi，为研究中优势虫种。本研究与上述研究有相似结果。C.baileyi具有较强的宿主特异性并且在很多品种的鸟中都有发现。除了鸟类动物，C.baileyi也曾在爱尔兰的牛和美国的牡蛎中发现报道。自从1991年，Ditrich在人粪便中鉴定出C.baileyi[131]，此后并未有C.baileyi在人中发现的报道（见附录A）。所以对C.baileyi是否具有人兽共患性潜力仍持有怀疑态度，在获得更多的流行病学数据之前，我们无法确定其是否具有人兽共患潜力。C.meleagridis作为鸟类动物的常见虫种，宿主范围广，在能感染鸟类的隐孢子虫中，只27 东北农业大学农学硕士学位论文有C.meleagridis具有人兽共患潜力。现在中国、日本、秘鲁、泰国、瑞典等许多国家均已有C.meleagridis感染人的报道，不仅在免疫功能低下的人中检测到C.meleagridis，也在免疫功能正常的人中有发现。且较多国家有在水中发现C.meleagridis的报道（见附录A），目前在国内，C.meleagridis已在河南太平鸟、珠颈斑鸠、山斑鸠这些宠物鸟中被检测到[52]。本研究中在三只原鸽粪便中鉴定出C.meleagridis，鸽子活动范围广，粪便排泄不固定，易引起肠道寄生虫的传播。因此应引起足够重视，采取措施，防止疾病传播。C.galli也是感染鸟类的特异性虫种，在中国、澳大利亚、巴西和捷克共和国的鸟类粪便中都鉴定出C.galli[52,128,129,132]。但是迄今为止，未有其他动物种类感染C.galli的报道（见附录A）。根据目前流行病学调查结果显示，在中国，C.galli只在河南郑州宠物市场的太平鸟、高冠鹦鹉、蓝鹊、红嘴相思鸟和银耳相思鸟中有发现[52]。但在本研究中，在一只雀形目的画眉鸟粪便中鉴定出C.galli，迄今尚未有关于画眉鸟感染C.galli的报道（见附录A）。因此，本研究首次在画眉鸟粪便中鉴定出C.galli。目前，CryptosporidiumaviangenotypeV只在几种鹦形目的鸟类中报道过[46,52,55,133-136]。在中国，只在北京和潍坊的虎皮鹦鹉和河南的澳洲鹦鹉粪便中鉴定出CryptosporidiumaviangenotypeV[52,55]。同样地，本研究中发现的CryptosporidiumaviangenotypeV也是在鹦形目中的费氏情侣鹦鹉和桃脸情侣鹦鹉粪便中鉴定出。关于CryptosporidiumaviangenotypesI-V在动物中的感染只是偶尔有报道，由于流行数据的匮乏，这5种隐孢子虫基因型的传播途径、宿主特异性及人兽共患潜力也很难确定。C.ubiquitum被认为是具有人兽共患潜力的虫种。从附录A中可以得到多种哺乳动物对C.ubiquitum易感。但是其在鸟类动物间的感染流行情况仍是未知的。本研究初次在鹩哥和刺猬粪样中发现C.ubiquitum，关于C.ubiquitum在鸟类动物中的传染源及传染方式的确定需要建立在更多鸟类动物流行病学数据上。刺猬感染隐孢子虫的情况曾在英国、荷兰、日本、德国、丹麦报道过[137-141]，根据之前报道，刺猬被认为是具有人兽共患潜力的C.parvum和C.erinacei（原来被命名为hedgehoggenotype）的易感宿主[135]。这是首次在中国刺猬粪便中鉴定出C.ubiquitum。Cryptosporidiumferretgenotype是一种具有宿主特异性的基因型，通常特异性地感染啮齿类动物，比如雪貂、金花松鼠和魔王松鼠（见附录A）。本研究中在金花松鼠和魔王松鼠粪便中鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype与之前的研究一致，符合理论逻辑，但是在虎皮鹦鹉粪便中鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype，在某种程度上说明其宿主特异性有所变化，所以需要更多的流行病学数据来说明其宿主特异性。C.muris同样也被认为是具有人兽共患潜力的隐孢子虫虫种。其常见于啮齿类动物，偶尔在鸟类动物中有发现（见附录A），目前在中国虽然未有人感染C.muris的报道，只在家鼠、褐鼠、西伯利亚仓鼠、金花鼠等啮齿类动物、鸵鸟和常见家畜猪中报道过，但在智利、泰国、印度、法国等国家和地区已有人感染C.muris的病例[49,142]，本研究中在一只蓝喉金刚鹦鹉粪便中鉴定出C.muris，目前只在捷克的茶色蟆口鴟和中国的鸵鸟中有关于C.muris感染鸟类动物的报道[53,128]，因此本研究表明C.muris有宿主范围扩增现象。RatgenotypeI-V同样是宿主特性较强的基因型，其中RatgenotypeII和III在啮齿类动物中较为普遍（见附录A）。目前ratgenotypeI只在菲律宾的褐鼠和日本的褐鼠和蟒蛇中报28 讨论道过[143,144]。除了这两种动物，ratgenotypeI还在中国和英国的水中有报道[145,146]。本研究中在鸟语林一只火鸡粪便中鉴定出ratgenotypeI，鸟语林是哈尔滨市区一小型私人动物园，除了鹦鹉饲养在室内鸟笼中，其余的动物均饲养在室外笼子中，且没有专业的动物饲养人员看管，其动物园管理、动物生存环境卫生和动物福利还有较大的进步空间，我们猜测火鸡感染ratgenotypeI可能来源于动物园中野鼠，但是这种猜测需要更多的流行病学数据来支持。本研究得到四个隐孢子虫基因序列与GenBank中上传的序列存在碱基差异，可能是因为对SSUrRNA位点基因的随机扩增，也可能是因为这些突变更有利于虫体感染不同的鸟类，也可能是因为能更好地适应地理环境的变化。综上所述，本研究首次在金丝雀、虎皮鹦鹉、乌骨鸡粪便中鉴定出C.baileyi；首次在画眉鸟粪便中鉴定出C.galli；首次在费氏情侣鹦鹉和牡丹鹦鹉粪便中鉴定出CryptosporidiumaviangenotypeV；首次在鹩哥和刺猬粪样中鉴定出C.ubiquitum，首在虎皮鹦鹉粪便中鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype；首次在蓝喉金刚鹦鹉粪便中鉴定出C.muris及首次在火鸡粪便中鉴定出ratgenotypeI，研究扩大了能被隐孢子虫感染的鸟类动物宿主范围。更重要的是，本研究数据扩大了Cryptosporidiumferretgenotype、C.ubiquitum和ratgenotypeI的宿主范围，尤其是在鸟类动物中的宿主范围。在本次研究中发现了人兽共患的C.meleagridis、C.ubiquitum和C.muris，且这三种隐孢子虫均在多个国家的水中有报道。虽然动物园中的动物粪便每天清理三次，但是宠物市场的动物粪便基本每天只清理一次，动物市场的动物大多是同品种同年龄的饲养在一个笼子中，且动物间的鸟笼更换频繁，并且对于售卖的动物在病症不是很严重的情况下以及新进购的动物基本不服用抗寄生虫药物，加上相关部门和饲养人员对动物寄生虫病的不重视，这些因素都会大大增加肠道原虫在鸟类动物、哺乳动物和人之间的传播机率。4.2芽囊原虫感染情况及亚型分布目前，国内有关芽囊原虫流行病学研究大多数都集中在人上，尚未有关于宠物动物或动物园动物芽囊原虫的分子流行病学调查。本研究对哈尔滨地区部分鸟类动物和哺乳动物芽囊原虫感染率和基因型分布调查，在357份动物粪便中，共鉴定出3个已知的亚型，分别为ST1、ST2和ST17。其中亚型ST1和ST2是重要的人兽共患芽囊原虫亚型，已在中国、日本、美国、澳大利亚、哥伦比亚等超过20个多个国家和地区人中有报道，同时也普遍感染于灵长类动物，同时也有一些鸟类（鸿雁、鹌鹑、鸡等）和其它哺乳动物（猎豹、印度大象等）感染亚型ST1和ST2的报道[114,147,148]。见附录B。日本一项对317份非人类灵长类粪便中芽囊原虫基因型分布的研究发现，芽囊原虫优势亚型为亚型ST1（27%）、ST2（22%）和ST3（34%），本研究中发现的亚型ST1和ST2同样来自灵长类。本研究在火烈鸟粪便中发现人芽囊原虫，但是未能确定亚型，通过基于芽囊原虫SSUrRNA基因序列进行系统进化分析，火烈鸟源芽囊原虫在进化树上与芽囊原虫亚型ST5亲缘关系最近，另外一个五彩金刚鹦鹉和两个火鸡源在进化树上与芽囊原虫亚型ST7亲缘关系最近。亚型ST5和ST7同样是感染率较高的亚型，主要感染人类、非人类灵长类动物和反刍动物。目前亚型ST17仅在利比亚的梳趾鼠中有发现，尚未在其它动物中有报道，见附录B。本研究鉴定的18个亚型ST17中，9个来自啮齿29 东北农业大学农学硕士学位论文动物毛丝鼠，1个来自刺猬，8个来自八哥、原鸽、鹩哥、虎皮鹦鹉鸟类动物。这些动物也都是首次感染芽囊原虫亚型ST17。4.3毕氏肠微孢子虫孢子虫感染情况和基因型分布本研究在357份动物粪便样本中，仅在一份猕猴粪便样本中鉴定出毕氏肠微孢子虫（genotpyeD），目前在四川、云南、广西、广东湖南、湖北、上海、河南、河北等省已有动物园中非人类灵类动物感染基因型D的报道[149]。根据早先研究表明基因型D分布在人兽共患基因组1中，且是感染人最常见的毕氏肠微孢子虫基因型之一，尤其是在严重免疫抑制个体中。基因型D且具有较广的宿主范围，不仅有艾滋病阳性患者感染基因型D的报道，基因型D也可感染免疫功能正常的儿童和成人[76]。在中国河南、湖北和上海也已有基因型D感染人的报道[88,150,151]。另外，在上海、南京、青岛和武汉的水源中也鉴定出基因型D[149]。此外基因型D也在其它一些鸟类和哺乳类动物中有报道[149]，在哈尔滨和上海伴侣动物犬和猫中也有感染基因型D的报道，在与本研究相近的齐齐哈尔地区，一项研究在灰鹤和丹顶鹤中鉴定出基因型D[83]，但是在本研究中未在鸟类动物中鉴定出毕氏肠微孢子虫。这可能与地域差异、动物种类以及采取的实验方法不同有关。综上，毕氏肠微孢子虫基因型D广泛分布于中国多个省市，多地动物园动物也有感染基因型D的报道，这可能引起毕氏肠微孢子虫在人和动物间的传播。美国的一项关于宠物市场、动物园中动物作为人肠道疾病病原的调查研究中指出，多种人肠道疾病的发生与人和这些动物的接触有密切的关系，并且该研究通过走访13个动物园调查发现并指出了一些生活中常见但没有引起人们重视的行为，比如人们在动物园或宠物市场游玩时触摸、依靠或俯趴在动物栅栏上；触摸动物后不及时清洗手；在能与动物接触的区域饮食或者饮水，尤其是儿童在手不洁净的情况下，触摸自己的脸、嘴、含食食物、咬指甲等，这些行为大大增加了一些人兽共患肠道寄生虫疾病在人和动物之间的传播[152]。除一般大众对人兽共患病原体缺少了解外，相关部门及饲养人员对动物园和宠物市场安全卫生也缺乏重视。该研究同时也强调动物园工作人员、饲养人员和宠物市场销售人员应对促进人兽共患寄生虫病传播的行为有足够的认识。动物园和宠物市场这种动物密集、人流量大、人与动物直接接触机会多的地方，是人兽共患寄生虫病传播的重要风险因素，应该引起有关部门的重视，加强安全教育宣传，防止三种病原向更多的动物及人传播。30 讨论表4-1毕氏肠微孢子虫基因型D的宿主范围和地理分布Table4-1HostrangeandgeographicaldistributionofEnterocytozoonbieneusigenotypesDidentifiedinthisstudy基因型分类宿主/来源（地点）D人免疫功能低下者（爱尔兰、秘鲁、波兰、俄罗斯、刚果、荷兰、加蓬、马拉维、尼日尔、尼日利亚、葡萄牙、泰国、突尼斯、印度、英国、越南、西班牙、中国），免疫功能正常者（爱尔兰、秘鲁、波兰、俄罗斯、刚果、荷兰、加蓬、喀麦隆、马拉维、尼日尔、尼日利亚、葡萄牙、圣多美普林西比、泰国、突尼斯、印度、英国、越南、西班牙、中国）水水源水（中国），废水（突尼斯、西班牙、中国）鸟类天鹅（巴西），丹顶鹤（中国），灰鹤（中国），鸡（巴西），猎鹰（阿布扎比），秃鼻乌鸦（波兰）原鸽（巴西、爱尔兰、中国）哺乳类阿拉伯狒狒（中国），白头叶猴（中国），赤猴（中国），赤腹松鼠（中国），川金丝猴（中国），东非狒狒（中国），非洲狮（中国），狒狒（肯尼亚），海狸（美国），貉子（中国），黑线姬鼠（波兰），黑白疣猴（中国），狐狸（美国、西班牙、中国），浣熊（美国），黄喉姬鼠（波兰），金长尾猴（中国），金猫（中国），羚羊（中国），绿猴（中国），马（阿尔及利亚、哥伦比亚、捷克共和国、中国），猫（泰国、中国），毛丝鼠（中国），牛（阿根廷、巴西、韩国、美国、南非、中国），猕猴（美国、中国），绵羊（中国），犬（葡萄牙、中国），山羊（中国），山地大猩猩（卢旺达），麝鼠（美国），食蟹猴（中国），鼠（德国、捷克共和国），水獭（美国），田鼠（波兰），兔（西班牙、中国），西部低地大猩猩（中非共和国），猩猩（印度尼西亚），野猪（澳大利亚、捷克共和国、斯洛伐克共和国、中国），猪（捷克共和国、美国、日本、泰国、中国）31 东北农业大学农学硕士学位论文5结论（1）在哈尔滨地区74个品种，357份动物粪便样本中，共鉴定出8个隐孢子虫虫种和基因型：C.baileyi、C.meleagridis、C.ubiquitum、C.galli、C.muris、CryptosporidiumratgenotypeI、Cryptosporidiumferretgenotype和CryptosporidiumaviangenotypeV，其中C.meleagridis、C.ubiquitum和C.muris具有人兽共患潜力。（2）首次在金丝雀、虎皮鹦鹉、乌骨鸡粪便中鉴定出C.baileyi；在画眉鸟粪便中鉴定出C.galli；在费氏情侣鹦鹉和桃脸情侣鹦鹉粪便中鉴定出CryptosporidiumaviangenotypeV；首次在鹩哥和刺猬粪样中鉴定出C.ubiquitum；在虎皮鹦鹉粪便中鉴定出Cryptosporidiumferretgenotype；在蓝喉金刚鹦鹉粪便中鉴定出C.muris。（3）首次对中国东北地区宠物市场和动物园动物进行芽囊原虫基因分型研究，鉴定三个已知芽囊原虫亚型ST1、ST2和ST17，其中亚型ST1和ST2属于人兽共患亚型。（4）首次在鹩哥、虎皮鹦鹉、刺猬、毛丝鼠粪便样本中鉴定出芽囊原虫亚型ST17。（5）在动物园猕猴粪便样本中鉴定出具有人兽共患潜力的毕氏肠微孢子虫基因型D。（6）扩大了隐孢子虫和芽囊原虫的宿主范围，鉴定出具有人兽共患潜力隐孢子虫、芽囊原虫和毕氏肠微孢子虫，在预警三种肠道原虫病传播上，具有重要的公共卫生学意义。32 致谢致谢三年的研究生学习生活即将结束，衷心感谢三年来不论是在生活、工作还是学习上给予我无私帮助的老师和同学们。感谢我的导师李巍教授对我毕业课题设计、实验、论文写作过程中给予的指导和帮助。感谢导师三年研究生生活无微不至的关怀和细心的教导。您在学业上要求严格，在生活中还教我们如何做人。您严谨的学风、渊博的学识、积极向上的性格深深地影响着我。感谢东北农业大学兽医寄生虫教研室宋铭忻教授、路义鑫教授、韩彩霞副教授和李晓云老师对我研究生工作和生活无私的关心、指导和帮助。我想如果没有您们的帮助，我研究生的道路会走的坎坷许多，这些我都会牢记在心里面。感谢黑龙江自然科学基金青年项目（no.QC2013C015）对本研究的资助。感谢东北农业大学动物医学学院对我的培养3年对我的培养使得我成才，是我从幼稚慢慢走向成熟。感谢东北农业大学兽医寄生虫教研室万强师兄、陶威师兄、姜艳雪师姐等师兄师姐，感谢张斯雯、林永超、杨雨齐等同届同学以及实验室师弟师妹们对我在实验和生活上帮助、鼓励以及支持。也是你们的帮助是我的实验顺利地完成。感谢我的家人，在我遇到困难时给予的鼓励，在我身处黑暗时给予的温柔阳光.再次由衷感谢所有提及和未提及的老师、同学、亲人和朋友，感谢你们三年来给予我莫大的关心、鼓励、指导和帮助！33 东北农业大学农学硕士学位论文参考文献[1]XIAOL,FENGY.Zoonoticcryptosporidiosis[J].FEMSimmunologyandmedicalmicrobiology,2008,52(3):309-23.[2]MATHISA,WEBERR,DEPLAZESP.Zoonoticpotentialofthemicrosporidia[J].Clinicalmicrobiologyreviews,2005,18(3):423-45.[3]ImportantzoonoticintestinalprotozoanparasitesinAsia[J].[4]BARTAJR,THOMPSONRC.WhatisCryptosporidiumReappraisingitsbiologyandphylogeneticaffinities[J].Trendsinparasitology,2006,22(10):463-8.[5]VALIGUROVAA,JIRKUM,KOUDELAB,etal.Cryptosporidia:epicellularparasitesembracedbythehostcellmembrane[J].Internationaljournalforparasitology,2008,38(8-9):913-22.[6]SANTINM.ClinicalandsubclinicalinfectionswithCryptosporidiuminanimals[J].NewZealandveterinaryjournal,2013,61(1):1-10.[7]CURRENTWL,UPTONSJ,HAYNESTB.ThelifecycleofCryptosporidiumbaileyin.sp.(Apicomplexa,Cryptosporidiidae)infectingchickens[J].TheJournalofprotozoology,1986,33(2):289-96.[8]XIAOL.Molecularepidemiologyofcryptosporidiosis:anupdate[J].Experimentalparasitology,2010,124(1):80-9.[9]HOLUBOVAN,SAKB,HORCICKOVAM,etal.Cryptosporidiumaviumn.sp.(Apicomplexa:Cryptosporidiidae)inbirds[J].Parasitologyresearch,2016,115(6):2243-51.[10]XIAOL,MORGANUM,LIMORJ,etal.GeneticdiversitywithinCryptosporidiumparvumandrelatedCryptosporidiumspecies[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,1999,65(8):3386-91.[11]FENGY,ORTEGAY,HEG,etal.WidegeographicdistributionofCryptosporidiumbovisandthedeer-likegenotypeinbovines[J].Veterinaryparasitology,2007,144(1-2):1-9.[12]ABEYWARDENAH,JEXAR,KOEHLERAV,etal.FirstmolecularcharacterizationofCryptosporidiumandGiardiafrombovines(BostaurusandBubalusbubalis)inSriLanka:unexpectedabsenceofC.parvumfrompre-weanedcalves[J].Parasites&vectors,2014,7(75.[13]YANGR,JACOBSONC,GARDNERG,etal.Longitudinalprevalence,oocystsheddingandmolecularcharacterisationofCryptosporidiumspeciesinsheepacrossfourstatesinAustralia[J].Veterinaryparasitology,2014,200(1-2):50-8.[14]KOINARIM,KARLS,NG-HUBLINJ,etal.IdentificationofnovelandzoonoticCryptosporidiumspeciesinfishfromPapuaNewGuinea[J].Veterinaryparasitology,2013,198(1-2):1-9.[15]JOHNSONJ,BUDDLER,REIDS,etal.PrevalenceofCryptosporidiumgenotypesinpreandpost-weanedpigsinAustralia[J].Experimentalparasitology,2008,119(3):418-21.34 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附录附录A本研究鉴定隐孢子虫种和基因型宿主及地域分布AppendixAHostrangeandgeographicaldistributionofCryptosporidiumspecies/genotypesidentifiedinthisstudy隐孢子虫种/基分类国家（宿主/来源种类）因型C.baileyi人捷克斯洛伐克水德国（水源水），加拿大（生水、水源水），苏格兰（饮用水、生水），中国（水源水、污水）鸟类动物阿尔及利亚（鸡），奥地利（鹌鹑、鹅），巴西（鹌鹑、白颊食籽雀、橙黄雀鹀、黑美洲鹫、鸿雁、黄额食籽雀、鸡、金翅雀、绿翅舞雀、冕蜡嘴鹀、南美白颈鸫、青彩鹀、鸭、棕腹鸫），德国（红胸秋沙鸭、隼），韩国（鸡），捷克共和国（凹嘴巨嘴鸟、发冠拟掠鸟、红冠鹦哥、红腿石鸡、红嘴鸥、红腰酋长鹂、红领绿鹦鹉、鸡、美洲鹤、鸵鸟、鸭），美国（鹅、鸡、猎隼）日本（鸡、鸡尾鹦鹉），西班牙（角枭），叙利亚（肉鸡），伊朗（鸡），英国（松鸡），约旦（鸡），中国（鹌鹑、白文鸟、斑胸草雀、赤麻鸭、丹顶鹤、凤头百灵、红嘴相思雀、鸡、金翅雀、鹩哥、鸵鸟、喜鹊、原鸽）哺乳动物伊朗（牛）其他动物美国（牡蛎）C.galli鸟类动物澳大利亚（斑胸草雀、彩火尾雀、金丝雀、蓝绿鹦鹉、栗麻雀、牧师鸟、），巴西（巴西拟鹂、白眼鹦哥、橙黄雀鹀、纯色鹦哥、淡腹鸫、淡胸鸫、红领食籽雀、红领带鹀、灰蓝食籽雀、冠金翅雀、冠蜡嘴鹀、金丝雀、金翅雀、鸡尾鹦鹉、巨嘴籽雀、绿翅舞雀、双领食籽雀、青彩鹀、红胸亚马逊鹦鹉、小籽雀、棕腹鸫），捷克共和国（花尾榛鸡、马来犀鸟、美洲红鹳、冕蜡嘴鹀），美国（红翅黑鹂），中国（太平鸟、银耳相思鸟)C.meleagridis人爱尔兰、赤道几内亚、澳大利亚、埃塞俄比亚、秘鲁、波兰、丹麦、多米尼加共和国、法国、柬埔寨、肯尼亚、马来西亚、马拉维、尼日利亚、科特迪瓦、葡萄牙、日本、泰国、突尼斯、瑞典、美国、南非、西班牙、印度、印尼、英国、沙特阿拉伯、约旦、中国水中国（废水、自来水），加拿大（环境水），土耳其（海水、自来水），日本（污水），泰国（海水），匈牙利（饮用水）鸟类动物阿尔及利亚（鸡、火鸡），爱尔兰（火鸡），澳大利亚（红领绿鹦鹉），巴西（鸡、鸵鸟），美国（火鸡），加拿大（红领绿鹦鹉），捷克共和国（红腿石鸡、红领绿鹦鹉、鸡），科特迪瓦（鸡），日本（澳洲鹦鹉），瑞典（鸡），泰国（鸽子），突尼斯（鸡），西班牙（斑鸠、欧斑鸠、红腿石鸡），匈牙利（火鸡），伊朗（原鸽），意大利（火鸡），中国（原鸽、扇尾鸽、鹌鹑、（转下页）45 东北农业大学农学硕士学位论文（接上页）隐孢子虫种/基分类国家（宿主/来源种类）因型鸡、红腿石鸡、太平鸟、山斑鸠）哺乳动物澳大利亚（岩袋鼠），捷克共和国（犬），卢旺达（山地大猩猩），中国（貂，牛）其他动物菲律宾（双壳类动物）C.ubiquitum人秘鲁、加拿大、柬埔寨、美国、尼日利亚、斯洛文尼亚、土耳其、威尔士、委内瑞拉、西班牙、新西兰、英国水澳大利亚（灌溉水、污水），加拿大（水源水、生水），美国（溪水、原废水、水源水、雨水），苏格兰（饮用水、生水），威尔士（污水），西班牙（污水），英国（环境水样），中国（原废水）哺乳动物澳大利亚（袋熊、鹿、绵羊、山羊），埃塞俄比亚（羔羊）、巴西（绵羊），秘鲁（羊驼），比利时（绵羊），波兰（绵羊、山羊）、法国（牛、山羊），捷克共和国（白斑羚、白腿大羚羊、欧洲盘羊），尼泊尔（泽鹿），挪威（绵羊），罗马尼亚（绵羊），美国（白尾鹿、东美松鼠、负鼠、海狸、狐松鼠、狐猴、浣熊、金花鼠、鹿鼠、绵羊、牛、沙鼠、山羊、鼠、松鼠、土拨鼠），南非（黑斑羚、野牛），日本（鼠)，瑞士（牛），苏格兰（野生索艾羊），希腊（绵羊、山羊），西班牙（赤狐、绵羊），意大利（牛），英国（绵羊、狍子），中国（毛丝鼠、牦牛、梅花鹿、绵羊、犬、山羊、羱羊藏绵羊）C.muris人爱尔兰、秘鲁、法国、肯尼亚、沙特阿拉伯、斯洛伐克、泰国、印度、印尼、智利水爱尔兰（湿地），澳大利亚（水源水），德国（原废水），美国（原废水、猪场污水、池塘），葡萄牙（出厂水），瑞士（原废水），西班牙（饮用水处理厂、污水处理厂、湖水、原废水），希腊（污水），中国（原废水）鸟类动物澳大利亚（火鸡），捷克共和国（茶色蟆口鴟）哺乳动物阿尔及利亚（驴、马），爱尔兰（骆驼、牛、猪），澳大利亚（袋狸、猫），巴西（黑鼠、红黑矛头蝮、美洲矛头蝮、牛、小家鼠、玉米锦蛇），波兰（马），菲律宾（褐鼠、亚洲家鼠），哥伦比亚（猫），加拿大（环斑海豹、牛），捷克共和国（巴塔哥尼亚豚鼠、长颈鹿、赤喉美松鼠、东非鼢鼠、东部家鼠、褐鼠、黄色鼠蛇、金黄地鼠、骆驼、马、猫、蒙古沙鼠、牛、实验鼠、西伯利亚金花鼠、蹄兔、鼠、小毛足鼠、小家鼠、雪羊、猪），肯尼亚（东非鼢鼠），卢旺达（山地大猩猩），美国（东美松鼠、褐鼠、骆驼、牛、犬、蟒蛇、食蟹猕猴、食鼠黑蛇、蹄兔、玉米锦蛇），日本（大林姬鼠、猫、牛、犬、实验鼠、兔、豚鼠），斯洛伐克（猪），苏格兰（牛），西班牙（地中海小家鼠、家鼠、球蟒），印尼（猴子），英国（木鼠、欧洲棕背鼠平、小家鼠），中非（非洲野牛），中国（褐鼠、金黄地鼠、坎贝尔（转下页）46 附录（接上页）隐孢子虫种/基分类国家（宿主/来源种类）因型仓鼠、鸵鸟、西伯利亚仓鼠、西伯利亚金花鼠、小家鼠、亚洲家鼠、猪）Ferretgenotype水英国（饮用水）哺乳动物美国（黑脚鼬鼠、雪貂），日本（雪貂），意大利（欧亚红松鼠），中国（欧亚红松鼠、西伯利亚花栗鼠）Aviangenotype鸟类动物巴西（蓝顶鹦哥），日本（鸡尾鹦鹉），美国（彩冠凤头鹦鹉），中国（虎V皮鹦鹉、鸡尾鹦鹉）RatgenotypeI哺乳动物菲律宾（褐鼠），日本（蟒蛇、褐鼠），英国（生水），中国（生水）B本研究鉴定芽囊原虫亚型宿主及地域分布AppendixBHostrangeandgeographicaldistributionofBlastocystisspp.subtypesidentifiedinthisstudy亚型分类国家（宿主/来源种类）ST1人阿联酋、爱尔兰、埃及、澳大利亚、巴西、巴基斯坦、丹麦、德国、俄罗斯、厄瓜多尔、法国、非洲、菲律宾、哥伦比亚、荷兰、老挝、利比亚、罗马尼亚、马来西亚、美国、孟加拉、尼日利亚、尼泊尔、日本、瑞典、泰国、坦桑尼亚、土耳其、突尼斯、希腊、西班牙、新加坡、英国、伊朗、意大利、印度、印度尼西亚、中国)水菲律宾（污水），尼泊尔（河水），土耳其（自来水）鸟类日本（鹅、鸡、野鸡），法国（火鸡、鸡）哺乳类澳大利亚（白颊长臂猿、大猩猩、狒狒、黑叶猴、黑猩猩、环尾狐猴、领狐猴、犬、冠猕猴、猩猩、猪），丹麦（奶牛），法国（德氏长尾猴、尔氏长尾猴、环尾狐猴、红领狐猴、红颊黑猿、黑白疣猴、加州海狮、金狮面狨、猕猴、山魈、豚尾西非低地大猩猩、枭面猴、印度大象），利比亚（骆驼、牛），哥伦比亚（野牛），捷克共和国（猪），美国（犬、猫），墨西哥（懒吼猴），尼泊尔（长臂猿、狒狒、红毛猩猩、猕猴、山魈、倭猩猩），日本（草原猴、长尾猴、赤猴、长尾叶猴、黑猩猩、狐猴、绢毛猴、牛、婆罗州猩猩、日本猕猴绒毛猴、僧面猴、鼠、乌白眉猴、猩猩、疣猴、蜘蛛猿、猪），坦桑尼亚（黑猩猩、黑白疣猴），泰国（马、猪），土耳其（犬），西班牙（金竹狐猴、枭面长尾猴、猪），英国（白掌长臂猿、红颊黑猿、大长臂猿、黑猩猩、牛、绒毛猴、猩猩），中国（食蟹猴）ST2人阿联酋、埃及、爱尔兰、澳大利亚、巴西、巴基斯坦、丹麦、德国、俄罗斯、厄瓜多尔、法国、菲律宾、哥伦比亚、荷兰、老挝、利比亚、罗马尼亚、马来西亚、美国、尼泊尔、日本、瑞典、泰国、坦桑尼亚、突（转下页）47 东北农业大学农学硕士学位论文（接上页）亚型分类国家（宿主/来源种类）尼斯、土耳其、希腊、西班牙、意大利、印度尼西亚、伊朗、英国、中国水菲律宾（污水）鸟类澳大利亚（鸡、食火鸡），日本（鹌鹑、鸿雁、鸡、野鸡）哺乳类澳大利亚（大猩猩、犬、猩猩、猪），法国（白掌长臂猿、白面僧面猴、黑猩猩黑白疣猴、环尾狐猴、加纳长尾猴、猎豹、普瓦图驴、水豚、西非低地大猩猩、猪），菲律宾（猴子），哥伦比亚（黑鼠），墨西哥（懒吼猴、鬃毛吼猴），尼泊尔（猕猴），坦桑尼亚（黑白疣猴），土耳其（犬），西班牙（枭面长尾猴、西部低地大猩猩、猪），英国（黑猩猩、灰长臂猿、绒毛猴、猩猩、西部低地大猩猩），中国（食蟹猴）ST17哺乳类利比亚（梳趾鼠）48 攻读硕士学位期间发表的学术论文攻读硕士学位期间发表的学术论文[1]LIQ,LIL,TAOW,JiangY,WanQ,LinY,LiW*.MolecularinvestigationofCryptosporidiuminsmallcagedpetsinnortheastChina:hostspecificityandzoonoticimplications[J].ParasitolRes,2016,115(7):2905-11.[2]YangY,LinY,LiQ,ZhangS,TAOW,WanQ,JiangY,LiW*.Widespreadpresenceofhuman-pathogenicEnterocytozoonbieneusigenotypeDinfarmedfoxes(Vulpesvulpes)andraccoondogs(Nyctereutesprocyonoides)inChina:firstidentificationandzoonoticconcern.ParasitolRes,2015,114(11):4341-4348.[3]JiangY,TaoW,WanQ,LiQ,YangY,LinY,ZhangS,LiW*.Zoonoticandpotentiallyhost-adaptedEnterocytozoonbieneusigenotypesinsheepandcattleinnortheastChinaandanincreasingconcernaboutthezoonoticimportanceofpreviouslyconsideredruminant-adaptedgenotypes.ApplEnvironMicrobiol,2015,81(10):3326-3335.[4]WanQ,LinY,MaoY,YangY,LiQ,ZhangS,JiangY,TaoW,LiW*.HighPrevalenceandWidespreadDistributionofZoonoticEnterocytozoonbieneusiGenotypesinSwineinNortheastChina:ImplicationsforPublicHealth.JEukaryotMicrobiol,2015,63(2):162-170.[5]ZhangS,TaoW,LiuC,YangY,WanQ,LiQ,YangH,LinY,LiW*.FirstreportofCryptosporidiumcanisinfoxes(Vulpesvulpes)andraccoondogs(Nyctereutesprocyonoides)andidentificationofseveralnovelsubtypefamiliesforCryptosporidiumminkgenotypeinminks(Mustelavison)inChina.InfectGenetEvol,2016,41:21-25.49