无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究.pdf

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学校代码：１０２８５教学号：２０〗４４１３４０Ｇ３■＿ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ＂１＇，Ｉ［？匕种内母的丁柄子，Ｖ：頌〇Ｐ７７ＬＭ十收追彳；—及混合感染炎症因子的研究卜Ｔｌｉｅｓｔｕｄｏｆｅｉｄｅｍｉｏｃｏｆｓｅ＇ｅｎｋｉｉｉｄｓｆｒｅｓｉｒａｎｉｓｅｓｕｉｈｉｒ：）ｐｌ＾ｏｐｉｏ＼ａｉＣｌｄｅｎｉｎ＾－－Ｗｕｘｉｎｄｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｌａｍｍａｉｏｎｃｌｏ；ｍｓｕｂｅｃｔｗｉｔｈｍｉｘｅｄｉｎｃｔｏｎａｐｆｔｎｓｆｅｉｊｍ－指导教师姓名Ｔ＾．——专业名称＿義￥究方向小儿呼吸■；在院部苏州大学儿科临床医学院—！ II III 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究中文摘要无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究中文摘要目的：了解无锡地区儿童呼吸道病毒感染的流行病学特点，探讨呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)、流感病毒A型（InfluenzavirustypeA，Inf-A）混合感染时患儿的临床特点、体内常见的炎症因子表达水平及其临床意义。方法：1．无锡七种常见呼吸道病毒的流行病学研究：收集2010年1月至2016年12月，在无锡市第二人民医院（崇安区），无锡市第九人民医院（滨湖区）、无锡市东亭社区医院（锡山区）和无锡市映山河儿童医院（崇安区）四家医院诊治的门诊及住院儿童（≤14岁）呼吸道感染患者，共计2160例。采集鼻咽部分泌物标本，用免疫荧光法检测七种常见呼吸道病毒，即呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，RSV），腺病毒（adenovirus，ADV），流感病毒A、B型（InfluenzavirustypeAandB，Inf-A和Inf-B），和副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(paraInfluenzavirustype1～3，PIV1～3)。回顾性收集患儿的流行病学资料、临床症状、实验室数据等信息。分析不同年龄、季节、疾病与七种呼吸道病毒感染的相关性，一定程度上反应了无锡地区七种呼吸道病毒的流行病学特征。2．由于本地区以RSV混合Inf-A感染发生率最高，我们分析了RSV及Inf-A病毒混合感染患儿临床特征：对2010年1月至2016年12月期间，因急性呼吸道感染入住无锡市第二人民医院年龄＜5岁的RSV、Inf-A混合感染（MIX组）20例患儿为研究对象进行回顾性分析。同时选取同期住院治疗的30例单纯RSV感染患儿（RSV组）作为对照组。进行临床特征对照分析研究。3.RSV及Inf-A病毒混合感染患儿血清炎症因子的研究：将Inf-A和RSV检测阳性的患儿及部分健康儿童共95例纳入研究。将其分为四组：Inf-A感染组（仅Inf-A检测阳性）、RSV感染组（仅RSV阳性）、混合感染组（RSV及Inf-A检测均阳性）I 中文摘要无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究及与感染组年龄匹配的健康对照组。采用悬液芯片技术和酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)法分别检测四组患儿体内白介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-8、肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)-α、干扰素（Interferon，IFN)-γ等致炎性因子以及IL-4、转化生长因子（Transforminggrowthfactor，TGF)-β等抗炎性细胞因子的表达水平。并分析比较四组患儿的炎症因子水平与病程严重程度的相关性。结果：1.从2010年1月到2016年12月，共2160例有急性呼吸道感染（Acuterespiratoryinfection，ARI）患儿的样本进行了调查。760例病毒检出结果呈阳性，病毒阳性检出率为35.19%；RSV检出率最高，其余依次为：Inf-A、Inf-B、ADV、PIV-1、PIV-2、PIV-3；发现42例混合感染患儿，混合感染率5.52%，其中RSV在混合感染中最为常见；0~1岁组病毒呼吸道病原体检出率最高，其次为3~14岁组、1~3岁组。0~1岁以RSV的检出率最高，3~14岁组中Inf-B的检出率最高。85例新生儿标本中病毒检测阳性25例，阳性率为30.59％，主要以RSV为主。季节分布方面，呼吸道病毒感染主要出现在冬季，冬、春、秋三季中RSV检出率均为最高(共368份样本阳性)，夏季Inf-B的检出率最高。喘息患儿中RSV检出率最高，占病毒阳性数的47.41%。2.MIX组平均年龄21.71±0.84月要高于RSV组的平均年龄为10.61±2.15月；从临床特征来比较，MIX组患儿发热、呕吐、呼吸困难发生率明显高于RSV组患儿。RSV组患儿咳嗽、鼻塞的发病率高于MIX组。两组患儿喘息、肺部啰音等表现发生率无明显差异；从临床诊断比较，MIX组20%发生重症肺炎，高于RSV（6.67%）（P=0.026）；外周血常规中WBC（leukocyte，WBC）计数、中性粒细胞百分数、血小板计数，MIX组与RSV组均无统计学差异。两组患儿CRP(C-Reactiveprotein，CRP)升高比例基本相仿，但CRP＞40mg的患儿比例MIX组高于RSV组；MIX组患儿出现心肌损害要高于RSV组，但两组患儿心力衰竭、呼吸衰竭及肝功能损害表现等无明显差异；治疗上看MIX组患儿静脉使用糖皮质激素、平均住院时间要高于RSV组。而在呼吸支持、吸氧、吸入糖皮质激素、吸入支气管扩张剂间两组无统计学差异。3.一共95例患儿被分为四组纳入炎症因子研究。结果显示，IL-1β、IL-8、TNF-ɑ、IFN-γ在三个感染组间有不同程度升高。IL-2在RSV组无升高，在混合感染组升高不II 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究中文摘要明显。混合感染组，在疾病的恢复期，IL-1β、TNF-ɑ、IL-8、IFN-γ较治疗前均有明显下降，但TNF-ɑ、IFN-γ、IL-1β水平较健康对照组仍明显偏高。因此，IL-8水平的变化可能是反应病程较敏感的指标。。结论：1.2010年-2016年，无锡地区七种呼吸道病毒流行整体呈平稳趋势；2013年12月可能有RSV感染的小流行；RSV是引起无锡地区0-1岁儿童冬季急性呼吸道感染的主要病原体；且临床上容易表现为喘息性疾病。2.呼吸道合胞病毒混合A型流感病毒易发生于大年龄儿童、更易出现发热、呕吐、腹泻、呼吸困难等症状，尤其发热、重症肺炎的发生率高。RSV混合Inf-A感染易加重病情。3.Inf-A、RSV混合感染患儿体内促炎因子占主导地位，以IL-1β、IL-8、TNF-ɑ升高为主；IL-8水平的变化可能是反应病情严重程度较敏感的指标。关键词：儿童，呼吸道病毒，临床特点，混合感染，细胞因子作者：葛小丽指导老师：冯星III 英文摘要无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究ThestudyofepidemiologyofsevenkindsofrespiratoryvirusesinChildreninWuxiandexpressionofinflammatoryfactorsinsubjectswithmixedinfectionAbstractObjectivesThisstudyisdesignedtoclarifytheepidemiologicalcharacteristicsofrespiratoryviralinfectionsinchildreninWuxi.weinvestigatetheclinicalcharacteristicsandtheexpressionlevelofcommoninflammation-relatedfactorsinchildreninfectedwithrespiratorysyncytialvirus(RSV)andInfluenzavirustypeA(Inf-A),andunderstandwhatitmeansforclinicalwork.Methods1.EpidemiologicalStudyonSevenCommonRespiratoryVirusesinWuxi:FromJanuary2010toDecember2016,atotalof2160casesaged0-14yearsoldwhoaretreatmentforARIinWuxiSecondPeople’sHospital,WuxiNinthPeople’sHospital,DongtingCommunityHospitalinWuxi,andYingshanheWomen’sHospitalinWuxiareenrolledinthepresentstudy.wecollecttherespiratorytractspecimens,andRSV,adenovirus(ADV),influenzavirustypeAandB(Inf-AandInf-B)andparaInfluenzavirustype1～3(PIV1～3)weredetectedwiththeD3UltraDFARespiratoryVirusIdentificationKit(D3DFAKit).Inaddition,Demographicdata,clinicalsymptomsandlaboratoryresultsetcarecollected.Byanalyzingthecorrelationamongage,seasons,diseasesandsevenrespiratoryviralinfections,thestudydescribestheepidemiccharacteristicsofvariousrespiratoryvirusesinWuxi.2.DuetothehighestincidenceofRSVinfectionandmixedinfectioninthisregion,weanalyzedtheclinicalfeaturesofchildreninfectedwithRSVandInf-Avirus.:FromJanuary2010toDecember2016,20patientsagedlessthan5yearsoldandinfectedwithRSVandInf-A(MIXgroup)whowereadmittedtotheSecondPeople'sHospitalofWuxiCityforacuterespiratoryinfectionwereretrospectivelyanalyzed.Atthesametime,30IV 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究英文摘要RSV-infectedchildren(RSVgroup)wereselectedasthecontrolgroup.Wemakeanalysisinthistwogroups.3.StudyonlevelofseruminflammatoryfactorsinchildreninfectedwithRSVandFAvirus:95subjectsareincludedinthisstudy,whoaredividedintofourgroups:theFAgoup(FAtestedpositiveonly),theRSVgroup(RSVtestedpositiveonly),themixedinfectiongroup(bothFAandRSVtestedpositive)andage-matchedhealthycontrols.Bio-Plexsuspensionchiptechniqueorenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)wasusedtodetectthelevelsofsevencommoninflammatoryfactorsinfourgroups.ItmainlyincludesInterferon-γ(IFN-γ),Interleukin-2(IL-2),IL-4,IL-8,IL-1β,Transforminggrowthfactor-β(TGF-β),TNF-a;Wealsoanalyzedthecorrelationbetweenthelevelsofinflammatoryfactorsandtheseverityofthediseaseinthefourgroups.Results1.Thisstudyenrolled2160patientswhowereinfectedwithARIfromJanuary2010toDecember2016.Therewere760caseswhosevirusdetectionwerepositive,andthepositivedetectionratewas35.19%.TheRSVpositivedetectionratewashighest,followedbyFA,FB,ADV,PIV1,PIV2,andPIV3.Therewere42casesofmixedinfection,accountingfor5.52%.RSVwasmostcommoninmixedinfections.Thehighestdetectionrateofviralrespiratorypathogenwasingroupaged0~1yearsold,followedbygroupaged3~14yearsoldandgroupaged1~3yearsold.ThedetectionrateofRSVwasthehighestingroupaged0~1yearold,andthedetectionrateofFBwasthehighestingroupaged3~14yearold.Amongthe85neonates,25werepositiveforvirusdetection,withapositiverateof30.59%,mainlybyRSV.Intermsofseasonaldistribution,respiratoryviralinfectionsmainlyoccurredinwinter,andtheRSVdetectionrateswerehighestinthewinter,spring,andautumnseasons(atotalof368sampleswerepositive),andthedetectionrateofInf-Bwashighestinsummer.TheRSVdetectionratewashighestinchildrenwithwheezing,accountingfor47.41%ofpatientswithpositivedetectionofvirus.2.ThemeanageofMIXgroupwas21.71±0.84months,whichishigherthanthatofRSVgroupwas10.61±2.15months.Comparedwithclinicalcharacteristics,theincidenceV 英文摘要无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究offever,vomiting,anddyspneainthistwogroups,theincidenceoftheMIXgroupwassignificantlyhigherthanthatinRSVgroup.TheincidenceofcoughandnasalcongestionwassignificantlyhigherintheRSVgroupthanintheMIXgroup.Therewasnosignificantdifferenceintheincidenceofwheezingandpulmonaryralesbetweenthetwogroups;Intermofclinicaldiagnosis,20%ofMIXpatientshadseverepneumonia,whichwashigherthanRSV(6.67%)(P=0.026);intermofperipheralbloodroutineWBC(Leukocyte,WBC)count,neutrophilpercentage,plateletcount,MIXgroupandRSVgroupwerenotstatisticallydifferent.TheproportionofCRP(C-Reactiveprotein,CRP)increasedsimilarlyinbothgroups,buttheproportionofchildrenwithCRP>40mgwashigherinMIXgroupthaninRSVgroup;theincidenceofmyocardialdamageinMIXgroupwashigherthanthatinRSVgroup,butinbothgroups,therewasnosignificantdifferenceinheartfailure,respiratoryfailure,andliverfunctionimpairmentinchildren.Intermoftreatment,patientsacceptedwithintravenoususeofglucocorticoidsintheMIXgrouphadanlongerhospitalstaythantheRSVgroup.Therewasnostatisticaldifferencebetweenrespiratorysupport,oxygeninhalation,inhaledcorticosteroids,andinhaledbronchodilators.3.Atotalof95patientswereincludedinthisstudy.TheresultsshowedthatexpressionlevelofIL-1β,IL-8,TNF-α,andIFN-γincreasedinvariousdegreeinthreeinfectedgroups.IL-2didn’tincreaseintheRSVgroupandwasnotsignificantlyelevatedinthemixedinfectiongroup.TheexpressionofIL-1β、TNF-ɑandIL-8inthemixedinfectiongroupweresignificantlyhigher.Intherecoveryperiodofthedisease,IL-1β,TNF-ɑ,IL-8,andIFN-γalldecreasedsignificantly,butthelevelsofTNF-ɑandIFN-γwerestillsignificantlyhigherthanthoseofthehealthycontrolgroup.ExpressionofIL-4andTGF-βwerenotsignificantlyelevatedintheRSVgroup,theFAgroupandthemixedinfectiongroup,andtherewasnostatisticalsignificancebetweentheinfectedgroupandthehealthycontrolgroup.ConclusionsVI 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究英文摘要1.From2010to2016,theepidemicofsevenrespiratoryvirusesinWuxishowedasteadytrendoverall;InJanuary2013,theremaybeasmallepidemicofRSVinfection;RSVwasthemainpathogencausingacuterespiratoryinfectionsinwinterinchildrenaged0-1yearsoldinWuxi,whichclinicallymanifestsaswheezingdisease.2.InfectionmixedwithRSVandInf-Aispronetooccurinolderchildren,whichismorepronetomanifestsasfever,vomiting,diarrhea,dyspneaandothersymptoms,especiallyfever,severepneumonia.RSVInfectionmixedwithInf-Acanaggravatethecondition.TheproinflammatorycytokinesincreasedpredominantlyinchildreninfectedwithFAandRSV,IL-1βandTNF-ɑaccountsmainly.Keyworlds：Children，Respiratoryvirus，chinicalcharacteristics,mixedinfection，CytokinesWrittenby:XiaoliGeSupervisedby:XingFengVII 目录绪论....................................................................................................................................1第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学研究..................................8第二部分儿童呼吸道合胞病毒混合A型流感病毒临床特征分析.............................30第三部分呼吸道合胞病毒与甲型流感病毒混合感染患儿血清炎症因子的研究......42全文总结............................................................................................................................662创新点..................................................................................................................................63不足和展望..........................................................................................................................64综述..................................................................................................................................65英文缩写词表......................................................................................................................79攻读博士期间发表的论文..................................................................................................81致谢................................................................................................................................882 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究绪论绪论急性呼吸道感染具有相当高的发病率和死亡率，成为威胁儿童健康的最常见的常见的疾病之一[1]。儿童呼吸系统由于特殊的解剖结构及体内体液、细胞免疫功能发育不完善，因而更容易患呼吸道疾病，尤其以学龄前儿童发病最为常见。据统计平均每位患儿每年患普通呼吸道感染约6-10次[2]，给家庭生活带来很多的困扰，也占用了相当多的医疗资源。各种病毒和细菌均可引起呼吸道感染。全球大约每年有1.56亿肺炎患儿，其中大约3%1岁以下儿童因为病毒性下呼吸道感染而住院治疗[3]。儿童急性上呼吸道感染多由病毒感染多见，约占90%[4]。2岁以下儿童肺炎中，病毒性肺炎占86%，5岁以上也占37%[5]。由此可见，病毒已成为儿童急性呼吸道感染的重要病原体[6,7]。在人类历史中，病毒感染曾给我们留下惨痛经历，如1918-1919年的西班牙流感(H1N1)，波及全球约一半人口，发病率高达20-40%，造成了约2000-5000万人的死亡，病死率高达2.5-5%，远远超过在第一次世界大战中的死亡人数[8]；1957-1958年发源于我国南方的亚洲流感（H2N2），造成了约100万人的死亡[9]。可以肯定的是，无论是现在，还是将来，在相当长的一段时间内病毒仍将会是我们人类社会面临的重大挑战！目前最常见的儿童急性呼吸道感染病毒主要包括以下几种：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)、人腺病毒HDV(humanadenovirus，HDV)、副流感病毒(parainfluenzavirus，PIV)、人类博卡病毒(humanbocavirus,HBoV)、鼻病毒(humanrhinovirus,HRV)、人冠状病毒(humancoronavirus,HCoV)、偏肺病毒(metapneiimovirus,MPV)等。其中RSV、HRV、IFV、PIV和HDV已明确成为引起急性呼吸道感染的最常见病原体[6,7,10,11]。急性呼吸道感染大部分表现为上呼吸道感染，但是存在上呼吸道感染患儿，支气管炎、肺炎、中耳炎等发病率明显增加[12]，临床上需要加以重视。不同国家、地区、不同时期儿童ARI的病毒检出率及主要病毒种类有明显不同，可能与地理、气候、经济条件及检测水平的不同而有所差异[13,14]。湖南韶关地区儿童呼吸道病毒感染的病原体以IFV、HDV和HRV为主[15]。许丽丽等[16]对安徽地区9693例呼吸道感染患儿的病原体调查中，发现阳性病例3092例，总阳性率为31.9%，其中混合阳性为1068例，占阳性例数的34.5%；说明支原体、RSV是安徽地区儿童非1 绪论无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究典型病原体感染的主要病原体；甲型流感病毒、支原体混合感染比较普遍。石伟先等[17]则发现北京地区儿童急性上呼吸道感染最主要的病原体是IFV、RSV和HDV，并且随年龄、流行季节、月份的不同而具备一定的流行规律。胡兴文等[18]发现RSV是湖北武汉地区儿童呼吸道感染主要病原体；病毒感染有明显季节性特征，二月份是呼吸道病毒感染最强的月份；不同年龄对不同病毒有不同的易感性。不同的地区病毒总检出率差异较大，可能与地理环境、气候因素、病毒种类、试剂盒厂家不同等因素有关[19]。急性呼吸道感染有很高的发病率，但是大多数呼吸道病毒缺乏疫苗防治。抗生素临床上常用于防治小儿呼吸道感染性疾病，尤其在下呼吸感染患儿中相当常见。2017年李文敏等[20]的meta分析显示：在我国上呼吸道感染的儿童中，有高达90.6％的患儿使用了抗生素。而国外仅有15％～30％的儿童上呼吸道感染使用了抗生素。抗菌素对病毒引起的呼吸道感染无治疗作用，反而容易引起过敏、肝肾等脏器功能损害等不良反应，甚至可能发生二重感染，危害性较大。越来越多的家庭和医护人员开始关注抗生素的合理使用问题。明确本地区儿童呼吸道感染常见病原体的构成、熟悉其与患儿年龄、不同季节的关系；以及了解不同疾病与病毒之间的关系、各病毒感染典型的临床表现，对儿童急性呼吸道感染选择有针对性的预防及治疗措施十分重要，力争有“的”放矢、对因治疗。这样既可减少抗菌素的使用，减轻医疗资源的浪费，也可避免很多药物不良反应的发生。在国内，北京[21]、上海[22]、深圳[23]、广州[24]和苏州[25]均对各自城市的呼吸道病毒展开了大规模的调查。然而，中国其他地区儿童呼吸道病毒的流行病学研究缺少相应的报告。本研究通过较大样本的监测，经过统计学处理，一定程度上反映了无锡部分地区儿童ARI中七种呼吸道病毒腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(inf-A)、乙型流感病毒(inf-B)、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型(PIV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及呼吸道合胞病毒(RSV)）病原体的分布谱和流行特征，分析七种呼吸道病毒在上呼吸道感染、支气管炎、儿童肺炎和喘息发作的儿童中的分布情况，了解其与疾病种类、病情轻重之间的相关性；减少了那些未知病原体的ARI的比例，对呼吸道感染尽可能的做到“知己知彼”，弥补了医生个人经验性诊断和治疗的缺陷，减少滥用或误用抗菌素的几率，提高医疗资源的利用率。提高了对疾病的诊断治疗的及时性、合理性及有效性。2 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究绪论各种急性呼吸道感染均有较高的病毒混合感染率，这在国内外均有报道，而且混合感染好发于儿童[26]。王蓝鸽等[27]报道混合感染占阳性病例11.14%，其中IFV最高(68.5%)，RSV最低(54.5%)。混合感染患儿其临床症状更加严重、复杂，多表现为高热、剧烈咳嗽、气促、呼吸困难等，可导致呼吸衰竭、中毒性脑病、严重的水电解质紊乱、休克等情况出现，病死率明显增加。因此，总结混合感染的临床特征，可以早期识别和评估病情的严重程度，避免了过度和盲目治疗，增加诊治的针对性。人类体液免疫、细胞免疫系统到5～6岁才能发育成熟。5岁以下儿童由于体内免疫细胞功能和活性不成熟、Th2(Typehelp2)细胞因子不平衡、特异性多糖抗体缺乏、分泌型Ig(Immunoglobulin)A[28]缺乏等因素，导致儿童时期的各种免疫功能（包括固有免疫和适应性免疫）不健全，使这一时期的急性呼吸道感染发生率明显增加。新生儿时期由于没有接触抗原，也没有建立免疫记忆，对各种病原，包括病毒，甚至致病力很弱的细菌均有易感性。炎症相关细胞因子是免疫细胞分泌的一类具有重要的免疫调节作用的因子，往往通过自分泌或者旁分泌起作用，引发并放大慢性炎症反应。抑制性细胞因子则可以有效的调节感染所诱导的免疫平衡。目前最常见的促炎性细胞因子主要有IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、INF-γ等。抗炎性细胞因子主要有IL-4、IL-1受体拮抗剂(IL-Ira)、TGF-β等。免疫反应具有其复杂性，既有促炎症反应因子对炎症作用起到正性调节，也有抗炎症因子进行负性调节，每种炎症相关因子都通过不同的机制发挥抗炎、抑炎作用。目前抑制性细胞因子在婴幼儿呼吸道病毒感染中表达水平以及如何进行调节免疫平衡的作用仍不清楚。近年来，有研究显示，机体发生呼吸道合胞病毒感染后，天然免疫应答被启动，进而引发炎性细胞因子的表达异常，致使呼吸道局部的炎症反应加重，如IL-1β、TNF-α等。这两种细胞因子也已成为研究的热点。周仁江等[29]报道称TNF-α等炎性细胞因子在RSV感染的患儿血清中的表达水平明显高于正常对照组，建议可以作为评估毛细支气管炎病情的指标。流感患者的血清中可检测到促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-12等)及抗炎细胞因子(IL-10等)的表达水平显著上升。有研究结果[30,31]显示在轻、重症新型甲型H1N1流感患者的血清中，在患者尚处于疾病早期时，体内IL-1、IL-12、IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-5、IL-10、IL-I7、IL-23等细胞因子血清中的浓度均已有所上升。但是儿童呼吸道病毒混合感染时，血中相关的炎症分子的表达水平及如3 绪论无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究何调节免疫平衡鲜见报道。了解病毒感染时体内的炎性细胞因子表达水平变化后，可以通过细胞因子的检测了解疾病、通过调节这些细胞因子的水平来治疗疾病，临床已有成功案例。在国内，目前用细胞因子治疗最主要的病毒性疾病是慢性乙肝及慢性丙肝，所用的细胞因子是IFN-α。而对于儿童呼吸道病毒感染的细胞因子类药物的治疗尚未见报道。综上所述，我们进行了三个方面的研究：第一部分通过对2010年至2016年在无锡四家医院因急性呼吸道感染就诊的儿童进行多病原学的长达七年的连续监测，分析了无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学情况，试图揭示本地区的呼吸道病毒感染的流行病学特征，为临床防控提供理论依据。第二部分回顾性分析了inf-A混合RSV感染患儿的临床资料进行分析，进一步认识混合感染的临床特征，为早期识别混合感染提供一定的依据；第三部分通过检测RSV混合inf-A感染患儿血清中炎症相关细胞因子（IL-1β、IL-4、IL-2、IL-8、TGF-β、TNF-α、IFN-γ）的表达水平，结合其临床表现、治疗及转归情况，试图寻求混合感染状态下，体内细胞因子的表达水平及与临床可能存在的关系。寻求混合感染特异性细胞因子，以及为未来可能采取的细胞因子治疗提供理论依据。参考文献[1].MorikawaS,HiroiS,KaseT.Detectionofrespiratoryvirusesingarglespecimensofhealthychildren.JClinVirol2015;64:59-63.[2].LambertSB,AllenKM,DruceJD,etal.Communityepidemiologyofhumanmetapneumovirus,humancoronavirusNL63,andotherrespiratoryvirusesinhealthypreschool-agedchildrenusingparent-collectedspecimens.Pediatrics2007,120(4):e929-937.[3].TramutoF,MaidaCM,NapoliG,eta1.Burdenandviralaetiologyofinfluenza.1ikeillnessandacuterespiratoryinfectioninintensivecareunitsMicrobesInfect,2016，18(4):270—276.[4].JuvenT，MertsolaJ，WarisM，etal.Etiologyofcommunity-acquiredpneumoniain254hospitalizedchildren.PediatrInfectDisJ，2000,19：293-298.4 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究绪论[5]。桂永浩，薛辛东等。儿科学，人民卫生出版社，2015年第3版：210。[6].InqhAK,JainA,JainB,etal.Viralaetiologyofacutelowerrespiratorytractillnessinhospitalizedpaediatricpatientsofatertiaryhospitsl:Oneyearprospectivestudy[J].IndianJMedMicrobiol.2014,32(1):13-8.[7].谢正德，肖艳，刘春燕等，儿童急性下呼吸道感染病毒病原学监测.2007-2010[J].中华儿科杂志，2011,49(10):746-749.[8].周剑芳，杨磊，蓝雨等，1918/1919西班牙流感（H1N1）病原学概述.病毒学报2009，vol25（B05）：8-11.[9].杜宁，杨霄星，杨磊等，1957年亚洲流感（H2N2）病原学概述.病毒学报，2009，vol25(B05):12-16.[10].PaulinoRDS,BenegaMA,SantosKCDO,etal.DifferentialdiagnosisofrespiratoryvirusesbyusingrealtimeRT-PCRmethodology.RevInstMedTropSaoPaulo2013;55:432-432.[11].KwofieTB,AnaneYA,NkrumahB,etal.RespiratoryvirusesinchildrenhospitalizedforacutelowerrespiratorytractinfectioninGhana.VirolJ2012;9:78-78.[12].JainS,WilliamsDJ,ArnoldSR,etal.Community-AcquiredPneumoniaRequiringHospitalizationamongU.S.Children.NEnglJMed2015;372:835-845.[13].PerezruizM,PedrosacorralI,SanbonmatsugamezS,NavarromariJ.LaboratoryDetectionofRespiratoryVirusesbyAutomatedTechniques.OpenViro2012;6:151-159.[14].NohJY,SongJY,CheongHJ,etal.LaboratorySurveillanceofInfluenza-LikeIllnessinSevenTeachingHospitals,SouthKorea:2011-2012Season.PLoSOne2013;8:e64295.[15].徐亮，邱灿林，龚萍等.2010-2012年韶关市儿童呼吸道感染病毒病原学分析[J].热带医学杂志，2014,01:124-126.[16].许莉莉，程邦宁，刘慧娟等.9693例呼吸道感染患儿非典型病原体感染病原学检测结果分析[J].中华疾病控制杂志,2014,02:178-180.5 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第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学研究儿童急性呼吸道感染是影响儿童健康的公共问题，病毒是最常见的病原体。目前最常见的呼吸道病毒有RSV、Inf-A、Inf-B、PIV-Ⅰ、PIV-Ⅱ、PIV-Ⅲ、ADV及近年来发现的新型病毒：如偏肺病毒（Humanmetapneumovirus，hMPV）、博卡病毒（humanbocavirus，HBoV）等。各地区因地理环境、检测的病毒种类、检验方法、气候因素等原因，报道病毒阳性检出率差异较大。明确本地区病毒病原的构成，熟悉其与儿童年龄、季节的关系，以及了解不同疾病与病毒的关系，对疾病的防控具有深远的意义。目前，无锡地区暂无儿童呼吸道病毒的流行病学研究报告。本研究通过连续七年对无锡地区四家医院急性呼吸道感染患儿，应用直接免疫荧光法检测呼吸道分泌物中的RSV、Inf-A、Inf-B、PIV-Ⅰ,PIV-Ⅱ，PIV-Ⅲ及ADV，探讨不同年龄儿童急性呼吸道感染的病毒病原学构成及不同病毒感染的季节流行特征。第一章材料和方法1.研究对象：1.1自2010年开始，由无锡市第二人民医院（崇安区）儿科牵头，联合无锡市第九人民医院（滨湖区）、无锡市东亭社区医院（锡山区）和无锡市映山河儿童医院（崇安区）等共四家医院进行儿童急性呼吸道感染的七种常见病毒的检测。我们在2010年1月1日至2016年12月31日共七年期间，陆续发出了总共3800份调查表格，共回收到2674份表格，其中符合研究纳入标准且不符合排除标准的共2160例。各个医院的分布情况是：在无锡市第二人民医院发出了1500份，回收到表格1253份，符合纳入标准且不符合排除标准的1036例；在无锡市第九人民医院发出了1000份表格，回收到表格589例，符合纳入标准且不符合排除标准的436例；在无锡市东亭社区医院发出了300份有效表格，回收到表格176例，符合纳入标准且不符合排除标准的131例；在无锡市映山河儿童医院发出了1000份表格，回收到8 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分表格669份，其中符合纳入标准且不符合排除标准的557例（见表1）；2010到2016年期间各个医院每年收集到的标本分布如下：无锡市第二人民医院分别收集纳入研究的例数分别为128、146、152、162、159、139、157；无锡市第九人民医院的收集到的纳入研究的病例数分布为70、69、71、72、61、58、74；无锡市东亭社区医院的收集到的纳入研究的病例数分布为12、15、19、22、22、21、20；无锡市映山河儿童医院收集到的纳入研究的病例数分布为74、66、76、79、76、54、86。2010年1月至2016年12月在无锡市第二人民医院、无锡市第九人民医院、无锡市东亭社区医院、无锡市映山河妇女儿童医院诊治的门诊及住院儿童（≤14岁）呼吸道感染患者，共计2160例。其中男性1167例（54.03%），女性993例（45.97%）。包括：支气管炎、毛细支气管炎、肺炎、喘息性支气管炎、上呼吸道感染及其他。1.2纳入标准：根据《褚福棠实用儿科学》（第七版）的标准，具有急性呼吸道感染的患儿：必须具备急性感染（至少符合一项）合并呼吸道临床症状（至少一项）急性感染症状：发热(从发病开始有报告和记录)、白细胞（whitebloodcell，WBC）异常、寒战或体温降低(考虑年龄)等；呼吸道临床症状及体征：咽部不适，鼻塞，流涕，咳嗽，咳痰，呼吸急促，鼻、咽、喉充血水肿，肺部呼吸音异常(湿性啰音、干性啰音、哮鸣音)和胸痛、吸气三凹征阳性、青紫等。具体疾病诊断标准：（1）上呼吸道感染诊断标准：有发热、鼻塞、喷嚏、流涕、咳嗽、咽痒、食欲差等表现，查体见咽部充血，扁桃体肿大等。肺部呼吸音正常。（2）支气管炎诊断标准：有上述上呼吸道感染表现，咳嗽，有痰鸣，体检双肺呼吸音粗糙，可有不固定的、散在的干湿啰音，无气促、发绀。胸片显示正常，或肺纹理增粗，肺门阴影增深。（3）肺炎诊断标准：是在符合急性呼吸道感染的定义基础上同时具备以下表现：肺部闻及细湿啰音，或胸部X线片提示肺部有炎性改变。（4）重症肺炎：①全身中毒症状明显；②有其他脏器受累的症状如：急性心力衰竭、循环障碍、心肌功能不全、呼吸功能不全、中毒性脑病、败血症、严重水电解质紊乱等。所有的重症肺炎病例，均需经两位或两位以上主任医师确诊。9 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究（5）毛细支气管炎诊断标准：发病年龄2岁以下，有咳嗽、起病初期即有喘憋，体检以及X线检查可见肺气肿，无异物吸入、哮喘病史、百日咳以及结核等传染性疾病接触史。X线胸片显示肺气肿、支气管肺炎或毛细支气管炎表现。（6）新生儿呼吸道感染诊断标准：①临床表现：发热（或体温不升）、鼻塞、呻吟、流涕、青紫、吐沫、咳嗽、喉间痰鸣、呼吸急促、吸气三凹征阳性及呼吸暂停等；②肺部X线检查：两肺纹理增多、模糊，显示渗出影、肺气肿、肺不张、胸腔积液等改变。1.3排除标准：早产儿、先天性心脏病、免疫缺陷、传染性疾病或有明确的传染性疾病接触史、支气管肺发育不良、染色体异常、神经肌肉疾病、遗传代谢性疾病。1.4分组：1.4.1年龄分组：在纳入研究的2160例标本中，0～1岁（≤1岁）496例（22.96%），1～3岁（>1岁，≤3岁）709例（32.82%），3～14岁（>3岁，≤14岁）955例（44.21%）。其中0～1岁组新生儿85例（17.14%），早期新生儿12例，占新生儿总数的14.12%，晚期新生儿73例（85.88%）。所有年龄中，年龄最小5天，最大14岁。1.4.2季节分组：春季（3/4/5月），夏季（6/7/8月），秋季（9/10/11月），冬季（12/1/2月）。2.临床资料收集：2.1.在2009年七月份开始至十二月份，先后对所选的四家医院中的儿科所有医护人员进行相关培训，内容包括了项目介绍、纳入患者的选择标准、需要采集的流行病学信息、如何采集标本、以及标本的保存运输、到达实验室以后的标准检验流程、结果报告、各个单位信息的集中汇总管理、质量控制等，每个单位均指定一位副主任以上职称的医师作为项目负责人。2.2.制定表格：统一制定调查表，专门人员培训，如咽拭子取样，送检等，并收集患儿的临床资料。调查表内容：表1(1)一般情况：姓名、性别、年龄（新生儿具体到日龄）、就诊时间、发病天数、住院时间（住院者填写）；(2)临床诊断及症状：体温、咳嗽、咳痰（颜色）、声嘶、喘息、呼吸困难；(3)基础疾病：详细记录基础疾病起病、诊治情况，如先天性心脏病、遗传代谢10 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分病等；(4)呼吸道病原学检测：即呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，MP）、肺炎衣原体（chamydiaepneumonia，CP）和痰细菌培养；(5)其他实验室检查：血常规、血培养、淋巴细胞亚群、肺炎支原体/肺炎衣原体；(6)胸部X片表现；(7)治疗情况：吸氧、机械通气、丙种球蛋白、抗生素、强心利尿等；(8)转归：达到出院标准(无发热、呼吸困难及发绀，咳嗽好转或消失，胸部X线复查阴性或改善)、放弃治疗出院、死亡。11 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究年医院儿科呼吸道病毒研究对象资料（医生填写）编姓性年住床就发住基临实验室检查胸治转号名别龄院号诊病院础床片疗归号时天时疾诊间数间病断1.上感血常降钙血培咽拭病毒支原淋巴2.支气管炎规、素原养子/痰7项体、细胞3.肺炎CRP培养衣原亚群4.哮喘体以上研究得到无锡市第二人民医院伦理委员会、第九人民医院伦理委员会、无锡市东亭社区医院、无锡市映山河儿童医院伦理委员会的批准同意，经患儿家长同意并签署书面知情同意书。12 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分3.鼻咽拭子检测：3.1主要设备（1）生物安全柜苏净安泰BSC-130011B2（2）台式低温离心机THERMOS-16R（3）漩涡混合器上海沪西XW-80A（4）倒置荧光显微镜OLYMPUSIX51（5）37℃电热恒温培养箱上海精宏DK-600（6）超净工作台苏净集团AirTech公司（7）-80℃实验用冰箱日本SANYO公司（8）微量移液器：1ml、100µl、10µl德国Eppendorf公司（9）负压吸引器北京兴华仪器厂（10）无菌吸痰管苏州晶乐高分子医疗器械公司3.2主要试剂（1）呼吸道病毒七项检测试剂盒美国DiagnosticHybrids（2）MP核酸定量检测试剂盒中山大学达安基因股份有限公司（3）CP核酸定量检测试剂盒中山大学达安基因股份有限公司3.3实验方法3.3.1标本采集3.3.1.1鼻咽拭子标本采集:患儿在门诊就诊时、住院当天或次日清晨（尽量在入院后12小时内完成），由专职医护人员洗手、带口罩帽子以及佩戴医用无菌手套后进行操作，用一次性鼻咽拭子经鼻送入患儿鼻腔，于咽部以下采集0.1～0.5mL标本，置入无菌生理盐水管中，充分振荡混匀后立即送至本院检验科备检。如不能立即送检的标本，放置于-20±5℃环境保存后尽快送检。3.3.1.2血液采集每位入组患儿在门诊或入院后，在用药前由护士用安尔碘常规消毒2次，待安尔碘干燥后采集静脉血适量，立即送检血常规、CRP、血培养（血量2ml以上，新生儿1ml以上）、肝肾功能等。3.3.1.3胸片采集13 第一部分无锡儿部分地区童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究临床考虑支气管炎、肺炎、毛细支气管炎患儿均摄胸部X片。3.3.2实验步骤3.3.2.1.鼻咽拭子标本呼吸道病毒检测采用直接免疫荧光法检测呼吸道7种常见病毒，即RSV、ADV、inf-A、inf-B、PIVⅠ～Ⅲ。所有操作按照说明书要求进行，与试剂盒提供的阳性及阴性对照片作为对照。试剂盒由美国DiagnosticHybrids公司生产的（1）标本的处理：在放置鼻咽拭子的无菌离心管中，加入磷酸盐缓冲液(PBS)4～8ml，在旋涡混合器里震荡约三至五分钟，后离心十分钟。弃去上清液(如果有粘液也一并弃去)，在余下的沉淀物中，再次加入磷酸盐缓冲液4～8ml。震荡约三至五分钟后，用12000r/min离心约十分钟，再次弃去上清液。（2）制备细胞片：上述沉淀物中加入约200μL的磷酸盐缓冲液，混合成云雾状液体，点于多孔玻片上。冷风吹至干燥后用冷丙酮固定。在固定好待检细胞的多孔点样玻片上，分别加入试剂盒内的七种荧光标记的单克隆抗体检测抗原。然后用微量吸管吸取上述悬液15μl点于预先备好的玻璃片上。室温空气干燥后，再次用4℃丙酮固定大约十分钟。（3）免疫荧光试剂染色：将伊文斯蓝的荧光素标记的呼吸道病毒单克隆抗体约25～40ul（即抗SV、ADV、inf-A、inf-B、PIVⅠ～Ⅲ单克隆抗体）分别滴加于上述玻片上的七个孔内。接着用37℃孵育箱中连续孵育约三十分钟。用磷酸盐缓冲液洗片三次，再用蒸馏水洗片、风干。最后用pH8.15的甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。（4）结果判定：采用OLYMPUSIX51生产的倒置荧光显微镜观察，如细胞细胞核和（或）细胞胞浆内见苹果绿荧光，提示呼吸道病毒抗原阳性；如细胞无荧光，结果提示阴性，背景为淡蓝色；如果一个孔内细胞数大于二百个，且超过2%的细胞显示苹果绿荧光，则表示为某病毒感染。通常，腺病毒和流感病毒为细胞核染色或浆内染色，副流感病和呼吸道合胞病毒毒表示为细胞浆内染色。所有的染色照片均由试剂盒提供的阳性及阴性对照片作为对照。3.3.2.2血培养：由专门的接受培训的医护人员，于患儿抗生素治疗前采血。无菌条件下，采集血液标本约（1-2ml以上），注入儿童血培养瓶中。轻轻摇匀，放入14 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分血培养仪内培养；如果触发仪器报警，提示有细菌繁殖生长；其后在严格无菌条件下，将培养瓶内液体转入血平板培养。根据血平板上细菌生长特点，以及革兰染色结果，选择相应板条。使用VITEK-compact板条进行细菌鉴定以及相应的药敏试验。若观察五天，仍无细菌长出，则出报告：培养五日无菌生长。3.3.2.3预留的血清标本置于-80℃冰箱中保存备检。3.3.2.4痰培养：在门诊或入院后第二天清晨，取咽拭子或鼻咽部抽取物约0.1-0.5ml加入75µl痰消化液（含二硫酥糖醣0.1g、氯化钠0.78g、氯化钾0.02g、磷酸氢二钠0.112g、磷酸二氢钾0.02g）。放入35℃孵育箱内，孵育半小时。然后用灭菌接种环将痰液沾出，在严格无菌的环境下，接种在血琼脂培养皿或者巧克力培养皿（血培养皿中的培养基即为MH培养基，6%脱纤维羊血；巧克力培养皿以哥伦比亚琼脂为基，另外加入50mg/L万古霉素）。接种后将培养皿放在35℃的含有5-8%CO2孵育箱中，继续孵育十八至二十四小时。根据培养基上菌落特点、革兰染色、显微镜下观察、生化反应等方法鉴定细菌。同时做药敏试验。3.3.2.5.支原体检测：采用荧光定量PCR方法，主要检测鼻咽拭子中的支原体的DNA。以支原体DNA>1.0×103copies/ml为阳性。(1)标本处理：将鼻咽拭子标本在离心机上以12000rpm的速度离心约五分钟，留管底沉淀作为DNA提取标本，并将处理后的标本保存于-80℃冰箱中。（2）DNA提取：将标本于室温下解冻，然后加入50µlDNA提取液，充分混合后于100℃恒温处理十分钟。随后离心五分钟后备用。（3）PCR扩增：吸取上述液体上清液2µl，加入PCR反应管内约离心三十秒左右，放入仪器的样品槽。循环温度设置如下：93℃保持二分钟，93℃内30秒→55℃六十秒，示一个循环，93℃三十秒→55℃四十五秒共三十个循环。荧光采集时机选择在55℃四十秒后。荧光定量PCR的结果以Ct数值显示。（4）结果判断：PCR扩增反应结束后电脑自动分析结果：①若Ct数值≥39时，实验结果为阴性；②若Ct数值小于38时，实验结果为阳性；③若38≤Ct<39时，进行重复测定。3.3.2.6：胸片：采用siemens的Fusion系列摄片。15 第一部分无锡儿部分地区童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究4.质量控制4.1研究设计阶段本研究方案在查阅大量的资料和文献基础上，经反复论证，制定和修正，具有一定的针对性和可行性。所选医院分属无锡市三个辖区，一定程度上代表了无锡市儿童呼吸道病毒感染的病原学分布情况。所选医院均具有儿科门急诊和住院病房，均有完善的医院信息系统（HospitalInformationSystem，HIS）系统，包括门诊及住院电子病历系统、实验室信息管理系统（LaboratoryInformationManagementSystem，LIS）系统及影像归档和通信系统（PictureArchivingandCommunicationSystem，PACS）系统，为信息的准确采集、集中提供可靠依据。4.2现场调查和标本采集阶段对四家医院的主要医护人员进行培训。培训的内容主要是：目的、采集标本的时间和方法、相关疾病的诊断方法等，并要求规范完整填写调查表。4.3实验室检测阶段标本检测时，需严格遵循无菌原则，按照实验步骤进行；实验结束后，采用酒精和紫外线照射进行消毒，防止实验室污染。4.5资料处理阶段研究对象为合作单位的门诊和住院儿童，所有合作单位均有完善的医院信息系统。临床资料可以直接从系统中摘录，资料来源准确。数据釆用录入，并进行核查，保证数据库的准确性。5.0统计学分析采用SPSS13.0软件系统进行统计学分析，对各组间的分类变量采用χ检验或Fisher精确检验进行比较，P<0.05为有统计学意义差异。第二章结果1.研究概况：从2010年1月到2016年12月，共对2160例有ARI患儿的样本进行了调查。人群中位年龄为4.25岁。年龄最小为5天，最大为14岁。其中男性1167例(54.03%)，女性993例(45.97%)。呼吸道病毒检验阳性患儿的临床基本资料见下表。(表2)。各个医院收集到的样本数见(表3)16 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分表2.呼吸道病毒检验阳性患儿临床基本资料年份例数病毒检验阳性例数病例特征2010201120122013201420152016(n=2160)及占比(%)(n=284)(n=296)(n=318)(n=335)(n=318)(n=272)(n=337)性别男性1501611691721781471901167420(35.99%)女性134135149163140125147993340(34.24%)年龄0-<1岁74658285785557496243(48.99%)1-<3929710511610189109709206(29.06%)3-<14118134131134139128171955311(32.57%)病例来源门诊9596971041019398684164(21.58%)住院1892002212312171792391476596(40.38%)病毒检验阳性9111111113310989116760例数及占比(32.04%)(37.5%)(34.91%)(39.7%)(34.28%)(32.72%)(34.42%)(35.19%)(%)17 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究表3.2010年至2016年收集到的各参与单位的病例数汇总2010201120122013201420152016ABCABCABCABCABCABCABC无锡市第二人200135128200179146200162152200190162200172159200186139300229157民医院无锡市第九人1007270150856915086711509072150826115093581508174民医院无锡市东亭社301812301915402119502622502722503021503520区医院无锡市映山河100757415096661509976150106791501097615089541509586儿童医院总计430300284530379296540368318550412335550390318550398272550440337备注：A：发出表格数；B：收到表格数；C：纳入研究数18 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分2.七种呼吸道病毒感染的检出情况：2.1七种呼吸道病毒感染的总体检出率及各病毒分布2010年1月至2016年12月共收集呼吸道病毒感染患儿标本共2160例，七种760例病毒检出结果呈阳性，病毒阳性检出率为35.19%。七种呼吸道病毒中，RSV检出率最高，为370例(48.42%)，其余依次为：ADV82例(3.8%)，inf-A114例(5.28%)，inf-B115例(5.32%)，PIVⅠ29例(1.34%)，PIVⅡ39例(1.81%)，PIVⅢ13例(0.6%)。（见表3）表3不同年龄组7种呼吸道病毒的检出率例数年龄组别例数检出率在阳性标(%)本中占比病毒种类0-111-32**3-143*(%)inf-A22227011415%5.28%inf-B8510211515.13%5.32%PIVⅠ01019293.82%1.34%PIVⅡ15519395.13%1.81%PIVⅢ0013131.71%0.60%ADV1529388210.79%3.80%RSV1831355036848.42%17.04%阳性例数及占比243206311760(%)(48.99%)(29.06%)(32.57%)(35.19%)合计49670995521602.2七种呼吸道病毒混合感染情况：在我们的研究中发现42例混合感染患儿，占5.52%。其中RSV在混合感染中最为常见(88.1%，37/42)。RSV与inf-A混合感染23例、ADV与PIVⅡ混合感染5例、RSV与inf-B混合感染11例，RSV与ADV有混合感染3例，没有三个或者更多的混合感染。在年龄分布上以0-1岁多见。（见图1）19 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究RSinf-Vinf-BA2311图1：7种呼吸道病毒混合感染情况3.人群分布特征：3.1各年龄组中呼吸道病毒的检出情况本研究中，年龄分为三组，其中0-1岁组病毒呼吸道病原体检出率最高(243/496，48.99%)，其次为3~14岁组(311/955，32.57%)和1~3年组(206/709，29.06%（)见表2）。0-1岁及1-3岁患儿组中均是RSV的检出率最高，检出率分别是36.89%(183/496)、19.04%（135/709）。3-14岁组中inf-B的检出率最高，检出率为10.68%（102/955），PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ和ADV在不同年龄组间阳性检出率均较低，差别无统计学意义。结果见表4。表4.各年龄组呼吸道病毒感染检出情况呼吸道病毒0~1岁1~3岁3~14岁χ2Pinf-A2222706.000.05inf-B8510228.810.001PIVⅠ010192.510.29PIVⅡ155192.450.29PIVⅢ00134.800.09ADV1529380.320.85RSV1831355069.150.001合计24320631115.330.0013.2七种呼吸道病毒在不同性别中的分布情况男性患儿中检验阳性为420人，检出阳性率为35.99%，女性患儿中检验阳性为340人，检出阳性率为34.24%，此时χ2=2.12，P=0.15，男女性别在总检出阳性率上并无区别但RSV病毒感染男性多于女性，两组有统计学差异χ2=11.3，P=0.002<0.01。具体分布见表5。20 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分表5.七种呼吸道病毒感染在不同性别中的分布呼吸道病毒男性阳性男性检出率女性阳性女性检出χ2P率Inf-A584.98555.041.970.97Inf-B605.22595.401.850.92PIVⅠ131.00242.161.540.65PIVⅡ231.99161.441.750.84PIVⅢ70.7540.361.720.81ADV433.73433.967.510.08RSV21618.6613912.5911.30.002合计42036.3234030.949.140.153.3新生儿7种呼吸道病毒感染情况病毒病原学诊断：85例标本中病毒检测阳性25例，总阳性率30.59％。阳性标本中RSV阳性16例，占61.54％；ADV阳性4例，占15.38％；PIVⅡ阳性3例，占11.54％；inf-A型阳性1例，占3.85％；inf-B型阳性2例，占7.69％；PIVⅠ型、PIVⅢ型均未检出（表6）。表6.新生儿7种呼吸道病毒感染情况新生儿呼吸道病毒检出数各病毒占比阳性组占比（%）新生儿标本占比（%）inf-A13.851.18inf-B27.692.35PIVⅠ000PIVⅡ311.543.53PIVⅢ000ADV415.384.71RSV1661.5418.82阳性病例数26阳性率（%）30.59%4.时间与分布特征4.1呼吸道病毒感染的季节分布通过七年的分析，无锡地区每年呼吸道病毒的总检出率各不相同，从2010的32.04%上升到2013的39.7%（表2）。呼吸道病毒感染主要出现在冬季(图2)。RSV在春、秋、冬三季中检出率均是最高(共368份样本)。此外，我们分析了每种呼吸道病毒的季节变化(图2)。inf-B在夏季的检出率最高，PIVⅢ在四季的检出率均为最低，21 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究春季为2%，秋季为4%，夏、冬均未检出，结果见表7。四组之间具有显著性差异（P>0.05）。表7.呼吸道病毒感染的季节分布呼吸道病春夏秋冬χ2P毒(3/4/5月)(6/7/8月)(9/10/11月)(12/1/2月)Inf-A39719494.032.56Inf-B312419442.311.15PIVⅠ1261204.712.20PIVⅡ12012162.421.49PIVⅢ60603.501.32ADV25613443.981.72RSV13276315824.280.001合计2574814431125.640.001图2四季七种呼吸道病毒的分布图4.2连续七年七种呼吸道病毒检出的变化图。总体来说，七年随着季节的变化，呼吸道病毒检出率升高或者降低，但总体成平稳趋势。从图3中我们可以看出2011年12月份、2013年12月份及2016年1月份，呼吸道感染病人增加，但是2013年12月七种呼吸道病毒中检出率升高，而2011年12月及2016年1月份检出率无明显升高。整体阳性检出率高峰在每年的12月和22 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分1月。图3.2010至2016年期间呼吸道病毒检测的月份及频率分布5.疾病与病毒感染的相关性呼吸道病毒感染临床上可表现为支气管炎、喘息性支气管炎、毛细支气管炎和肺炎等。在所有与呼吸道病毒阳性的疾病中，肺炎比例最高，占感染总数43.95%的334例。其他相关疾病为支气管炎(16.32%例)和毛细支气管炎(18.16%例)。呼吸道合胞病毒(RSV)是引起肺炎最常见的病原体(170例)。760例患儿中285例为喘息患儿，其中RSV占病毒阳性数的47.41%（361/760）。见表8表8.不同疾病呼吸道7种病毒阳性检验分布情况支气管炎毛细支气管炎肺炎喘息性支气上呼吸道其他病毒种类管炎感染inf-A1364671326inf-B3205913013PIVⅠ00201300PIVⅡ7726000PIVⅢ070600ADV390137620RSV331181703370Total124138334792659(n=760)第三章讨论据世界卫生组织调查发现，每年约有190万儿童死于呼吸道感染及其相应并发症[1]，呼吸道感染性疾病已被列为导致全球5岁以下儿童死亡的第二大原因[2]。病毒23 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究是引起呼吸道感染的重要病原体[3,4]。明确呼吸道病毒的主要病原学组成，掌握其与性别、年龄、流行季节等的关系，有助于对儿童呼吸道感染采取积极有效地预防及治疗，可间接降低临床抗生素的滥用。本研究通过连续七年对在无锡市第二人民医院、无锡市东亭社区医院、无锡市第九人民医院、无锡市映山河妇女儿童医院救治的儿童的呼吸道病毒感染情况进行了研究。共采集了2160例呼吸道感染患儿的鼻咽部分泌物标本进行七种病毒检验，760例病毒检出结果呈阳性，病毒阳性检出率为35.19%。结果高于上海24.26%[4]、深圳23.21%[6]、山东31.50%[7]，但低于长沙67.8%[8]、北京70.3%[3]。在我们的研究中发现42例混合感染患儿，发生率为5.52%。低于上海38.10%[5]，北京的35.58%[3]，高于深圳的0.58%[5]。RSV在混合感染中最为常见，为88.1%（37/42）。两种病毒感染发生在一小部分儿童身上，这与之前在澳大利亚维多利亚进行的研究相似[9]。不同地区病毒总检出率差异较大，可能与不同的地理环境、气候特征等因素相关，病毒的总检出率与月平均气温、风速可能相关[10]；当然也可能与不同地区检测检验试剂盒同、病毒检测方法（如分子生物学技术、免疫荧光技术等）不同，这些因素也会导致病毒检出率有差异。本研究中，各病毒总阳性检出率从高到低依次RSV阳性率最高，感染370例(48.42%)，其余依次为：inf-A(5.28%)、inf-B(5.32%)、ADV(3.8%)、PIVⅠ(1.34%)、PIVⅡ(1.81%)、PIVⅢ(0.6%)。显示RSV是引起无锡地区儿童急性呼吸道感染最常见的病毒病原体，与目前国内外研究基本一致[7，8，11，12]。应作为本地区主要的防治重点。但国内也有报道称儿童急性呼吸道感染主要的病原体是流感病毒，差异产生的原因可能与使用的检测试剂、方法不同、地域差异等因素有关[13]。不同年龄段，病毒的总阳性检出率也不同。本研究中0~1岁组病毒呼吸道病原体检出率最高(243/496；48.99%)，其次为3~14岁组(311/955；32.57%)和1~3年组(206/709；29.06%)。三组之间具有显著性差异（p<0.05）。在0~1岁阶段的患儿中，呼吸道病毒呈现高发趋势，婴幼儿发病率高可能与婴幼儿特殊的呼吸道解剖结构，细胞免疫、体液免疫功能尚未成熟，气道分泌物中缺少SIgA等因素有关。婴幼儿身体抵抗力低，容易感染呼吸道病毒[14]，这个也与国内很多的研究结果是一致的[14,15]。因此，0~1岁儿童应重点预防呼吸道感染，尤其是病毒感染。在1~3岁的儿童的检出24 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分率略低于0~1岁，分析原因是可能是该阶段儿童免疫力在逐渐增加，未上幼儿园，人群聚集机会少，减少了呼吸道感染的几率。但3~14组相对1~3岁组，呼吸道病毒感染的阳性又呈现上升，分析原因是该阶段儿童已步入学校，尽管免疫力较婴幼儿增加，儿童聚集及交流的机会增加，导致学生间的病毒传播几率增加。因此，同时也应加强入学儿童的呼吸道病毒防控工作。不同的呼吸道病毒与年龄有很强的相关性，0~1岁及1~3岁患儿组中均是RSV的检出率最高，检出率分别是36.89%(183/496)、19.04%（135/709）。3~14岁组中inf-B的检出率最高，检出率为10.68%（102/955）。RSV在小年龄中发病率明显增加，最高可高达50%[16-18]，小婴儿对RSV有更高的易感性。建议应将0~1岁患儿作为防控的重点，如有先天性免疫缺陷或基础疾病的患儿应早期接种疫苗。此外，本研究的ADV检出率为3.8%，高于其他研究[19]。然而，inf-A、inf-B和PIV病毒的检出率低于其他研究[20，21]。这种差异可能是与人口、地理区域和社会经济地位等因素有关。新生儿由于免疫功能暂时低下更容易发生呼吸道感染。本研究显示，新生儿呼吸道七种病毒感染总阳性率为30.59%。阳性标本中RSV阳性占61.54%；其次为ADV（15.38%）、PIVⅡ（11.54%）、inf-B型（7.69%）、inf-A型（3.85%）。RSV仍为本地区新生儿急性呼吸道感染的首位致病病毒，与国内报道一致。RSV已是国内外新生儿呼吸道病毒感染最重要的病原体，一项研究表明新生儿病毒感染肺炎中，RSV引起的肺炎占81%[22]。新生儿RSV感染的传染性很强，院内继发RSV感染可高达30%-50%[23]，因此，在RSV流行的季节里，一旦新生儿出现疑似呼吸道症状，应及时隔离并完善病原体检出，特别是在散发季节也要保持高度警惕[24]。不同的呼吸道病毒在不同的季节的流行特点也不相同[25]。七种呼吸道病毒中RSV在春、秋、冬三季中检出率均是最高(368份样本)。inf-B在夏季的检出率最高，且以大年龄儿童为主。PIVⅢ在四季的检出率均为最低，春季为2%，秋季为4%，夏、冬均未检出。RSV在冬季阳性检出率最高，可能与无锡所处地区的气候有关。无锡位于中国的东部地区，河流众多，湿度大，冬季以湿冷气候为主，而且室内外温差大，屋内空气不流通，导致呼吸道病毒感染多发。上述情况提醒季节性预防有重要意义。本地区冬季是呼吸道病毒感染的高发季节，与文献报道一致[26]，其次是春季。25 第一部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究季节间阳性检出率差别有统计学意义（P<0.001），提示气候因素对病毒检出率影响较大。从七年监测的趋势图中可以看出，无锡地区七种呼吸道病毒基本平稳，但2011年12月份、2013年12月份及2016年1月份，呼吸道感染病人增加。2013年12月七种呼吸道病毒中检出率升高，主要以RSV感染为主，考虑有2013年12月可能有RSV感染小流行。春季因呼吸道症状来就诊人数是最多的，可能与春季花粉、粉尘等各种过敏因素有关[27]。因此尽早对患儿进行呼吸道病原体的检测，可以减少因过敏引起的反复咳嗽、鼻塞、流涕等呼吸道症状患儿的误诊率。从而有助于患儿得到及时、准确的诊断和治疗。近年来，儿童喘息性疾病的发病率明显增高，呼吸道病毒感染是最主要的致病因素之一。本研究760例患儿中285例为喘息性疾病的患儿，病毒总阳性率达47.37%，明显高于其他呼吸道感染患儿。其中RSV占病毒阳性数的47.41%（361/760），是最常见的病毒病原体；病毒感染后可能发生感染性炎症和变态反应性炎症，导致了哮喘的风险增加[28]。鉴于各类病毒所导致的呼吸道疾病缺乏特异的临床表现，因此了解其在本地区的流行病学特征并且早期采取相应的预防和隔离措施显得至关重要，我们的数据为无锡地区的儿童呼吸道感染情况提供了病原学资料，在指导临床疾病的预防及治疗方面有重要意义。第四章结论ARI是影响全世界儿童健康的重大问题，其主要病原体为病毒感染。我们通过在无锡部分地区进行的连续七年的流行病学研究得出以下结论：1.无锡市地区七种呼吸道病毒总阳性率为30.59%，其中以RSV感染居多。2.RSV仍是一岁以下患儿感染的主要病原体，其流行季节在冬季。3.七年来，无锡地区七种呼吸道病毒感染趋势基本平稳，但2013年12月可能出现过RSV感染小流行。4.呼吸道病毒感染后住院的患儿主要表现为喘息性疾病，尤其以RSV感染引发喘息性疾病居多。26 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第一部分参考文献[1]MulhollandK.Globalburdenofacuterespiratoryinfectionsinchildren:implicationsforinterventions.PediatrPulmonol2003,36:469-74[2]BryceJ,Boschi-PintoC,ShibuyaK,BlackRE.WHOestimatesofthecausesofdeathinchildren.Lancet2005,365:1147–52[3]KhamrinP,ThongprachumA,ShimizuH,etal.Detectionofhumanbocavirus1and2fromchildrenwithacutegastroenteritisinJapan[J].MedVirol,2012,84(6):901-905.[4]MoriyamaY,HamadaH,OkadaM,etal.Distinctiveclinicalfeaturesofhumanbocavirusinchildrenyoungerthan2years[J].EurJPediatr,2010,169(9):1087-1092.[5]胡骏，宁晓小，张雪清，高淑芳，王蕾．189例呼吸道病毒感染患儿联合C反应蛋白检测的临床意义[J].国际医学检验杂志，2013,34(7):796-796.[6]王和平，郑跃杰，邓继岿，王文建，刘萍，王莉，黄丽，白大明．深圳市儿童医院住院儿童常见呼吸道病毒病原学分析[J].临床和实验医学杂志，2013,12(21):1722-1724.[7]马燕，于翠香，273例急性呼吸道感染患儿呼吸道病毒抗原检测结果及分析[J].山东医药，2012,52(15):75-76.[8]李梨平，赖源，易思思，孙开胜，朱纯华．长沙地区儿童急性呼吸道感染病毒病原学分析[J].实用预防医学，2013,20(7):876-878.[9]DruceJ,TranT,KellyH,etal.LaboratorydiagnosisandsurveillanceofhumanrespiratoryvirusesbyPCRinVictoria,Australia,2002-2003.JMedVirol2005,75:122-129.[10]DijkmanR,KoekkoekSM,MolenkampR,eta1.Humanbocaviruscanbeculturedindifferentiatedhumanairwayepithelialcells[J].JVirol.2009,83(15):7739-7748.[11]InqhAK,JainA,JainB,etal.Viralaetiologyofacutelowerrespiratorytractillnessinhospitalizedpaediatricpatientsofatertiaryhospitsl:Oneyearprospectivestudy[J].IndianJMedMicrobiol.2014Jan-Mar,32(1):13-8.[12]谢正德，肖艳，刘春燕，胡英惠，幺远，杨燕，钱素云，耿荣，王健伟，申昆玲.儿童急性下呼吸道感染病毒病原学监测2007-2010[J].中华儿科杂志，27 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第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分儿童呼吸道合胞病毒混合A型流感病毒临床特征分析儿童急性呼吸道感染是最常见的感染性疾病之一，具有较高的发病率和致死率[1]。近年来，由于检测技术的不断提高，多种病原菌混合感染的病例并不少见，且病毒感染占优势[2]。患儿年龄越小，混合感染率越高、种类也越多[3]。daSilva等[4]的研究中提示混合感染中多为呼吸道合胞病毒（RSV）混合人鼻病毒（HRV）或人偏肺病毒（HMPV）等。Brand等[5]发现RSV混合HRV为最常见的混合感染，其检出率为41%。而在我们的研究中，发现本地区主要以RSV混合inf-A为主。这些研究显示，多种病毒混合感染在临床中较为常见，且RSV最易混合其他的病毒感染。呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿呼吸道感染的最重要的病毒病原体之一。全世界范围，每年大约有三百四十万5岁以下儿童因RSV感染而需要住院治疗，由于各国家医疗水平发展不均衡，其中有6万-19万患儿由于呼吸道感染而发生死亡[6]。RSV感染可以引起急性上呼吸道感染、急性毛细支气管炎、重症肺炎等，有的甚至需要进入儿童重症监护室（PICU）治疗[7,8]。大量的研究表明，年龄与RSV感染有密切的相关性，越小的婴幼儿更容易发展为重症RSV感染[9-12]。A型流感病毒感染可导致人类和动物的急性上呼吸道感染，病毒的快速传播以及较高的发病率和致死率给公共健康造成了巨大的威胁。RSV混合inf-A病毒感染临床特征的研究目前暂无相关报道。关于多种病毒混合感染产生的原因及其对临床的影响，国内外做了很多的研究。一些研究表明，混合感染会加重疾病的严重程度[13-16]；也有一些研究[17，18]认为混合感染后反而临床病情减轻；还有一些研究认为[19，20，21]多重病毒混合感染与病情的轻重无明显相关性。混合感染与疾病严重程度的相关性，目前仍未有一致的结论。本研究将RSV、inf-A混合感染与RSV单独感染患儿的临床特征进行比较分析，寻求早期判别RSV、inf-A混合感染的特征性临床表现。为早期评估病情、及时采取干预措施、减轻病情、降低死亡率寻找对策。30 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分第一章材料与方法材料一、研究对象对2010年1月至2016年12月期间，因急性呼吸道感染入住无锡市第二人民医院年龄＜5岁的RSV、inf-A混合感染（MIX组）20例患儿为研究对象。并对其临床资料进行回顾性分析。选取同期因呼吸道感染住院治疗的30例（年龄<5岁）RSV感染患儿（RSV组）作为对照组。入选标准：1.MIX组入选病例需符合以下条件：（1）诊断为急性呼吸道感染（诊断标准同第一部分）；（2）鼻咽拭子检测A型流感病毒及呼吸道合胞病毒阳性；（3）病程中无其他细菌和病毒感染的相应依据（入组病人同时完善血培养、支原体、衣原体检测，以排除其他病原体合并感染）。2.RSV组入选病例需符合：（1）急性呼吸道感染（诊断标准同第一部分）；（2）鼻咽拭子检测呼吸道合胞病毒阳性；（3）病程中无其他细菌和病毒感染的相应依据（入组病人同时完善血培养、支原体、衣原体检测，以排除其他病原体合并感染）。根据《褚福棠实用儿科学》（第七版）[22]内容相关诊断如下：（1）上呼吸道感染诊断标准：同第一部分。（2）支气管炎诊断标准：同第一部分。（3）肺炎诊断标准：同第一部分。（4）重症肺炎诊断标准：同第一部分。（5）毛细支气管炎诊断标准：同第一部分。上述研究得到南京医科大学附属第二人民医院伦理委员会批准同意，并且和患儿家长沟通，同意后，双方签订知情同意书。二、主要实验试剂及设备主要试剂1.病毒快诊试剂盒美国DIAGNOSTICHYBRIDS公司2.MP核酸定量检测试剂盒中山大学达安基因股份有限公司31 第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究3.CP核酸定量检测试剂盒中山大学达安基因股份有限公司主要设备1.超净工作台苏净集团AirTech公司2.-80℃冰箱日本SANYO公司3.台式离心THERMOS-16R4.倒置荧光显微镜日本OLYMPUSIX515.电泳仪美国BIO-RAD公司6.生物安全柜苏净安泰BSC-130011B27.台式离心THERMOS-16R8.漩涡混合器上海沪西XW-80A9.37℃电热恒温培养箱上海精宏DK-600方法一、标本采集1.鼻咽拭子采集：患儿在住院当天或次日清晨（入院十二小时内），由专职医护人员采集鼻咽拭子一份，具体操作同第一部分。2.血清采集：每位入组患儿入院后立即采集静脉血4-5ml，（采静脉血过程同第一部分），立即送检血常规、CRP(C-Reactiveprotein，CRP)、血生化、血培养等检查。二、病原学检测1.鼻咽拭子标本呼吸道病毒检测采用直接免疫荧光法检测呼吸道七种常见病毒，即呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，RSV），腺病毒（adenovirus，ADV），流感病毒A、B型（influenzavirustypeAandB，inf-A和inf-B），副流感病毒1、2、3型(parainfluenzavirustypeⅠ～Ⅲ，PIVⅠ～Ⅲ)。按照说明书要求进行操作，严格按照试剂盒内做好对照。试剂盒由美国DiagnosticHybrids公司生产的。（具体操作同第一部分）2.血培养：严格在无菌条件下采取血标本放入儿童血培养培养瓶中送检。实验室32 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分具体操作步骤同第一部分。3.痰培养：在门诊或入院后第2天清晨（尽量在抗生素使用前），取痰液0.1-0.5ml加入75µl痰消化液，送检。实验室具体操作步骤同第一部分。4.支原体检测：采用荧光定量PCR方法检测鼻咽拭子中的支原体的DNA，送检后，其具体操作步骤同第一部分。5.胸片：采用siemens的Fusion系列摄片。三、临床资料统计采用回顾性分析法，对入组患儿通过门诊及住院病历系统查阅病史。收集和整理一般情况、临床症状及体征、相应的实验室检查、住院天数、有无既往史等临床资料，进行登记统计。四、统计学分析所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计学分析。计数资料以百分比或率表示，组间比较采用2检验。正态分布计量资料以（x±SD）表示；两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。第二章结果一、MIX组与RSV组一般资料经过血培养、支原体检测等排除合并支原体、细菌等病原体感染情况下，MIX组共入组20例患儿，其中男12例、女8例；RSV组30例患儿，其中男16例、女14例，两组患儿性别比例无统计学差异。MIX组平均年龄21.71±0.84月，RSV组的平均年龄为10.61±2.15月，MIX组患儿年龄明显大于RSV组患儿，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1表1MIX组与RSV组患儿年龄及性别比较一般情况MIX组（n=20）RSV组（n=30）统计量2/ZP性别（男/女）12/816/142=1.2100.750年龄（月）21.71±0.8410.61±2.15Z=-3.7920.000（二）MIX组与RSV组临床特征比较从临床特征来比较，两组患儿均有不同程度发热，但MIX组患儿100%发生高热，33 第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究其发生率明显高于RSV组患儿的33.33%（P=0.005）。RSV组患儿96.67%发生咳嗽，明显高于MIX组75%（P=0.026）。RSV组53.33%患儿发生鼻塞，高于MIX组的20%（P=0.050）。MIX组呕吐、呼吸困难的发生较RSV组多（P值均>0.05）。两组患儿喘息、肺部啰音等表现发生率无明显差异。从临床诊断比较，MIX组20%发生重症肺炎，高于RSV（6.67%）（P=0.026）。急性上呼吸道感染、急性支气管炎、毛细支气管炎、肺炎的发生率两组间无统计学差异。见表2表2MIX组与RSV组患儿临床特征比较临床特征MIX组（n=20）RSV组（n=30）统计量2P临床症状、体征咳嗽(%)15(75.00)29(96.67)2=5.1150.026喘息(%)13(65.00)16(53.33)2=1.4930.372发热(%)20(100.00)10(33.33)2=8.1290.005鼻塞/流涕(%)5(20.00)16(53.33)2=5.9940.050呕吐/腹泻(%)9(45.00)5(16.67)2=7.3800.019呼吸困难(%)11(55.00)8(26.67)2=5.1150.026肺部啰音(%)13(65.00)24(80.00)2=1.3940.510临床诊断（%）急性上呼吸道感染3(15.00)2(6.67)2=1.2730.417急性支气管炎5(20.00)7(23.33)2=0.9370.487毛细支气管炎6(30.00)15(50)2=0.2130.901肺炎2(10.00)4(13.33)2=2.2580.207重症肺炎4(20.00)2(6.67)2=5.1150.026（三）实验室检查外周血常规中WBC计数、中性粒细胞百分数、血小板计数MIX组与RSV组均无统计学差异（P值均>0.05）。两组患儿CRP升高比例基本相仿，但CRP＞40mg/L的患儿比例MIX组占40.00%，而RSV组占10.00%，有统计学差异（P=0.002）。静脉血ALT异常升高者MIX组占20.00%，RSV组占3.33%，两组间有统计学差异（P=0.031）。MIX组CK-MB>25U/L检出为41.67%，均明显高于RSV组的16.67%（P=0.028）。见表334 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分表3MIX组和RSV组患儿实验室检查比较实验室检查MIX组（n=20）RSV组（n=30）统计量2/ZPWBC（×109）9.4±0.847.30±3.71Z=-1.6500.099N（%）72.1±10.456.4±32.9Z=-0.1420.887PLT（×109）292±108297±124Z=-0.0980.922CRP(>8mg/L)15/20（75.00%）20/30（66.67%）2=0.0730.815CRP(>40mg/L)8/20（40.00%）3/30（10.00%）2=9.3670.002ALT（>40U/L）4/20（20.00%）1/30（3.33%）2=5.1760.031CK-MB（>25U/L）5/20（41.67%）5/30（16.67%）2=5.0660.028（四）肺内外并发症MIX组有25.00%的患儿出现心肌损害高于RSV组的10.00%（P=0.047）。但两组患儿心力衰竭、呼吸衰竭及肝功能损害表现等无明显差异。见表4表4MIX组和RSV组患儿肺内外并发症比较肺内外并发症MIX组（n=20）RSV组（n=30）统计量2P心力衰竭2（10.00%）4（13.33%）2=0.8300.660呼吸衰竭4（20.00%）5（16.67%）2=1.7810.327肝功能损害3（15.00%）4（13.13%）2=0.8300.660心肌损害5（25.00%）3（10.00%）2=4.4530.047（五）治疗措施及平均住院天数MIX组患儿35%静脉使用糖皮质激素，明显高于RSV组13.33%（P=0.000）。平均住院时间MIX患儿为10.25±3.03天，RSV患儿为7.04±1.23天（P=0.000），两组间有统计学差异。而在呼吸支持、吸氧、吸入糖皮质激素、吸入支气管扩张剂间两组无统计学差异。见表5表5MIX组与RSV组患儿治疗效果比较治疗MIX组（n=20）RSV组（n=30）统计量2/ZP吸氧7（35.00%）8（26.67%）2=0.9370.487呼吸支持4（20.00%）5（16.67%）2=0.0001.000吸入糖皮质激素18（90.00%）26（86.67%）2=1.7810.327静脉激素7（35.00%）4（13.3%）2=41.7360.000吸入支扩剂14（70.00%）20（66.67%）2=0.7590.533平均住院天数10.25±3.037.04±1.23Z=-7.9440.00035 第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三章讨论病毒是儿童尤其是婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，各种病毒的流行有其特点。大量的研究[24]表明病毒感染与年龄相关，随着年龄的增长病毒感染呈下降的趋势。儿童由于免疫功能发育不全等因素，更容易发生混合感染。我们的研究中共发现42例混合感染患儿，占5.52%（42/730）。其中RSV在混合感染中最为常见(88.1%，37/42)，年龄分布上以0~1岁多见。这与Brand[5]、daSilva[4]等的研究相符。但在混合感染的检出率方面，却有较大差异。刘春艳[25]、石伟先[26]、邹明[27]等采用多重RT-PCR法对急性上呼吸道感染进行常见呼吸道病毒核酸检测，结果病毒混合感染率分别为17.8%、6.3%和2.81%。李璐等[28]对采用间接免疫荧光法得出混合感染率为0.8％。daSilva等[8]采用实时PCR法研究急性下呼吸道感染患儿，发现其混合感染率约56%。各个研究得出的检出率差异比较大，我们推测可能与检测方法灵敏度不同、地理位置、季节、样本种类等因素不同有关。本研究显示，MIX组与RSV组患儿男女发病比例无明显差别，但混合感染组年龄明显高于RSV组（P=0.000）。与Martin等[17]的研究相符，他们发现6~23月龄的患儿容易发生混合感染，单纯感染多发生于5月龄以下的患儿。与谢正德[3]等的研究患儿年龄越小，免疫功能发育不成熟，混合感染率越高、种类越多不符。考虑可能与我们研究病毒种类的不同、小婴儿发生的是初次感染，而年龄偏大的儿童可能发生二次感染等因素有关。MIX组患儿更易出现发热症状，而RSV组更易表现为咳嗽、鼻塞、流涕，有统计学差异。这可能与混合感染患儿体内的“细胞因子风暴”有关。当机体遇到感染、烫伤等情况后，诱发了体内免疫系统的激活，释放了大量的炎性介质[29](包括细胞因子、氧自由基、凝血因子等)。而在混合感染的初期，病毒诱导天然免疫系统激活，产生了大量的促炎细胞因子，如高表达的IL-1、IL-6、IL-12和IL-23，而临床上主要表现为发热等症状相关[30,31]。因此，如RSV感染患儿临床上出现高热、发热时间长，应警惕合并感染可能。另一方面也推测inf-A易发生全身感染。对于混合感染是否与病情严重程度有关，目前尚无定论。我们的研究中，MIX组静脉使用糖皮质激素、平均住院天数、心肌损害的发生率较RSV组明显升高，有统计学差异。表明RSV混合inf-A病毒感染后，可能激发了体内炎症反应的过程，从36 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分而加重了病情的严重程度。Paran-hos-Baccalà等[13]的研究发现婴幼儿混合感染后，病情明显加重，入住PICU的几率明显增加，是单纯感染的三倍左右。Arruda等[14]发现RSV混合感染后，患儿的平均住院天数要明显高于RSV单纯感染。Harada等[15]发现RSV混合感染后，中重度肺炎的发病率明显增加。Calvo等[32]、Aberle等[33]、Richard等[34]一些国外研究也证实了这一点。但另一些研究却认为，混合感染反而减轻了病情的严重程度。Martin等[17]的研究提示，单纯一种病毒感染后，其住院时间、需氧情况、和进入ICU病房的几率比混合感染风险更高。推测原因可能是因为小年龄组RSV首次感染，而混合感染多发生在年龄偏大儿童组，体内已经有相应抗体有关。Papenburg等[18]则发现RSV与HMPV的混合感染反而减轻病情，考虑可能在体内在感染病毒后，呼吸道上皮产生一定的免疫应答；这时当另一种病毒再感染时，体内出现了免疫抑制，抑制了一定的免疫损害。而Gagliardi[23]、Nascimento[20]、Canducci等[35]、DePaulisM等[36]发现混合感染不会加重或者减轻病情的严重程度，两者并无相关性。国内Wei等[21]的研究也说明了这一点，他们通过研究呼吸道单纯病原体感染与混合感染的患肺炎、重症肺炎的风险及进入ICU方面的几率，发现两者无统计学差异。混合感染对疾病严重程度的影响，目前仍未有一致的结论。究其原因考虑临床上影响患者病情严重程度的因素非常复杂，如自身的免疫状态、有无潜在疾病、患者年龄、当地的治疗水平等。各个临床研究中很难将其标准化，最后可导致结果可能会出现不同。病原体入侵机体后，会激发体内炎症反应的发生。白细胞首先穿过毛细血管壁，进入到病菌入侵部位，包围﹑吞噬病原体。引起WBC升高的常见原因有炎症、应激等，临床上WBC的增高程度通常与感染病原体的种类、部位和机体个体间差异密切相关[37、38]。CRP可以激活补体和单核-巨噬细胞系统，协助将病原体清除。CRP的浓度与组织损伤及炎症反应关系密切[39]。临床上血常规、CRP是最常见的炎症检查手段。临床上常用外周血白细胞计数、CRP高低来反映机体感染、发生炎症的程度。我们的研究显示MIX组外周血CRP>40mg/L患儿的比例明显高于RSV组，但MIX组患儿WBC计数、中性粒细胞百分数、血小板计数与RSV组均无统计学差异。提示混合感染后炎症反应增强，当RSV患儿CRP>40mg/L时需警惕合并其他感染的可能。RSV混合inf-A感染患儿由于病毒的直接侵入、体内产生细胞因子、自身免疫反37 第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究应等因素，可能会加重宿主的肺外损害。意大利学者关于RSV、hBoV和RV的一份研究报告指出，RSV、hBoV混合感染后临床严重度评分远远高于RSV、RV及HBoV单一感染组，更容易发生其他脏器损害。本研究中MIX组患儿发生心肌损害要明显高于RSV患儿，但两组患儿心力衰竭、呼吸衰竭及肝功能损害表现等无明显差异。综上所述，呼吸道合胞病毒混合A型流感病毒易发生于较大年龄儿童、更易出现发热、呕吐、腹泻、呼吸困难等症状，尤其发热、重症肺炎的发生率高。外周血CRP>40mg/L的比例高，心肌易受损，住院时间长。提示RSV混合inf-A感染易加重病情。目前引起混合感染的原因至今还未完全明了，但仍考虑与感染及感染后炎症反应密切相关。在本研究的第三部分我们将探讨混合感染患儿体内的炎症因子水平，为进一步分子机制的研究提供一定的依据。本研究初步获得了呼吸道合胞病毒混合A型流感病毒感染患儿的临床特征，呼吸道合胞病毒感染后，如出现高热、CRP升高等症状，需高度警惕混合感染可能。同时患儿混合感染后，容易加重病情。但由于本研究是单中心研究，病例数少，仍需要进一步多中心较大样本研究证实。参考文献[1]BrvceJ,Boschi-PintoC,ShihuyaK,etal.WHOestimatesofthecauseofdeathinchildren[J].Lancet,2005,365(9465):1147-1152.[2]WingM.Viraletiologyinchildrenwithacuterespiratorytractinfection[J].ChinJChildHealthCare，11(2):117-118.[3]XieZD,XiaoY,LiuCY,etal.Threeyearssurveillanceofviraletiologyofacutelowerrespiratorytractinfectioninchildrenfrom2007to2010[J].ChinJPediatr,2011,49(10):745-749.[4]daSilvaER,PitrezMC,ArrudaE,etal.Severelowerrespiratorytractinfectionininfantsandtoddlersfromanon-affluentpopulation:viraletiologyandco-detectionasriskfactors[J].BMCInfectDis,2013,13(41):1-8.[5]BrandHK,doGrootR,GalamaJM,etal.Infectionwithmultiplevirusesisnotassociatedwithincreaseddiseaseseverityinchildrenwithbronchiolitis[J].38 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第二部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究respiratorysyncytialvirus?[J].PediatrInfectDisJ,2013,32(5):441-445.[16]SemplcMG,CowcllA,DovcW,etal.Dualinfectionofinfantsbyhumanmetapneumovirusandrespiratorysyncytialvirusstronglyassociatedwithseverebronchiolitis[J].JInfectDis,2005,191(3):382-386.[l7]MartinET,KuypcrsJ,WaldA,etal.Multipleversussinglevirusrespiratoryinfections:viralloadandclinicaldiseaseseverityinhospitalchildren[J].InfluenzaotherRespirViruses,2012,6(1):71-77.[18]PapenburgJ,HamelinME,OuhoummaneN,etal.Comparisonofriskforhumanmetapneumovirusandrespiratorysyncytialvirusdiseaseseverityinyoungchildren[J].JInfectDis,2012,206(2):178-189.[19]GagliardiTB,PaulaFE,IwamotoMA,etal.Concurrentdetectionofotherrespiratoryvirusesinchildrensheddingviablehumanrespiratorysyncytialvirus[J].JMedVirol,2013,85(10):1852-1859.[20]NascimentoMS,SouzaAV,FerreiraAV,etal.Highrateofviralidentificationandcoinfectionsininfantswithacutebronchiolitis[J].Clinics(SaoPaulo),2010,65(11):1133-1137.[21]WeiL,LiuW,ZhangXA,etal.DetectionofviralandbacterialpathogensinhospitalizedchildrenwithacuterespiratoryChongqing2009-2013[J].Medicine(Baltimore),2015,94(16):e742.[22]胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学[M]7版.北京:人民卫生出版社2002:1167-1214.[23]LiuFC,ChenPY,HuangFL,etal.DoserologicaltestsprovideadequaterapiddiagnosisofMycoplasmapneumoniainfection?[J].JpnJInfectDis,2008,61(5):397-399.[24]王和平，郑跃杰，邓继岿，等.深圳市儿童医院住院儿童常见呼吸道病毒病原学分析[J].临床和实验医学杂志,2013,12(21):1722-1724.[25]LiuCY，ZhangH，XieZD，etal.StudyofviraletiologyofacuterespiratorytractinfectionamongpediatricoutpatientsinBeijing[J].ChinJPractPediatrAug,2012,27(8):619-621.[26]ShiWX，PengXM，HanLL，etal.VirusetiologyinchildrenwithacuteupperrespiratoryinBeijing[J].ChinJHealthLabTech,2008,18(7):1263-1265.[27]ZouM，GuoLR，SuX，etal.Viraletiologyinchildrenwithupperrespiratory40 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第二部分infectioninTianjin[J].JPathogBiol,2013,8(10):924-926,930.[28]LiL,ShiWF,DongW.Detectionof9pathogensandepidemiologyinchildrenwithacuterespiratoryinfection[J].InterJLabMed，2013,34(6):684-685.[29]张海祥，谢鑫，张科进，等.细胞因子风暴在流行性感冒病毒感染中的作用及防治研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2013,29(5):556-559.[30]张永宏，王大燕，王爽，等.Th1/Th2类细胞因子在新型A型H1N1流感重症患者不同预后转归中作用分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2011,25(4):274-276.[31]王冰，张春青，王萍，等.A型H1N1流感病毒感染者早期血清中细胞因子分泌水平及其意义分析[J].中国卫生检验杂志,2015(15):2513-2515.[32]CalvoC，LuzGarcia-GarciaM，BlancoC，etal.multaneousviralinfectionsininfantswithacuteMulti}>lesi-restnratorytractinfectionsinStain[J].JClinVirol，2008，42:268-272.[33]AberleJH,AberleSW,PracherE,etal.Singleversusdualrespiratoryvirusinfectionsinhospitalizedinfants-impactonclinicalcourseofdiseaseandinterferon-gammaresponse[J].PediatrInfectDisJ,2005,24:605-610.[34]RichardN，Komurian-PradelF,JavouheyE，etal.Theimpactofdualviralinfectionininfantsadmittedtoapediatricintensivecareunitassociatedwithseverebronchiolitis[J].PediatrInfectDisJ,2008,27:213-217.[35]CanducciF,DebiaggiM，SampaoloM，etal.Two-yearprospectivestudyofsingleinfectionsandco-infectionsbyrespiratorysyncytialvirusandvirusesidentifiedrecentlyininfantswithacuterespiratorydisease[J].JMedVirol,2008,80:716-723.[36]DePaulisM，GilioAE，FerraroAA，etal.Severityofviralcoinfectioninhospitalizedinfantswithrespiratorysyncytialvirusinfection[J].JPediatr,2011,87:307-313.[37]单英，郑成中，秦炯，等.缺氧缺血性脑病新生儿血清超敏C-反应蛋白与血小板参数的变化和临床意义[J].实用儿科临床杂,2006,21(12):7512-7520.[38]LeeSY,ParkKH,OhKJ,etal.TherelationshipofserumCreactiveproteinandclinicalchorioamnionitisfunisitisandearlyonsetneonatalsepsisinpretermdelivery[J].Americanjournalofobstetricsandgynecology,2011,204:S210-S210.[39]杨胜利，何秉贤.C-反应蛋白与冠心病[J].中华心血管病杂志,2001,29(3):187-188.41 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分呼吸道合胞病毒与甲型流感病毒混合感染患儿血清炎症因子的研究近年来，大量的国内外研究结果均提示RSV是儿童急性下呼吸道感染最重要的病原体[1，2]。随着检测技术和手段的的进步，呼吸道病毒检出的种类逐渐在增多，儿童混合感染的相关报道明显增多[3，4]。这些研究显示，多种病毒混合感染在临床中较为并不少见，但多种病毒混合感染发生的体内炎症反应的机制目前尚不清楚。目前多项研究表明RSV感染后，机体内促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子，辅助细胞因子Th1型与Th2型失衡，容易导致下呼吸道的免疫损害加重[5，6，7]。Th2型细胞过度的免疫反应，表现为白介素(interleukin，IL)-4，IL-5及IL-13[8-10]的分泌明显增加；而Th1细胞通过IFN-γ、IL-2、TNF-a等细胞因子的释放，促进RSV病毒的清除，从而减轻疾病的严重程度[11-13]。有研究表示，当患者处于流感病毒感染的早期，机体内IL-5、IL-10、TNF-a、IL-1、IFN-γ、IL-6、IL-23等细胞因子血清浓度均有所上升，其上升的程度与病情的轻重有关[14，15]。一项对轻、重度流感患者的研究显示：重症流感患者由于机体内促炎性细胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-12等)及抑炎细胞因子(IL-10等)表达显著上升，两者相互作用、表达失衡，最终导致了临床广泛的肺组织水肿、肺炎、肺泡出血等症状，甚至发展成急性呼吸窘迫综合征（ARDS）而死亡。炎症反应的过程中，有大量的抑制性细胞因子参与炎症反应，在调节病毒感染诱导的免疫平衡方面起到至关重要的作用。多项研究显示[16-22]，在病毒感染过程中，IL-27、IL-10、IL-35及转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β均具有免疫抑制作用。随着对TGF-β的深入研究，发现TGF-β可以通过减少RSV感染诱导的IFN-γ、IL-12、IL-2及肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-a的分泌[23]，而起到免疫调节的作用。结合以上特点，本章节探讨IL-1β、IL-4、IL-2，IL-8、IFN-γ，TNF-α、TGF-β在RSV和inf-A混合感染患儿血清中表达水平。试图阐述相关促炎因子及抑炎因子在混合感染患儿体内炎症反应中的作用。为进一步开展分子机制研究提供一定的依据。42 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分第一章资料和方法研究对象一、选取2010年1月至2016年12月因急性呼吸道感染入住无锡市第二人民医院年龄＜5岁患儿为研究对象。1.急性呼吸道感染相关诊断参照《诸福棠实用儿科学》第七版[21]：2.急性上呼吸道感染、急性支气管炎、肺炎、重症肺炎、毛细支气管炎的诊断标准同第一部分。二、排除标准：排除早产儿、合并基础疾病(慢性肺部疾病、先心病、免疫缺陷等)、近1个月有细菌、病毒感染史。主要设备及试剂主要设备（1）生物安全柜苏净安泰BSC-130011B2（2）台式离心THERMOS-16R（3）漩涡混合器上海沪西XW-80A（4）倒置荧光显微镜日本OLYMPUSIX51（5）37℃电热恒温培养箱上海精宏DK-600（6）LuminexMILLIPORE公司；（7）移液器：P-10、P-20、P-20、P-100、德国Eppendorf公司P-200、P-1000（8）旋涡震荡器：HYQ-3110SilentShake公司（9）多功能酶标仪Thermo公司（10）冰箱：4℃、-20℃、-80℃冰箱海尔公司（11）台式离心机Thermo及Eppendorf公司；主要试剂Bio-PlexProTMAssays(10014905)美国BIORAD公司HumanTGF-beta1(2ndGeneration)ELISA美国eBioscience公司Ready-SET-Go(88-8350)43 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究方法一、标本采集1.咽拭子采集：患儿在住院当天或次日清晨，由专职医护人员采集鼻咽拭子，具体操作同第一部分。2.血清标本的采集:在入院立即采外周静脉血2ml（最好入院后6小时内），置于抗凝管中。立即送至实验室，离心十分钟后，收集血浆。做好标记，冻于-80℃冰箱内备用。如不能立即离心，标本需放入4℃冰箱内保存。出院当天再次采集静脉血1~2ml送检，方法同前。二、咽拭子呼吸道病毒检测：见第一部分三、细胞因子的检测：采用悬液芯片技术检测血IL-1β、IL-4、IL-2，IL-8、及IFN-γ，TNF-α的水平，使用Bio-PlexProTMAssays试剂盒（由美国BIORAD公司生产）。采用ELISA方法检测血TGF-β的水平，使用的HumanTGF-beta(2ndGeneration)Ready-SET-Go试剂盒（由美国eBioscience公司提供）。1.悬液芯片技术（1）预热机器：打开Luminex仪器，预热大约三十分钟；（2）稀释标准试剂：采用试剂盒内稀释剂，四倍稀释标准试剂；（3）稀释血清：取出96孔板，将血浆样本经过1:4稀释；（4）处板：在96孔板中每孔内加入100μl分析液；（5）洗板：加入预先震荡混匀后的洗液，每孔约100μl，共洗板二次；（6）加样：用移液器取相应的液体，分别加入空白孔（不加样本）、标准孔、样本孔内，每孔约50μl。其后在摇床中避光孵育三十分钟；（7）洗板：继续用洗液每孔内加入100μl，洗板三次；（8）温育：加入大约提前十分钟准备好的抗体(检测的抗体需用检测抗体稀释液进行1:9稀释)，每孔约25ul。再次放入摇床避光孵育约三十分钟；44 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分（9）洗板：重复用洗液洗板三次；（10）加液：每孔内加入50ul检测缓冲液（提前大概10分钟准备好），其后再次放入摇床内避光孵育十分钟；（11）洗板：重复用洗液洗板三次；（12）加入检测缓冲液，每孔约125ul，再次放入摇床中，避光孵育三十秒。最后放入Luminex仪器中读数。2.血清中TNF-α的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将TNF-α标准品稀释4倍，其余步骤同上。3.血清中IFN-γ的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将IFN-γ标准品稀释4倍，其余步骤同上。4.血清中IL-1β的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将IL-1β标准品稀释4倍，其余步骤同上。5.血清中IL-4的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将IL-4标准品稀释4倍，其余步骤同上。6.血清中IL-2的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将IL-2标准品稀释4倍，其余步骤同上。7.血清中IL-8的检测修改步骤（2）中的标准试剂：将IL-8标准品稀释4倍，其余步骤同上。8.TGF-β：采用ELISA方法（1）准备相关试剂（严格按照试剂说明书）；（2）包被抗体：包被96孔板，抗体捕获需用包被缓冲液稀释，每孔内加入100μl。覆上贴板膜，放入4℃冰箱内过夜。（3）洗板：弃去液体缓冲液，用试剂盒内洗液洗板五次。具体操作是：每孔内加入300μl洗液，每次浸泡1分钟，然后甩干。（4）封闭抗体：每孔内加入200μl试剂稀释液，然后覆上贴板膜，放置室温中孵育一小时。（5）洗板：弃去液体，同上洗板步骤，用洗液洗板五次。（6）酸活化样本：拿一块新的96孔板，使用磷酸盐缓冲盐水稀释血清样本5倍。45 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究然后每孔加入20ul浓盐酸，放置室温下孵育十分钟。其后再加入20μlNaOH液中和。（7）稀释标准品：按说明用检测缓冲液稀释二倍，连续稀释八次。每孔内加入100μl稀释的标准品和酸活化的样本，再覆上贴板膜，放置室温下孵育二小时。（8）洗板：弃去液体，用洗液洗板五次。洗板步骤同上。（9）每孔中再加入100μl检测缓冲液稀释的检测抗体。覆上贴板膜，再次放置室温下孵育1小时。（10）洗板：弃去液体。用洗液洗板五次。洗板步骤同上。（11）每孔加入用检测缓冲液稀释的Avidin-HR液体100μl，再覆上贴板膜，放置室温下孵育三十分钟。（12）洗板：弃去液体，用洗板液洗板其次。（13）显色：每孔加入底物溶液约100μl，放置室温下孵育十五分钟。（14）终止反应：每孔中加入50μl终止液，以终止反应。（15）测量OD值：在反应终止后（五分钟内），使用多功能酶标仪在450/570nm波长依序测量各孔的光密度值(OD值)。（16）计算浓度：使用CurveExpert1.3软件进行数据处理，得出样本的实际浓度。四、分组：根据鼻咽拭子的结果，分为四组。1.呼吸道合胞病毒感染组入选标准（RSV组）：诊断为急性呼吸道感染，鼻咽拭子经D3UltraDinf-ARespiratoryVirusIdentificationKit(D3Dinf-AKit)检测呼吸道合胞病毒阳性；病程中无其他细菌和病毒感染依据。2.A型流感病毒组感染入选标准（inf-A组）：诊断为急性呼吸道感染，鼻咽拭子检测A型流感病毒阳性；病程中无其他细菌和病毒感染依据。3.A型流感病毒及呼吸道合胞病毒混合感染组入选标准（MIX组）：诊断为急性呼吸道感染，鼻咽拭子检测A型流感病毒及呼吸道合胞病毒阳性；病程中无其他细菌和病毒感染依据。4.健康对照组（HC组）：健康对照由15例年龄匹配的外科手术患儿，无感染病灶；近1个月无细菌、病毒感染史。46 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分五、临床资料收集对于入组的患儿采用回顾性分析法采集临床资料，通过调阅病史收集以下资料：1.一般资料(年龄、性别)、临床症状(咳嗽、喘息、发热、鼻塞、流涕、呕吐、腹泻、呼吸困难)及体征（肺部异常呼吸音）、实验室检查(血常规、C反应蛋白、体液免疫、细胞免疫、生化全套)、影像学等资料等。六、实验质量控制：1.统一使用一次性采血管收集样本，这样可以避免交叉污染。2.标本收集后应尽量及时检测，如实在不能及时检测，应分装于冰箱内贮存。3.采集血液时要避免发生严重溶血，同样严重脂血的样本也不能使用。七、统计分析统计学数据分析采用SPSS13.0软件包。患儿的人口统计及临床特征使用频率及百分数描述；非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，正态分布计量资料以（x±SD）表示；多因素分析变量经过方差检验。组间比较采用2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。所有统计使用GraphPad6.0软件进行分析。第二章结果（一）、临床特点共95例患儿被纳入研究，其中RSV单独感染组（RSV组）30人，inf-A单独感染组（inf-A组）30人，RSV混合inf-A组（MIX组）20人，健康对照组（HC）组15人。其临床特征及人口统计学特征见（表2.1）；分别将MIX组与RSV组、MIX组与inf-A组年龄、临床表现、及临床诊断进行统计学分析。咳嗽、咳痰、喘息及发热是最常见的症状，其中RSV组易表现为咳嗽喘息，inf-A组主要表现为发热、鼻塞；inf-A组更易诊断为上呼吸感染，混合感染组多以下呼吸道感染为主，更易发生重症肺炎（20%）。表2.1临床特征及人口统计学特征分析比较项目RSV组inf-A组MIX组HC组n=30n=30n=20n=15年龄（月）10.61±2.1518.34±2.2110.71±0.8415.52±3.5147 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究男/女比例16/1415/1512/88/7临床表现(%)咳嗽29(96.67)12(40.00)15(75.00)喘息16(53.33)8(26.67)13(65.00)发热10(33.33)28(93.33)20(100.00)鼻塞/流涕16(53.33)25(83.33)5(20.00)呕吐/腹泻5(16.67)8(26.67)9(45.00)呼吸困难8(26.67)3(10.00)11(55.00)肺部啰音24(80.00)5(16.67)13(65.00)临床诊断(%)急性上呼吸道感染2(6.67)15(50.00)3(15.00)急性支气管炎7(23.33)6(20.00)5(20.00)毛细支气管炎15(50)1(3.33)6(30.00)肺炎4(13.33)5(16.67)2(10.00)重症肺炎2(6.67)3(10.00)4(20.00)（二）、治疗前RSV组、inf-A组、MIX组及健康对照组的几种细胞因子表达水平（x±SD）研究中我们得出了RSV感染组与健康对照组IL-1β、IL-4、IL-2、IL-8、TGF-β、TNF-ɑ、IFN-γ几种细胞因子的表达水平(表2.2)。结果显示，IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-ɑ、IFN-γ在三个感染组间有不同程度升高。IL-4与TGF-β在三组之间的升高不明显。表2.2RSV组、inf-A组、混合感染组、及健康对照治疗前几种细胞因子检测结果RSV组inf-A组MIX组健康对照组(HC)n=30n=30n=20n=15IL-1β(pg/ml)23.40±1.1037.04±0.7341.19±1.613.30±0.56IL-41.72±0.132.26±0.161.76±0.192.10±0.22(pg/ml)IL-25.58±0.478.04±0.577.18±0.545.38±0.62(pg/ml)IL-8(pg/ml)11.71±0.8712.76±0.8715.21±1.277.47±0.67TNF-ɑ(pg/ml)7.56±0.717.97±0.6311.73±1.254.61±0.58TGF-β1274±100.11408±78.642000±133.01413±110.7(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)107.4±13.07111.1±11.60122.6±17.3375.46±8.9148 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分（三）、MIX组治疗前后感染相关细胞因子水平（x±SD）比较MIX组治疗前（急性期）血清的中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-8水平均高于治疗后（P值均<0.05）；IL-2、IL-4、TGF-β在治疗前后无显著差异（P值均>0.05）。见表2.3表2.3MIX组治疗前后炎症相关细胞因子的水平比较急性期（n=30）治疗后（n=24）统计量ZPIL-1β(pg/ml)5.71±7.67-3.3970.00141.19±1.61IL-4(pg/ml)1.76±0.191.92±0.25-1.6250.104IL-2(pg/ml)7.18±0.545.49±0.42-3.0050.003IL-8(pg/ml)10.24±0.92-3.1240.00215.21±1.27TNF-ɑ(pg/ml)11.73±1.257.38±0.56-3.3970.001TGF-β(pg/ml)2000±133.01320±120-1.9620.050IFN-γ(pg/ml)122.6±17.33109.03±27.88-2.6860.007（四）、MIX组治疗后与健康对照组感染相关细胞因子水平（x±SD）比较MIX组治疗后血清中的IFN-γ、TNF-α水平仍高于对照组（P均<0.05）；MIX治疗后血清中的IL-2、IL-4、TGF-β、IL-1β、IL-8水平与健康对照组无显著差异（P均>0.05），见表2.4表2.4MIX组治疗后与对照组炎症细胞因子水平比较治疗后（n=24）HC组（n=15）统计量ZPIL-1β(pg/ml)5.71±7.673.30±0.56-3.3970.001IL-4(pg/ml)1.92±0.252.10±0.22-1.9100.158IL-2(pg/ml)5.39±0.425.38±0.62-1.0050.075IL-8(pg/ml)10.24±0.92-1.6250.1047.47±0.67TNF-ɑ(pg/ml)7.38±0.56-3.3970.0014.61±0.58TGF-β(pg/ml)1320±1201413±110.7-1.2990.084IFN-γ(pg/ml)-2.5210.006109.03±27.8875.46±8.91（五）、各种炎症因子在三组间的比较1.IL-1β水平在不同组的比较分析炎症因子IL-1β是IL家族中重要的促炎因子，能诱导出与TNF-ɑ相似的生理和49 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究代谢改变，能与TNF-ɑ产生相互协同作用。为研究其在混合感染组的作用，我们比较了四组的值。本研究表明：IL-1β在RSV组、inf-A组、及混合感染组较健康组均有明显升高。与健康组相比有统计学差异（P<0.0001）见图2.1*********t值12.4130.5719.68P<0.0001<0.0001<0.0001图2.1血清IL-1β水平比较2.IL-2水平在不同组的比较分析研究表明：IL-2水平在RSV组、inf-A组及混合感染组，升高不明显。尤其是RSV组IL-2水平与健康对照组无明显升高，差异无统计学意义(P<0.05)。但在混合感染组及inf-A组轻度升高，较健康组有统计学差异，P值分别为0.006和0.037。见图2.250 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分NS***t值0.25632.8912.174P＞0.050.0060.037图2.2血清IL-2水平比较3.IL-8水平在不同组的比较分析IL-8是中性粒细胞的潜在诱导剂及活化剂，也能激活单核细胞和肥大细胞。我们的研究表明：IL-8水平在RSV组、inf-A组、及混合感染组均有升高，较对照组有统计学差异（P值分别为0.0025、0.0002和<0.0001）。但混合感染IL-8水平升高更明显。见图2.351 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究*******t值3.2074.0124.879P0.00250.0002<0.0001图2.3血清IL-8水平比较4.TNF-ɑ水平在不同组的比较分析通过比较四组TNF-ɑ的水平我们发现：RSV、inf-A组及混合感染组TNF-ɑ水平均有明显升高，P值分别为0.0091、0.0014和<0.0001，较健康组比较具有明显统计学意义。但RSV组及inf-A组均较健康对照组轻度升高，混合感染组升高更明显。见图2.4*******t值2.733.4094.739P0.00910.0014<0.0001图2.4血清TNF-ɑ水平比较5.IFN-γ水平在不同组的比较分析通过比较四组IFN-γ后，结果表明：RSV组、inf-A组较健康对照组均升高不明显，P值均>0.05，无统计学差异。但混合感染组IFN-γ稍有升高，较对照组比较有统计学意义P值为0.035。见图2.552 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分NSNS*t值1.6262.0182.195P＞0.05＞0.050.035图2.5血清IFN-γ水平比较6.TGF-β水平在不同组的比较分析抑制细胞因子TGF-β可以抑制IFN-γ和TNF-α等的产生。我们比较了四组后发现：RSV组、inf-A组较健康对照组无明显升高，P值均>0.05，无统计学差异。但混合感染组TGF-β稍有升高，较对照组比较有统计学意义P值为0.0027。见图2.6图2.6血清TGF-β水平比较53 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究NSNS**t值0.86240.039533.238P＞0.05＞0.050.00277.IL-4水平在不同组的比较分析IL-4作为白介素家族中的一员，在炎症中起到抑制炎症反应的作用。我们比较了四组IL-4的水平后表明：RSV组、inf-A组及混合感染组均无明显升高，与健康对照组比较无明显升高，P值均>0.05，无统计学差异。见图2.7图2.7血清IL-4水平比较NSNSNSt值2.4964.1532.29P＞0.05＞0.05＞0.05第三章讨论当细菌、病毒、真菌等病原体侵入机体后，触发体内的炎症反应，激活淋巴细胞和巨噬细胞，分泌细胞因子对抗外来病原体，以减轻对机体的损伤。机体产生大量的致炎性细胞因子，以消除病原微生物的同时，会产生大量的内源性抗炎细胞因子，以防止过度炎症。目前研究最多的致炎性细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α和INF-γ等，抗炎细胞因子包括IL-4、IL-1受体拮抗剂（IL-Ira）、TGF-β等。我们的研究表明，RSV、inf-A混合感染组患儿较RSV组、inf-A组更容易发生重症肺炎（20%、6%、10%），比较有统计学差异（P值<0.05）。通过对血清中几种炎54 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分症因子监测发现：混合感染患儿急性期血清IL-1β、TNF-ɑ、IL-8水平升高尤其突出，较RSV组及inf-A组均有明显升高。IL-1β主要由单核细胞、中性粒细胞、内皮细胞、淋巴细胞等分泌，主要作用是协同其他因子促进淋巴细胞增殖、活化NK细胞、内皮细胞等。IL-1β具有较强的抗炎作用，在免疫调节和炎症过程中起重要作用。正常情况下，机体有少量的IL-1β以无活性形式存在，然而，在脑损伤、感染等情况下，IL-1β的水平和活性显著增加[25]。TNF-α主要由单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等分泌，作用是调控细胞因子、转录因子的表达，是重要的早期炎性调节因子。一方面，它可以引起炎症反应，在清除病原体的同时，会导致机体器官甚至多系统损伤；另一方面，它也是炎症反应的重要保护因子，使机体对感染更具抵抗力。因此，体内TNF-α水平过多或缺失都增强了免疫病理反应[26-30]。IL-8是炎症反应中重要的趋化因子，主要由巨噬细胞、内皮细胞等分泌，可以诱导中性粒细胞、巨噬细胞等向感染部位聚集，以清除病原体。在急性肺损伤、重症肺炎、以及急性呼吸窘迫综合征的发展中起到重要的作用[31]。混合感染后TNF-a、IL-1β、IL-8明显升高，提示患儿炎症细胞因子呈瀑布样反应，激活和募集炎症细胞，加重了人体局部乃至全身的炎症反应。因此，混合感染患儿临床更易表现为高热、呼吸困难等重症肺炎表现。保持混合感染患儿的免疫平衡，调节促炎性细胞因子IL-1β、TNF-ɑ、IL-8的水平，可能为混合感染患儿的治疗提供了可行的依据。同时我们通过比较混合感染治疗前及治疗后几种炎症因子的水平可以得知，在疾病的恢复期，IL-1β、TNF-ɑ、IL-8、IFN-γ较治疗前均有明显下降，但TNF-ɑ、IFN-γ、IL-1β水平较健康对照组仍明显偏高。因此，IL-8水平的变化可能是反应病程较敏感的指标。有研究发现呼吸道合胞病毒可以诱导Toll样受体从而引起某些炎性因子异常表达[32]。此次实验中RSV感染组IL-1β、IL-8、TNF-ɑ在血清中的水平高于正常对照组，有统计学意义，与骆亚丽等[33]、庄永玲等[34]文献报道相符合。RSV感染后，在年龄越小的患儿中喘息、气促发生率明显增加，与体内低水平的IFN-γ和高水平TNF-α、IL-17等分泌有关[35]。我们的研究中炎症因子IL-2与对照组升高不明显，无统计学意义。所有这些结果表明，RSV感染后，过度的炎症反应导致Th1/Th2免疫反应的失衡，对疾病的进展至关重要。本研究还发现，年龄是呼吸道合胞病毒感染的重要危险因素，年龄越小的婴儿感染RSV感染后，其住院率和严重程度明显增加。55 第三部分无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究这与Winterstein[36]、OhumaEO等[37]的研究相符。考虑体液免疫、细胞免疫功能不健全等可能导致小婴儿对RSV易感，且感染后炎症不易局限。自全球流感病毒爆发感染后，流感越来越成为人们关注的公共健康问题，是临床上最常见的疾病之一。流感病毒感染后触发患儿体内的免疫炎症反应，从而表现一系列的临床症状。重症的流感病毒感染后，导致的过度炎症反应(“细胞因子风暴”)可能是流感病毒高致病力和高致死率的主要原因之一，但是相关机理仍有待进一步研究。机体在流感病毒侵入后内皮细胞大量分泌IL-8，诱导中性粒细胞聚集于呼吸道。虽然中性粒细胞可以保护人体免受微生物感染，但过度释放也会造成损害。本研究中，inf-A及混合感染组IL-8均有明显升高，而在RSV单独感染组升高不明显，我们推断流感病毒感染与其高表达有关。在细菌及病毒感染后体内发生的炎症反应过程中，抗炎性细胞因子IL-4、TGF-β分泌，起到抑制Th1、Th2细胞免疫反应的作用，在维持TH1/TH2免疫平衡中起到重要的作用[38-41]。TGF-β可以有效地减少病原体感染后产生的IFN-γ、IL-2及TNF-a的分泌[42]。因此TGF-β在病毒细菌感染过程中会明显升高。而在本研究中，三个感染组升高均不明显，RSV组及inf-A组较健康组对照组无明显统计学意义，推测原因可能与本研究均为<5岁患儿有关。但混合感染组TGF-β较对照组稍有升高，有统计学差异，考虑TGF-β的分泌可能也与病情轻重相关。Mobbs[43]、Roman[44]等的研究表明，婴幼儿严重感染后体内Th2细胞反应明显增强，主要表现为血清IL-4、IL-5和IL-13水平增加。但在我们的研究中，混合感染组IL-4升高并不明显，与我们的研究不符。推测可能与IL-4的检测方法、病例数、病原体种类等差异有关。综上所述，inf-A、RSV混合感染后，体内致炎因子占优势，表现为IL-1β、TNF-ɑ、IL-8的高表达。抑炎因子IL-4、TGF-β升高不明显，其分泌可能与年龄、疾病严重程度相关。目前仍需要大样本量，进一步分子实验来探讨细胞因子在小婴儿病毒感染中的表达机制，进而了解相关病毒感染诱导的免疫炎症机制。第四章结论inf-A、RSV混合感染患儿病情重、病死率高，因此，需了解体内炎症反应情况，以寻求更好地治疗方法。通过我们的研究提示：56 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究第三部分1.RSV及inf-A混合感染后致炎因子IL-1β、TNF-ɑ、IL-8明显升高，可能导致体内过度炎症反应；抑炎因子IL-4、TGF-β体内无明显升高，感染后其分泌水平可能与年龄、疾病的轻重相关。2.IL-1β、IL-8水平的变化是反应混合感染患儿病情严重程度较敏感的指标。3.我们的研究为进一步病毒感染后的免疫治疗，提供了一定的参考。参考文献[1]CanducciF,DebiabbiM,SampaoloM,etal.Two-yearprospectivestudyofsinbleinfectionsandco-infectionsbyrespiratorysyncytialvirusandvirusesidentifiedrecentlyininfantswithacuterespiratorydisease[J].JMedVirol,2008,80:716-723.[2]谢正德，肖艳，刘春艳，等.儿童急性下呼吸道感染病毒病原学2007-2010年监测[J]中华儿科杂志，2011,49:745-749.[3]SunbCC,ChiHsin,ChiuNC，etal.ViraletiologyofacutelowerrespiratorytractinfectionsinhospitalizedyoungchildreninNorthernTaiwan[J].JMicrobiolImmunolInfect,2011,44:184-190.[4]DePaulisM，GilioAE，FerraroAA，etal.Severityofviralcoinfectioninhospitalizedinfantswithrespiratorysyncytialvirusinfection[J].JPediatr,2011,87:307-313.[5]LeeFE,WalshEE,FalseyAR,etal.Humaninfantrespiratorysyncytialvirus(RSV)-specifictype1and2cytokineresponsesexvivoduringprimaryRSVinfection[J].TheJournalofinfectiousdiseases,2007,195(12):1779-1788.[6]LeggJP,HussainIR,WarnerJA,etal.Type1andtype2cytokineimbalanceinacuterespiratorysyncytialvirusbronchiolitis[J].Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine,2003,168(6):633-639.[7]LoebbermannJ,SchnoellerC,ThorntonH,etal.IL-10regulatesvirallungimmunopathologyduringacuterespiratorysyncytialvirusinfectioninmice[J].P1oSone,2012,7(2):e32371.[8]JohnsonTR,GrahamBS.SecretedrespiratorysyncytialvirusGglycoproteininducesinterleukin-5(IL-5),IL,-13,andeosinophiliabyanIL-4-independent57 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全文总结无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究全文总结通过我们的研究，我们发现：1.无锡地区自2010年1月-2016年12月，七种常见呼吸道病毒流行趋势基本平稳。2013年12月可能有RSV感染的小流行；2.RSV仍是无锡地区0-1岁患儿冬季感染的主要病原体，临床上主要表现为喘息性疾病的发生。3.RSV混合inf-A感染易发生于年龄偏大的幼儿，临床上易出现发热、呕吐、腹泻、呼吸困难等症状，尤其发热、重症肺炎的发生率高。提示RSV混合inf-A感染易加重病情。4.RSV及inf-A混合感染患儿体内促炎因子IL-1β、TNF-ɑ占优势；IL-1β、IL-8的异常表达可能是反映病情严重程度较敏感的指标。62 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究创新点创新点1.本研究对无锡部分地区2010-2016年急性呼吸道感染儿童连续7年进行七种常见呼吸道病毒检测的较大规模、较多样本分析。为无锡地区将来开展儿童急性呼吸道感染监测和研究工作提供了基线资料，对我国制定急性呼吸道感染预防控制策略有一定的参考价值。2.探索性地研究了两种病毒混合感染后的临床症状及体内七种常见炎症细胞因子的表达水平；首次探讨了inf-A及RSV混合感染患儿体内炎症相关细胞因子的情况及与临床的相关性；为混合感染后，体内免疫炎症机制的分子研究提供了一定的参考。为未来可能开发出的治疗病毒感染的细胞因子作用靶点提供一定的理论依据。63 不足和展望无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究不足和展望当然我们的研究也存在了很多的局限性：1.本次研究仅针对无锡市四家医院的门诊及住院儿童，这四家医院在地理位置上不能代表整个无锡地区。2.在长达七年的研究中，收集到inf-A混合RSV感染20例标本，存在样本量不足的问题，在结果分析上可能存在一定的差异。3.炎症因子的相互作用十分复杂，其表达水平与病毒在体内感染的存在时间相关，需进一步将炎症因子水平与年龄、病程、免疫指标等因素进行相关性分析，以更恰当地反应其与临床的相关性。基于以上的发现及不足，下一步开展的计划是尽量与多个单位合作，争取更大面积更大范围地收集病例。从而真正得出无锡地区七种呼吸道病毒感染的流行情况；同时在炎症的分子机制上进行研究，进一步探讨混合感染患儿体内的炎症反映情况及其临床意义，为患儿的治疗开辟一个新的思路。64 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究综述综述儿童常见呼吸道病毒的流行现状综述：葛小丽审校：冯星教授急性呼吸道感染是儿童最常见、发生率最高的疾病，也是人类新发和突发传染病的最主要病原因素，已成为威胁儿童健康的重大问题。儿童呼吸道感染性疾病已被列为导致全球5岁以下儿童死亡的第二大病因[1]。大量的研究表明，引起儿童急性呼吸道感染的重要病原体是病毒[2,3]。在发达国家中，急性呼吸道疾病在急性发病患者中约占75%，其中80%由病毒引起[4]。目前儿童最常见的呼吸道病毒有流感病毒（influenzaviruses，INF）、副流感病毒（parainfluenzaviruses，PIV）、呼吸道合胞病毒（Humanrespiratorysyncytialvirus，RSV）、人鼻病毒（humanrhinovirus，HRV）、和腺病毒（adenovirus，ADA）等。但随着近几十年来科学技术的发展进步，特别是分子生物学及高通量测序技术发展，开启了病毒发现的新的高潮。新近发现很多新型人类呼吸道病毒，如：人博卡病毒(humanbocavirus,HBoV)[5]、人偏肺病毒(humanmetapneumovirus，HMPV)[6]，人冠状病毒NL63和HKU1(humancoronavirusNL63,HCoV-NL63;humancoronavirusHKU1，HCoV-HKU1)[7]，SARS-CoV(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus)[8]等。本文对儿童呼吸道感染几种常见病毒和新型病毒的流行情况，做以下综述。人流感病毒（influenzaviruses，INF）人流感病毒属正粘病毒科，系RNA病毒，于1933年首次分离，对人类致病的主要是甲型和乙型（A型和B型）。INF抗原易变异、传播迅速、流行广泛，因而造成了很大的社会公共问题。其主要在咳嗽、喷嚏、说话的过程中，通过空气散播飞沫在人际间传播。其它的感染途径如短距离的小颗粒气溶胶、手部受污染后自我感染等形式，对于流感的传播作用仍不确定[9]。在季节性流感中，5岁以下儿童由于解剖学上的特殊结构，以及体内免疫功能发育不成熟，成为了流感危重症的高危人65 综述无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究群，其发病率远远高于成人。但在2009年调查中，发现世界大流行的甲型流感（H1N1）中，其危重症和死亡病例却多发生在5岁以上人群[10]。由于INF抗原易变异，且对社会危害大，全世界一直将流感病毒纳入流行病监控范畴。每个流行期的流行优势毒株也各有不同；2005～2006年主要是H1N1亚型；2006～2007年以H3N2亚型流行为主，而到了2007～2008年，则以B型流感病毒流行为主[11]。由于地域差别，流行的病毒株也不同。2005～2008年在我国河北省，以H1N1、H3N2亚型、B型流感感染为主；而北京[12]和苏州地区[13]发现以H1N1流行占优势。深圳地区2005～2007年流感夏季到达流行高峰[14]；北京地区2005年夏季阳性率达14.2%[12]。越来越多的资料显示流感的季节性流行特点：夏季轻度流行，而每年的冬春季是流感流行的高峰期[15]。2009年3月变异后的新型甲型H1N1流感病毒在全球范围内出现了大流行，人类对其普遍易感[16-19]。关于流感病毒的流行特点，目前仍在进一步的研究中。轻症甲型流感临床上主要表现为发热、畏寒、流涕、乏力、肌肉酸痛、咳嗽、为特征，血白细胞、CRP无明显升高，临床症状一般较轻、病程短，预后良好[20-21]。而我国2009年儿童流感中，重症和危重症患儿除流感样症状以外，严重的呼吸困难、消化道症状以及神经系统损害症状比较多见；严重的肺炎、急性呼吸窘迫综合征、严重的脑炎、脑病成为死亡的主要原因[22]，这与国内外既往的研究明显不同，已经引起全球儿科医生的高度关注。呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，RSV）呼吸道合胞病毒是副粘病毒科肺炎病毒属的成员，为有包膜的单负链RNA病毒。生命力非常顽强，可以在外界环境中6小时而不死亡。传染性较强，世界范围内RSV是引起儿童下呼吸道感染的最重要病毒，最常见于一岁以内的儿童。RSV感染后可以表现为严重的毛细支气管炎和肺炎[23]，病情严重者或反复发作常会使支气管哮喘发病率明显增加[24]。在美国，每年大约有七万～十二万的婴幼儿，因感染了RSV病毒需要住院治疗[25]。在发展中国家，RSV感染情况更严重，因RSV感染所引起的毛细支气管炎、肺炎已经成为五岁以下儿童死亡的主要原因之一[26]。由于RSV是危害一岁内儿童最主要的病原体，因此，对其监测相当重要。RSV流行特性可以随着地区、季节、气候等的变化而有所差异。在我国，北京、杭州、66 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究综述苏州地区报道冬春季达到了RSV感染的流行高峰，而在夏季儿童感染RSV的发病率最低[27，28]，与日本、美国等报道[29]一致。但我国的昆明地区RSV却在每年的7月份至次年的2月份流行，其流行高峰却在10-12月份[30]。而根据国外报道，许多热带国家RSV的流行发生在最热月份和雨季。如非洲地区，每年的雨季末RSV开始流行[31]。在我国的北京和苏州地区监测还发现RSV流行呈隔年高峰趋势[26，28]，对此现象解释为大流行后，该地区人群普遍获得了一定的免疫致隔年感染率有所下降，当然这还有待于结合分子流行病学指标监测来进一步证实。但苏州地区连续7个流行季节监测还发现RSV流行隔年高峰与月平均气温无相关。这提示气温仅是影响RSV流行的重要因素之一，其流行病学特点仍需要进一步理论证实。副流感病毒(humanparainfluenzaviruses，HPIV)副流感病毒属副黏病毒科副黏病毒属，是一种有胞膜的单股负链RNA病毒，于1956年首次发现PIV-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[32,33]，后来在患病的成人和儿童呼吸道中发现PIVⅣ型。在人群中流行主要是PIV-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，已成为全世界范围内婴儿和儿童下呼吸道疾病的重要病原体，高达9%-30%[34]的患儿因PIV引起的下呼吸道感染而住院治疗。PIV可通过直接接触，吸入气溶胶等途径传染。患病儿童可以在无症状的情况下，持续释放病毒达10天之久[35、36]，因此也成为院内感染主要的病原体。PIV感染可引起儿童发生多种呼吸道的疾病，包括急性上呼吸道感染、急性喉炎、急性支气管炎、毛细支气管炎、中耳炎、肺炎，还可以引起脑炎、热性惊厥等[37、38]。不同的PIV亚型与不同疾病的相关性也不同，其中PIVⅠ是引起儿童急性喉炎的主要病原体之一，常导致急性喉炎、急性喉气管支气管炎的发生。而PIVⅢ常与严重的肺炎以及毛细支气管炎等的发生有关。儿童呼吸道感染中副流感病毒以PIVⅠ、PIVⅢ为优势病原株，PIVⅡ多为散发病例[39]。究其原因，可能与各亚型与气道的亲和性各不相同有关。PIV的流行与季节无明显相关性，不同的病毒株流行情况也不同。国外文献报道PIVⅠ感染流行主要出现在秋季的中期，PIVⅢ的感染流行则缺乏明显的季节性[40]。一项对2001～2003年北京地区的儿童PIV感染的流行病学调查研究发现，PIV检出率并无明显规律可循[39]。温州地区则报道PIVⅢ几乎常年均可检出，相对来说，春夏季为其感染高峰期，其流行持续时间也更长[41]。67 综述无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究腺病毒（adenovirus，ADA）为双链DNA分子，于1953年首次从切除的儿童腺体及扁桃体内分离出来[42]。已确定可以感染人类的血清型有51个，其中约1/3可引起人类感染；南方以3、11型多见，北方以7型多见。在儿童中，是引起呼吸道感染的重要病原体之一，其感染在全世界各个地区都有发生[43]，主要传染方式为直接接触传播。但呼吸道腺病毒感染后，病毒DNA可以整合入宿主细胞的基因组中、或者以独立方式长期存在于宿主体内。虽然病毒基因已停止了复制，但能持续表达某些蛋白如E1A蛋白，促进一些炎症介质释放[44、45]。腺病毒感染后，在儿童特别是在婴幼儿中，可引起严重的支气管炎，甚至发生致命的肺炎。资料统计显示在我国20世纪60年代监测到的婴幼儿肺炎中，腺病毒为重要病原，其发病率、死亡率较高。但在20世纪80年代以后发病率与死亡率均有所下降。张学兰等对2001-2008共22607份急性呼吸道感染患儿标本进行检测，ADV的检出率为1.38%。他们通过连续八年的监测，发现腺病毒感染主要表现为散发，且检出率有逐年下降的趋势[46]。虽然ADV的感染多为散发病例，但近几年世界范围内也有过大规模的暴发流行以及局部地区小范围流行的报道，甚至出现了变异株。2007年美国的4个州出现ADV14型感染的小范围暴发，141例患者发生了感染，38%需要住院治疗，其中17%入住了重症监护病房，约5%的患者发生死亡[47]。这些提醒我们，腺病毒在呼吸道感染中的地位仍不能忽视，应该加强对ADV感染的流行病学监测。ADV感染无明显季节性特征，四季都有散发。但有研究显示其感染与年龄有相关性，主要以3岁以上的儿童为主[48]。在3岁以上的儿童感染ADV时，临床上以咽炎、急性扁桃腺炎为主，而3岁以内儿童感染则下呼吸道感染为主要表现[34]。人偏肺病毒(humanmetapneumovirus,hMPV)人偏肺病毒是属于单股负链的RNA病毒。是一种在2001年由荷兰学者VandenHoogen等[49]发现的与呼吸道疾病有关的新的副黏液病毒。但随后经研究证实，hMPV其实已在人类社会中流行了有50年时间。5岁以下婴幼儿、老年人和免疫缺陷病人对其易感，主要通过呼吸道传播。由于hMPV感染引发不完全免疫反应，因此，大部分人虽然在儿童时期都感染过此病毒，但仍会终生重复感染。hMPV感染后患儿的临床症状与RSV极为相似，hMPV感染可导致上呼吸道感染、毛细支气管炎、肺68 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究综述炎等[50-53]。hMPV易与其它病原体发生混合感染，如RSV、流感病毒、支原体等。有报道称，hMPV与hRSV的混合感染导致健康儿童的临床症状加重[54]，使其转入儿科重症监护病房的可能性增加[55]。hMPV在各地流行情况不同，国外有研究显示hMPV在因急性呼吸道感染而住院治疗的儿童中的检出率为5.5%～8%[56-61]，在发病高峰月份中的检出率高达57%[62]。我国研究报道显示，在广州、苏州两个地区，hMPV的检出率分别为7.49%、8%[63，64]。大量的流行病学研究表明hMPV流行具有明显的季节特征，北方的发病高峰主要在冬春季，容易与RSV流行高峰重叠[56-59]，而地处亚热带的中国香港地区hMPV的发病高峰却在每年的春、初夏季[61]。说明hMPV活动高峰因各地区的气候条件的差异而表现不同。当然也有一些研究认为hMPV的感染患者主要儿童，其中在0-2岁的婴幼儿中的检出率最高[56，59]。说明了hMPV在小年龄组呼吸道感染中的重要性，就其原因，可能与这一阶段儿童免疫功能发育不完善相关。人博卡病毒(humanbocavirus,HBoV)人博卡病毒(humanbocavirus,HBoV)人博卡病毒是一类单链线状DNA病毒，2005年瑞典学者Allander等[65]在发生急性呼吸道感染的儿童的气道分泌物样本中发现了这一病毒。成人及儿童对其普遍易感，但主要感染人群为两岁以下的婴幼儿[66，67]。目前认为感染了HBoV后的患儿主要临床表现为鼻炎、支气管炎、喉炎、肺炎，也有少数研究报道可以导致结膜炎、皮疹、中耳炎等[68-70]。但国内更多学者认为HBoV与持续性喘息关系较大。邓昱等研究发现在持续喘息患儿的呼吸道分泌物中HBoV的阳性检出率高达31%[71]，严华杰等研究指出在伴喘息发作的下呼吸道感染患儿中，HBoV检出率明显高于不伴喘息发作的患儿[72]，显示HBoV感染是诱发儿童喘息性疾病的重要原因之一，但其具体的致病机制仍有待进一步研究。由于人群普遍易感，且婴幼儿更易感，因此有研究表明，学龄儿童基本都具有HBoVl的抗体[73,74]。不过，利用病毒核酸法检验急性呼吸道疾病患者中的检出率却相差较大，约为1.5%-24.6%[75]，考虑与患者年龄、所取标本的类型、检测方法的敏感性、采样的时间、样本的处理程序及地理环境等方面的差异有关。HBoV更易与其他病原体发生混合感染，有报道称HBoV在呼吸道感染患儿混合感染率中高达69 综述无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究83%[76]。在季节特征方面，HBoV全年均可检出，大部分报道显示在秋冬季节或春秋季HBoV的检出率较高[77-79]，也由少部分报道显示部分地区再夏秋季得检出率较高[80]。人冠状病毒(humancoronavirus，HCoV)人冠状病毒是单股、正链、有帽子结构和腺嘿吟尾巴结构的RNA病毒。首次被发现是在1965年，由科学家从普通感冒患者得鼻洗液中分离而来。至目前为止已发现有以下6种亚型：229E、OC43、NL63、HKU1是常见的病原体，存在于人群的呼吸道中。21世纪以来导致了急性重大疾病发生的严重急性呼吸综合征（SARS）病原体和中东呼吸综合征（MERS）病原体也属于冠状病毒[81,82]。其中229E,OC43主要引起普通感冒，据一项人群血清调查表明，全世界所有地区基本上都有OC43和229E病毒抗体[83]。然而随着2003年全球SARS暴发流行，发生了高致死性得肺炎和呼吸窘迫综合征，由冠状病毒引起的人类疾病才越来越受到人们的重视[84]。各地疾控中心将其列入监控病种。虽然传播细节尚未研究很多，但目前推测呼吸道是感染这些病毒的主要途径。全国2013年的监测报告显示，在2009年1月至2013年9月期间［85］我国的急性下呼吸道感染患者的呼吸道分泌物中HCoV得检出率为1.4%。美国一项回顾性研究报道，在门诊就诊的发生上呼吸道感染和下呼吸道感染的儿童的呼［86］吸道标本中HCoV的检出率分别为8.4%和4.7%，而且在冬季更为常见。这与我国监控显示的大多流行发生在秋、冬季不一致［85，87-89］。说明HCoV流行病学特征存在着地域差异。随着时代的发展，社会的国际化程度越来越高，同时带来的疾病传播风险也愈发加大，如何及时准确的找出感染性疾病的病原体，实现精准医疗十分关键。目前医学界基因检测技术日新月异，其在病毒检验方面也有突破。Doudna等发现利用DETECTR（DNAEndonucleaseTargetedCRISPRTransReporter）技术可以检测DNA，灵敏度、准确度均较高，他们的研究团队已经利用此技术在人类样品中发现了两种［90］具有致癌性的人类乳头状瘤病毒（HPV）。MichaelLevin带领的团队对来自英国、西班牙、荷兰和美国的因为发热就诊的儿童进行了研究，发现IFI44L和FAM89A两个基因只有在细菌感染时才转换至开放状态，其准确度高达95-100%，可以有效的［91］避免临床上滥用抗生素的状况。70 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究综述目前基因检测方法已经历了数代发展：使用电泳法的Sanger测序；使用荧光信号的illumina方法；使用纳米孔读取荧光信号的PacBio方法；使用电信号的OxfordNanopore方法，通过生物纳米孔测序，分析富集的病原体及其DNA、蛋白（毒素）来明确病原，准确率已经可以达到92-96%。传统的病原检测方法，判读出结果需要4-5小时，甚至2-3天，而采用基因检测方法的一站式检测，最快可以65分钟出结果。所有这些都为早日实现精准医疗打下了坚实基础。可以预见，在不久的将来，临床上快速实现病原体的准确检验不在是梦。参考文献[1]BryceJ,Boschi-PintoC,ShibuyaK,etal.WHOestimatesofthecausesofdeathinchildren.Lancet2005,365:1147–52[2]KhamrinP,ThongprachumA,ShimizuH,etal.Detectionofhumanbocavirus1and2fromchildrenwithacutegastroenteritisinJapan[J].MedVirol,2012,84(6):901-905.[3]MoriyamaY,HamadaH,OkadaM,etal.Distinctiveclinicalfeaturesofhumanbocavirusinchildrenyoungerthan2years[J].EurJPediatr,2010,169(9):1087-1092.[4]MahonyJB:Detectionofrespiratoryvirusesbymolecularmethods.ClinMicrobiolRev2008,21(4):716-747.[5]AllanderT,TammiMT,ErikssonM,etal.Cloningofahumanparvovirusbymolecularscreeningofrespiratorytractsamples.ProcNatlAcadSciUSA2005102(36):12891-12896.[6]vandenHoogenBG,deJongJC,GroenJ,etal.Anewlydiscoveredhumanpneumovirusisolatedfromyoungchildrenwithrespiratorytractdisease.NatMed2001,7(6):719-724.[7]FouchierRA,HartwigNG,BestebroerTM,etal.Apreviouslyundescribedcoronavirusassociatedwithrespiratorydiseaseinhumans.ProcNatlAcadSciUSA2004,101(16):6212-6216.[8]PeirisJS,LaiST,PoonLL,etal.Coronavirusasapossiblecauseofsevereacuterespiratory.Lancet,2003,361(9366):1319-1325.[9]BrankstonG,GittermanL,HirjiZ,etal.TransmissionofinfluenzaAinhumanbeings.71 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无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究英文缩写词表英文缩写词表缩写英文全称中文ARIAcuterespiratoryinfection急性呼吸道感染RSVrespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒IVinfluenzavirus流感病毒PIVparainfluenzavirus副流感病毒HAdVhumanadenovirus人腺病毒HBoVhumancoronavirus人类博卡病毒HRVhumanrhinovirus鼻病毒HCoVhumancoronavirus人冠状病毒MPVmetapneiimovirus偏肺病毒ADVadenovirus腺病毒inf-AInfluenzaAvirus甲型流感病毒inf-BInfluenzaBvirus乙型流感病毒MPmycoplasma支原体ILinterleukin白介素TNFTumornecrosisinf-Actor肿瘤坏死因子INF-γInterferon-γ干扰素-γIL-IRaInterleukin-1receptorantagonist白介素-1受体拮抗剂TGF-βtransforminggrowthinfactor-β转化生长因子-βWBCWhitebloodcell白细胞CPChlamydiaepneumonia肺炎衣原体PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液79 英文缩写词表无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究HISHospitalInformationSystem医院信息系统LISLaboratoryInformationManagementSystem实验室信息管理系统PACSPictureArchivingandCommunicationSystem影像归档和通信系统MIXMultiplicityofinfection复合感染H.C.Healthycontrol健康对照组SARS-CoVsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒HPIVhumanparainfluenzaviruses人副流感病毒MERSMiddleeastrespiratorysyndrome中东呼吸综合征ABAssaybuffer分析缓冲液ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验detectionantibody检测抗体luminex液相芯片captureantibody抗体捕获80 无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究攻读博士期间发表的论文攻读博士期间发表的论文[1].GeX.HanZ.etal.Characterizationofacuterespiratoryinfectionsamong340ininf-AntsinWuxi,JiangsuProvince.2015Oct;3(18):264.[2].葛小丽,陈洪敏,程娟娟,高明珠,过毅.无锡地区340例呼吸道病毒感染患儿的病原学分析.临床与病理杂志,2015,01:31-35.[3]过毅，葛小丽，吴莹莹，周晓飞.肺炎支原体耐药机制研究进展[J].中华医院感染学杂志,2016,第26卷(20):4782-4784.[4].XiaoliGe,YiGuo,XingFeng,etal.EpidemiologyandSeasonalityofRespiratoryVirusesDetectedfromChildrenwithRespiratoryTractInfectionsinWuxi,EastChina.MedSciMonit,2018,24:1856-1862.81 致谢无锡部分地区儿童七种呼吸道病毒的流行病学及混合感染炎症因子的研究致谢“羊有跪乳之恩，鸦有反哺之义”。一直以来，总是觉得自己是这个世上最幸福的人，因为，我无时无刻不在享受着关爱。博士的学习过程即将结束，此时此刻我要感谢的人太多了。首先，我要感谢苏州大学附属儿童医院。三年半来，在这里，良好的氛围鼓舞我不断前行，与每一位老师、同学的接触中，我深切体会到博学、求精、协进、仁爱、感恩的精神，这将引领我一辈子的前行。其次，我非常感谢我的导师苏州大学附属儿童医院冯星教授。虽然他工作繁忙，虽然他是一代大家，但是仍花费巨大的时间和精力精心指导我完成课题。记得第一次我怀着忐忑的心去找他时，他的和蔼可亲让我倍感亲切；从课题选题、指导实验设计、撰写成文、乃至到最后答辩，无不饱含导师的心血。不仅学习上，生活上，他更像一位长兄，时时刻刻关爱着我。三年半来，他儒雅的大家风范一直感染着我。衷心感谢我的导师在学术上对我的严格要求和悉心指导。您严谨的学术态度、以患者的疾病至上的高度责任感和开放的学术思想、广博深邃的专业知识，所有这一切都将指引我在以后的工作学习中砥砺前行。“令公桃李满天下，何用堂前更种花”！老师，谢谢您！衷心感谢苏州大学附属儿童医院新生儿科全体老师在我攻读专业型博士学位期间对我的关心、帮助和爱护！衷心感谢无锡市第二人民医院转化医学中心的韩志君博士、高明珠实验员在实验中对我提供的帮助及支持！衷心感谢无锡市第二人民医院陈洪敏主任、过毅主任以及全体同仁的关心和支持！衷心感谢我的家人和朋友，一直以来对我的支持、鼓励、关心，无以回报！你们永远健康幸福是我最大的心愿！衷心感谢所有给予我帮助和支持的人，我将永远铭记在心。82 —■－印帝苏州大学研究生院统】