新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立.pdf

《新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

MolecularepidemiologyinvestigationofHPVandestablishmentofthedoubleantibodysandwichELISAdetectionmethodinpartsofnorthernXinjiangADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByWangLi-na(PreclinicalVeterinary)DissertationSupervisor:AssociateProf.WangPeng-yanWangYuan-zhiJune,2016Shihezi,Xinjiang,China 课题来源项目来源：国家科技支撑计划项目名称：新疆地方常见疾病防治适宜技术研究与应用项目编号：2013BAI05B05 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立摘要宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，而高危型人乳头瘤病毒（High-riskhumanpapillomavirus,HR-HPV）的持续感染与宫颈癌的发生关系最为密切。目前宫颈癌的发生率逐渐升高，并呈年强化趋势发展，这不仅严重影响着妇女的生活质量，也给妇女的生命及健康带来严重的威胁。因此明确某一地区HPV的感染现状以及流行型别，并了解宫颈病变样本中HPV的基因变异状况，这对指导HPV疫苗的应用推广和新一代疫苗的设计研究以及新的检测方法的建立具有重要的意义。新疆处于我国西北地区，其宫颈癌的发生率较高，尤其是在新疆南部少数民族聚集的区域，但目前对于新疆北疆地区HPV的流行状况以及疫苗还没有研究。本实验对新疆北疆部分地区的HPV的流行状况以及宫颈病变样本中HPV基因型的分布以及多重感染与宫颈病变的关系进行了研究。并在此基础上通过对基因变异情况的分析来研究适合该地区的HPV疫苗和和建立。研究方法和实验结果如下：1．新疆北疆部分地区HPV的流行状况HPV的持续感染是宫颈癌发生的主要原因。为了研究新疆北疆部分地区HPV的流行状况，和宫颈病变人群中HPV基因型的分布，以及多重感染情况。我们收集了2010年1月-2014年12月就诊于新疆石河子大学第一附属医院妇产科进行第二代杂交捕获法（HybridCapture2,HC2）检测的7298位病人的病例资料，并收集了2014年1月-2014年12月就诊病人的宫颈脱落细胞样本，筛选出经病理学诊断有宫颈病变病人的宫颈脱落细胞样本，并对其进行分子检测，结果显示：（1）新疆北疆地区人乳头病毒的发生率仍处于一个较高的水平，其中年龄<25岁和≥55岁时出现感染高峰；（2）HR-HPV的检出率随着宫颈病变等级的增加而增加，而低危型人乳头瘤病毒的感染率（Low-riskhumanpapillomavirus,LR-HPV）随宫颈病变程度的变化而变化不大；（3）在新疆北疆部分地区至少存在29种HPV基因型，其中HR-HPV17种，LR-HPV12种，其中发生率较高的HR-HPV基因型依次为HPV16、53、52、58、35；（4）在多重感染检测中，主要以二重感染为主，其中以HPV16型的合并感染最为常见，还出现了三重、四重、五重、六重感染，并且多重感染与宫颈病变的严重程度无关。2．HPV流行基因型L1基因的克隆与分析为了研究新疆北疆地区流行的主要HR-HPVL1基因的变异情况，设计了能够扩增HPV16、52、53、58以及在世界范围内发生率较高且致癌性较强的HPV18型的L1全长序列的引物，并经过测序、拼接、比对后获得L1基因序列全长。通过与现有的疫苗株和美国株序列进行比对后发现，在核酸水平上均发生了突变，有些碱基突变甚至导致了氨基酸的改变。以HPV16L1基因为例，对新疆株与疫苗株进行分子生物信息学分析，发现两者之间存在差异。这为新疆北疆地区疫苗的引进以及多价疫苗的研发提供理论依据。同时本章还参照以往报道，筛选出保守性较好的多肽片段，为下一章节单克隆抗体的制备奠定基础。3．HPV16型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立I 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立为了建立适合新疆北疆地区自身发展特点的HPV检测方法，本研究在实验二的筛选得出的保守片段基础上，对多肽片段进行合成，并进行KLH偶联，然后免疫小鼠，最终获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清，Westernblot检测后，筛选出两株特异性较好的细胞株，并对其进行纯化，其中一株纯化的单抗进行辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）标记后作为检测抗体，另一株纯化单抗作为捕获抗体，以此为基础建立检测HPV的双抗体夹心ELISA法。通过对抗体稀释液等条件进行优化，确定捕获抗体的最佳浓度为1.69μg/mL，检测抗体的工作效价为1:100，样品反应时间为45min；酶标抗体作用时间为40min；显色时间为15min，用建立的双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR（Type-SpecificPolymeraseChainReaction,TS-PCR）方法同时检测66份临床宫颈脱落细胞样本，符合率达到81.8%，结果表明该方法具有较好的特异性及重复性，可初步应用于HPV的检测。关键词：宫颈癌；宫颈病变；HPV基因型；多重感染；疫苗；双抗体夹心ELISAII 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立AbstractCervicalcancerisoneofthemostcommonfemalemalignanttumors,thepersistentinfectionofhigh-riskHPV(HR-HPV)iscloselyrelatedtotheoccurrenceofcervicalcancer.Currentlytheprevalenceofcervicalcancergraduallyincreased,andshowedatrendofstrengthening,whichnotonlyaffectseriouslythequalityoflife,butalsoformedaseriousthreattothehealthofwomen.SoitisimportanttoinvestigatetherelationshipbetweenHPVinfectionandthecervicallesionsandtoanalyzetheprevalenceandgeneticvariabilityofepidemicHPVgenotype.InordertopromotetheapplicationoftheHPVvaccineandstudyanewgenerationofvaccines,andalsoestablishanewtestingmethodtodetecttheinfectionofHPV.Xinjiang,locatedinNorthwestChina.Therehasarelativelyhigherincidencesofcervicalcancer,especiallyinsouthernxinjiangminoritynationalityareas.However,atpresent,theresearchonepidemiologicaldataandvaccineofHPVinnorthernregionofXinjiangremainsunclear.Inthisstudy,theprevalenceofHPVinpartsofnorthernregionofXinjiang,thedistributionofHPVgenotypesincervicallesionsinthesampleandtherelationshipbetweenmultipleinfectionandcervicallesionswerestudied.Basedonthisresearch,vaccinessuitableforthisregionandnewdetectionmethodsforHPVwillbestudiedbyanalyzingthegeneticvariation.Themethodsandresultsareasfollows:1.TheprevalenceofHPVinpartsofnorthernXinjiangThepersistentinfectionofHPVisthemajorfactorofcervicalcancer.InordertoinvestigatetheprevalenceofHPV,thedistributionofHPVgenotypesandthemultipleinfectionsincervicallesionsatotalof7,298samplesfromwomenwhowereenrolledforthestudyusingtheHybridCapture2(HC2)testintheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversitywerecollectedandanalyzed.2046casesofcervicalcytologyspecimensin2014werecollected.PeoplewithcervicallesionsweredetectedbyPCR.Theresultsshowedthat:(1)theincidencerateofHPVwasstillatahigherlevel,especiallyfocusonthepopulationwhoistheagein<25and≥55;(2)theinfectionprevalenceofHR-HPVincreasedwiththeseverityofpathologicaldiagnosticgrades.TheinfectionprevalenceofLR-HPVtypes,however,didnotchangenotablybetweendifferentgradesofpathologicaldiagnosis;(3)thereareatleast29kindsofHPVgenotypesinnorthernXinjiang,including17kindsofhigh-risktypes,12kindsoflow-risktypes,andthehigherincidenceofHR-HPVgenotypeswereHPV16,53,52,58,35;(4)amongthemultipleHPVinfections,doubleinfections,especiallycombinedwithHPV16isthemostcommon.Thetriple,quadruple,pentagonalandhexagonalinfectionshavealsoappeared,butthemultipleHPVinfectionwasnotnecessarilycorrelatedwiththeseverityofcervicallesions.2.CloningandsequencingofL1genefromtheepidemicHPVInordertostudythevariationofL1genefromthehighriskHPVinnorthernXinjiangtheL1primersofHPV16,52,53,58aswellasahigherincidenceandstrongercarcinogenicHPV18typeweredesigned.InordertoamplifythefulllengthsequenceofL1,thefull-lengthsequenceofL1genewereobtainedafterthesequenceAssembly.ThroughcomparingthesequenceoftheexistingvaccinestrainsandtheUnitedStatesstrains,themutationwasfoundandsomemutationsevenleadtoaminoacidchange.TakeHPV16forexample,thedifferenceswerefoundbetweentheXinjiangstrainsandvaccinestrainsbythemolecularbioinformaticsanalysis.TheseresultswillaffordatheoreticalbasisforintroducingvaccinesanddevelopingthemultivalentvaccinesforHPVofNorthofXinjiang.Thestudyalsoreportedtherewasagoodconservativescreenedpolypeptidefragmentwhencomparedthepaststudy,andlaythefoundationforthepreparationofmonoclonalantibodiesinthenextchapter.3.DetectionofmonoclonalantibodiesofHPV16andestablishmentofthedoubleantibodysandwichIII 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立ELISAdetectionmethodforHPVInthisstudy,thepolypeptidefragmentwaschoosedinthesecondexperiment,andthenmithridatizedmiceaftercoupledwithKLH,15monoclonalantibody-containinghybridomacellculturesupernatantwereobtained.Onlytwopositiveclonesweregotbywesternblottesting.WiththehelpofthepurifiedmonoclonalantibodyandtheHRP-labeledmonoclonalantibody,thedoublesandwichELISAdetectionmethodwasdevelopedtodetecteHPVL1innorthernXinjiang.Thelineardetectionrangewas1.69μg/mLpurifiedpolyclonalantibody,andHRP-labeledmonoclonalantibody.ThesampleandHRP-conjugatedantibodyreactiontimewere45minand40min,respectively.Andthechromogenictimewas15min.Theagreementratefromsixty-sixclinicalcervicalcellsamplesdetectedbytheELISAandTS-PCRwas81.8%.TheresultsrevealedthatthedoublesandwichELISAhadgoodspecificityandrepeatability,whichcouldlaythefoundationfortheestablishmentofaquickandeasyHPVdetectionmethod.Keyword:cervicalcancer;cervicallesions;HPVgenotypes;multipleinfections;vaccine;doubleantibodysandwichELISAIV 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立目录摘要..................................................................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................................................III目录................................................................................................................................................................V中英文缩略词表.........................................................................................................................................VII第一章文献综述...........................................................................................................................................11HPV的分子结构......................................................................................................................................12HPV分型及各型别的致病性..................................................................................................................23HPV基因型的流行状况..........................................................................................................................54HPV感染与宫颈癌及癌前病变的关系..................................................................................................75HPV多重感染与宫颈病变的关系..........................................................................................................76宫颈癌发生的危险因素...........................................................................................................................76.1病毒因素........................................................................................................................................86.2宿主因素........................................................................................................................................87宫颈癌的预防...........................................................................................................................................97.1宫颈癌的普查................................................................................................................................97.2疫苗预防........................................................................................................................................98宫颈癌的检测方法.................................................................................................................................118.1细胞学检查..................................................................................................................................118.2感染组织中HPV蛋白的检测....................................................................................................118.3HPV感染的血清学检查.............................................................................................................118.4HPV检测.....................................................................................................................................128.5酶联免疫吸附试验技术..............................................................................................................13第二章...........................................................................................................................................................16实验一新疆北疆部分地区HPV的流行状况.......................................................................................161材料与方法...............................................................................................................................................171.1材料..............................................................................................................................................171.2方法..............................................................................................................................................202结果...........................................................................................................................................................252.1HPV检出率.................................................................................................................................252.2宫颈脱落细胞样本中HPV感染率............................................................................................252.3PCR检测结果.............................................................................................................................262.4HR-HPV检测..............................................................................................................................282.5多重感染......................................................................................................................................303讨论...........................................................................................................................................................32实验二HPV流行基因型L1基因的克隆与分析..................................................................................361材料与方法...............................................................................................................................................371.1材料..............................................................................................................................................371.2方法..............................................................................................................................................372结果.........................................................................................................................................................392.1HPV16、58L1基因的扩增........................................................................................................392.2HPV18、52L1基因的扩增.......................................................................................................40V 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.3HPV53L1基因的扩增...............................................................................................................412.4HPVL1的生物信息分析............................................................................................................413讨论...........................................................................................................................................................46实验三HPV16型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立................................491材料及方法...............................................................................................................................................501.1材料..............................................................................................................................................501.2方法..............................................................................................................................................522结果...........................................................................................................................................................562.1杂交瘤细胞培养上清的筛选......................................................................................................562.2双抗体夹心ELISA检测方法建立中各条件的优化...............................................................572.3双抗体夹心ELISA方法验证.....................................................................................................613讨论...........................................................................................................................................................62总结...............................................................................................................................................................64展望...............................................................................................................................................................64参考文献.......................................................................................................................................................66附件1............................................................................................................................................................73附件2............................................................................................................................................................74附件3............................................................................................................................................................76致谢.............................................................................................................................................................78作者简介.................................................................................................................................................79石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅书...........................................................................................80VI 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立中英文缩略词表英文缩写中文名称英文全称TCT液基薄层细胞检测ThinprepcytologictestHC2第二代杂交捕获法HybridCapture2CIN宫颈上皮内病变CervicalIntraepithelialNeoplasiaHPV人乳头瘤病毒HumanpapillomavirusHR-HPV高危型人乳头瘤病毒HighriskHumanpapillomavirusLR-HPV低危型人乳头瘤病毒LowriskHumanpapillomavirusL1主要衣壳蛋白MajorcapsidproteinL2次要衣壳蛋白MinorcapsidproteinCA尖锐湿疣CondylomaAcuminataDNA脱氧核苷酸DeoxyribonucleicacidGenBank核苷酸序列资料库genebankbp碱基对basepairdNTP脱氧核糖三磷酸DeoxynucleosidetriPHosPHateTaqDNAaseTaqDNA聚合酶TaqDNApolymeraseLBLuria-Bertani培养基Luria-BertanimediumAmp+氨苄青霉素抗性AmpicillinresistanceTAETris-乙酸-EDTA电泳缓冲液tris-aceticacid-EDTAbufferTMB四甲基联苯胺TetramethylbenzidineSDS十二烷基磺酸钠sadiumdodecylsulfatePAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamideelectroPHorisisTris三羟甲基氨基甲烷hydroxymethylaminomethansVLPs病毒样颗粒VirusLikeParticlesmg毫克milligramμg微克microgrammL毫升millitliterμL微升MinutelitermM毫摩尔/升MillimoleperliterμM微摩尔/升Minuteperliterrpm转/分钟rotationperminutePCR聚合酶链式反应polymerasechainreactionELISA酶联免疫吸附实验Enzyme-linkedimmunosorbentassayPHPH值PHvalueOD光密度Opticaldensityh小时hourmin分钟minutes秒secondHRP辣根过氧化物酶HorseradishPeroxidaseVII 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立第一章文献综述宫颈癌是严重威胁妇女健康的主要疾病之一，在全球恶性肿瘤疾病中仅次于乳腺癌，在发展中国家居首位，在发达国家低于乳腺癌、子宫内膜癌，居第三位。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）报道，全世界每年大约有50万宫颈癌新发病例，其中80%发生在发展中国家，约28.8万人因宫颈癌而死亡。我国每年新发病例14[1,2]万，约占世界宫颈癌新发病例的28%，为我国妇女生殖道恶性肿瘤的首位。目前宫[3]颈癌的发病逐渐呈现年轻化趋势。宫颈癌的病因学研究一直倍受国内外学者的重视，1973年ZurHause首次提出了病毒感染是宫颈癌致病因素的假设，并与1976年首次从宫颈癌组织中分离出人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus,HPV），指出HPV的感染与宫颈癌的发生存在着必然的联系[4][5]；1992年WHO宣布HPV是引起宫颈癌变的首要因素；国际癌症研究中心（InternationalAgencyforResearchonCancer,IARC）专题讨论会（1995）将HPV感染确定为宫颈癌的主要病因，明确宫颈癌是一种感染性疾病，HPV感染是宫颈癌发生的主[6]要因素。1HPV的分子结构HPV病毒是一种分子量较小的双链环状DNA病毒，呈球形，无包膜，直径约为[7]45-55nm，为20面体立体对称结构，表面有72个壳微粒。HPV主要感染皮肤和粘膜[8]的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化。该病毒属于乳头瘤病毒家族（Papovaviridaefamily）的成员。该家族的病毒成员还包括牛乳头瘤病毒、狗口腔乳头瘤病毒、棉尾兔[9]乳头瘤病毒、多乳房小鼠乳头瘤病毒和鹿乳头瘤病毒等哺乳动物的类型。6HPV各型基因组全长约在7200-8000bp之间，分子量大小为5×10KDa，其中88%为病毒蛋白。HPV基因组分为编码区和非编码区，编码区又分为早期区和晚期区：i）早期区（earlyregion）又称为E区，编码的蛋白有E1、E2、E4、E5、E6和E7，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能；ii）晚期区（lateregion）又称L区，只编码两种衣壳蛋白，分别为主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，这两种蛋白是构成病毒样颗粒（VirusLikePartides,VLPs）的主要成分。非编码区又称上游调控区（UpstreamRegulatoryRegion,URR）或长控制区（longcontrolregion,LCR），由1000个碱基对组成。该区含有DNA复制的起点和基因表达所必需的调控原件，调控病毒的复制和转录。所有的开放阅读框（OpenReadingFrames,ORF）蛋白编码序列均位于其中的一条单链上，从上游的LCR开始，其后的ORF分布顺序分别为E6、E7、E1、E2、E4、E5、L2、L1。1 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图1.HPV基因组结构示意图Fig.1ThegeonomicstructureofHPV2HPV分型及各型别的致病性HPV为小DNA病毒，不同的HPV基因型之间在结构上存在着差异，而这种差异[10]往往会导致其存在部位以及可能导致的皮肤病变类型的不同。目前已发现和鉴定的[11]HPV型别约有100多种，其中40多种亚型与生殖道感染有关。其中根据感染部位的[12]不同将HPV分为嗜皮肤类和嗜粘膜类。而后者根据其致病力的不同又分为：i）高危型HPV（High-riskHumanPapillomavirus,HR-HPV），分别为HPV16、18、31、33、35、[13]39、45、51、52、56、58、59、68、73和82等15种型别，HR-HPV除了可引起外生殖器疣外，还可引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，尤其是宫颈癌与[14]HR-HPV的感染关系密切，约99.7%的宫颈癌样本中都能发现HR-HPV的感染；ii）低危型HPV（Low-riskHumanPapillomavirus,LR-HPV），目前已鉴定的有12种，如HPV[15]6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、CP6108、CP8104和90等。主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道部位的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤变；iii）未确定性及可能高危型，如HPV26、34、53、66、83等。但在一些研究中HPV26、53、66被归类到HR-HPV范围内。另外，还有一种分类方法是根据不同乳头瘤病毒在进化树中亲缘关系的远近进行分类。在将它们进行分类的同时还引入了生物学中的“属”和“种”的概念，2004年以BernardHU为首的工作组根据新的国际病毒分类委员会（TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）对乳头瘤病毒重新进行了分类，分类标准以L1区的核苷酸之间的同源性差异将118型乳头瘤病毒（其中96型HPV）分成了16个属，其中的α、[16]β、γ、μ、ν5个属是由类人猿和人的乳头瘤病毒组成的。其中临床上最重要的属是-PV属，这个属包含了所有与粘膜和生殖道病变相关的型，如图2。2 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图2.人乳头状瘤病毒致癌性进化关系进展。其中属于属的HPV类型（左）主要感染黏膜，包括肛门、生殖器和口腔。在蓝色进化分支上（1，8，10和13）的HPV类型主要导致尖锐湿疣。在绿色进化分枝上（2，3，4，和15）HPV类型通常会引起共感染。在红色进化分枝上（5，6，7，9和11）的HPV类型（右侧）主要可引起子宫颈癌和不同程度的上皮内瘤样病变。其中在世界各地最常见的能够引起子宫颈癌的八种HPV基因型属于-9，有较少一部分属于-7。IARC根据不同HPV基因型的致癌性对它们进行了分类：1=致癌性，2A=可能致癌，2B=潜在致癌。Fig2.TheevolutionofHPVtypespredictscarcinogenicity.HPVspeciesinthealPHagenus(left)infectmucosa,includingtheanogenitalregionandtheoralcavity.HPVtypesintheblueclade(whichcomprisesspeciesa1,a8,a10,anda13)includetheHPVtypesthatcausegenitalwarts.HPVtypesinthegreenclade(whichcomprisesspeciesa2,a3,a4,anda15)causecommensalinfections.HPVtypesintheredclade(whichcomprisesspeciesa5,a6,a7,a9,anda11)(shownindetailontheright)areassociatedtodifferentdegreeswithcervicalcancerandcervicalintraepithelialneoplasiagrade3.TheeighttypesthatmostcommonlycausecervicalcancereverywhereintheworldbelongtospeciesalPHa-9or,toalesserextent,toalPHa-7.ThecarcinogengroupforeachHPVtypeisaccordingtotheInternationalAgencyforResearchonCancer(19):group1=carcinogenic,group2A=probablycarcinogenic,andgroup2B=possiblycarcinogenic.近年来国内外有关宫颈癌的病因学研究表明，HPV感染尤其是HR-HPV的持续性感染与宫颈癌前病变以及宫颈癌密切相关。有研究显示，HR-HPV对宫颈上皮内瘤样病[17,18]变（CervicalIntraepithelialNeoplasia,CIN）的发展具有促进作用。在超过99%的宫颈样本中都可以检测HPVDNA的存在，其中HPV16是最主要的感染型别，其次是HPV3 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[19-21]18。此外，不同的HPV型别与宫颈癌病理类型存在差异。HPV16在鳞状细胞癌中[20-22][23]高度集中，而HPV18型与宫颈腺癌和腺鳞癌发病的相关性更为显著。Alonso等对77例患有CINI需要手术治疗的妇女分别用细胞涂片、阴道镜和HR-HPV检测进行了治疗前和治疗后的比较。在实验中发现，治疗前宫颈病变程度与HR-HPV感染率成正相关；术后病变复发或残留与治疗前HR-HPV阳性有直接相关性,并且主要由HPVDNA[24]的病毒载量决定。Clifford等通过对高度鳞状上皮内病变（High-gradesquamousintraepitheliallesion,HSIL）患者的HPV感染资料统计分析发现，有HPV16，18型感染的HSIL患者更容易发生宫颈癌。但不同的研究可能会存在差异，如有研究表明致病性较强的型别依次是HPV16、58、33、18等。4 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立3HPV基因型的流行状况[25,26]不同地区HPV基因型的分布存在着差异。IARC对包括全球25个国家的3607例宫颈癌患者的多中心研究中发现：HPV16在所有HPV阳性的宫颈癌患者感染率最高[27]。另外，由IARC公布的15种最常见HPV亚型的发生率依次为HPV16、18、45、31、33、52、58、35、59、56、39、51、73、68、66。除HPV16外，HPV18的感染率居第2位，HPV45在非洲、欧洲、北美等地处于第3位，但在南美洲和美国中南部处于第3位的却是HPV31型，在非洲北部居第4位的是HPV33和31，而非洲南部则为HPV33、58和56，美国中南部是HPV45和33，南亚是HPV52和58，欧洲和北美是[25][28,29]HPV31和56、68亚型。而在亚洲国家HPV52和58型占一定的优势。表1显示了世界不同国家及地区HPV的基因型分布。表1不同国家的HPV基因型分布Table1.ThedistributionofHPVgenotypeindifferentcountries国家优势基因型或主要基因型分布数据来源法国16、31、33、52、51、58（CIN2/3）PretetJL(2008)法国16、18、31（宫颈癌）PretetJL(2008)英国16、18、31、51、52SargentA(2008)意大利16、18MasiaG（2009）德国16、31、52、51、18、45KlugSJ(2007)奥地利16、18TempferC(2008)冰岛16、33、31、52、18、58（CIN2/3）SigurdssonK（2007）前苏联16、31、33KulmalaSM（2007）墨西哥16、31、18、35Lopez-Reviua(2008)南非16、52、35、18DennyL(2008)以色列16、39、52、18GrisaraD(2008)印度16、18、45、33、35、58、59、31BhatlaN(2008)韩国16BaeJH(2008)韩国16、33、58KimCJ（2003）越南52、16、58、51、18HernandezBr(2008)日本16、52AnHJ(2003)朝鲜16、58、18、39、52、56、51ChoNH(2003)在我国，由于人口众多，地域辽阔，HPV基因型的分布也较为复杂，每个地区HPV基因型的分布既符合亚洲人的特点，又存在该地区本身的特点。目前的研究已表明HPV16和18型感染与宫颈癌的关系密切，除了HPV16和18型外，HPV52和58亚型感染5 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立的比例也较高，尤其在香港和上海等地。在这些地区的宫颈癌患者中HPV52和58型的[30]感染占主导地位。表2显示了我国不同地区HPV基因型的分布。表2我国不同地区HPV基因型分布Table2.ThedistributionofHPVgenotypesindiffenentareasofChina地区优势基因型或主要基因型分布数据来源台湾16、52、58LinH（2006）香港52、58CarvalhoMO（2003）香港16、18、58LiuSS（2008）深圳16、18、58、52、33DaiY(2007)广东潮州52、58、16、18、CP8304LinM(2008)广州16、33、18、52(宫颈癌)曾莉（2007）广州东部52、16、58、18余南（2009）粤东地区16、18林广玲（2006）广西百色16、58、18、31、33常正义（2007）重庆16、58崔舫（2008）新疆南部16、18鲁静（2009）上海52、58（宫颈癌）HuangS（1997）江西16、58、33、31（宫颈癌）吴玉萍(2005)武汉16、18、58、33、56胡兴文（2007）绍兴市区16、52、58、68、18陶萍萍（2008）合肥16、52、33、58、18齐丽敏（2010）山东16、52、58、18刘敏（2007）山西16、58、52DaiM（2006）天津16、18、58、52刘静（2008）北京16鲍彦萍（2007）北京16、58、52、33赵健（2006）北京16、58、52、18LiY（2008）辽宁16、58、52罗秀波（2008）沈阳16、58、33、31、52、53刘霞（2009）通过对我国不同地区宫颈癌发生率的研究表明：宫颈癌的发病率和死亡率随着不同地区地理环境、经济状况的不同而不同，例如宫颈癌主要高发于中西部地区，且山区宫[31]颈癌的分布要大于平原。另外，各民族之间宫颈癌的发生率也存在着差异，通过调查我国56个民族的宫颈癌的发生情况，发现维吾尔族的宫颈癌死亡率最高，其次是蒙古[32]族、回族，而藏族、苗族、彝族相对较低。6 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立4HPV感染与宫颈癌及癌前病变的关系[33]HPV主要的感染途径是通过性传播，少数也可通过消化道感染或母婴传播。人类是HPV的唯一自然宿主，HPV具有严格的组织特异性，主要感染皮肤和粘膜鳞状细[34,35,36]胞，病毒DNA主要以整合的方式进入宿主基因组中。HPV的早期编码蛋白E6和E7具有病毒癌基因的功能，它们与细胞的恶性转化以及肿瘤的发生密切相关。E6和E7蛋白可分别与抑癌基因P53和pRB结合，使其失去活性，破坏细胞增殖周期的正常[37]调控，从而导致细胞永生化而持续恶性增殖。[4,5,6]目前研究已表明HPV感染是宫颈癌及癌前病变发生的主要原因。据文献报道，HPV在正常人群、CINI、CINII、CINIII、宫颈癌组中的检出率分别为4%、30%、55%、[38]65%、99.8%。但HPV的感染不一定会导致宫颈癌的发生。这是一个渐进的演变过程，[39]从HPV感染发展到CIN最后发展为宫颈癌大约需要数年到几十年时间。HPV感染[40]过程可分为3个阶段：潜伏期、感染期、临床症状期。宫颈癌的发生也会经历一系列[41]的病变过程：依次为CINI、CINII、CINIII。有资料显示在妇女一生的时间中，约有80%的妇女会受到HPV的感染，而大多数妇女一般不会出现临床症状，只有5%-10%会[42]发展为持续性感染，而最终发展为宫颈癌的只有2%-3%。因此对有性生活的妇女进行筛查，在确定有HPV感染时，对其进行有效的干预和治疗，这将会有效的阻断病情的发展，预防宫颈癌的发生。5HPV多重感染与宫颈病变的关系不同HPV亚型的的致病力是不同的，HR-HPV的持续或反复感染成为宫颈癌发生[10,17,18]的主要原因。但由于不同HPV基因型之间基本上没有交叉保护性抗体，容易造成[43]不同HPV基因型的多重感染。在对世界15个地区HPV阳性妇女的多重感染分析中[44,45,46]发现，HPV多重感染的发生率达到了25%。由于HPV多重感染病毒载量高于HPV单一感染，癌变相关风险更大，且致病力更强，病变发展更快，复发率更高，是宫颈癌[47]发生的一个非常重要的危险因素。Munagala等报告伴HPV多重感染的宫颈癌患者治[48]疗失败率是单一感染者的5倍。但对于不同亚型的HPV的多重感染是否会增加或促进宫颈癌的发生，目前还没有一致的意见。6宫颈癌发生的危险因素宫颈癌及癌前病变是一个多因素、多步骤的疾病，主要包括两类：（1）病毒因素；（2）宿主因素。7 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立6.1病毒因素目前已发现至少约有40多种HPV型别可以感染生殖道系统，但其中只有一部分与[49]宫颈癌的发生发展有关。不同HPV型别的致癌性是不同的，尤其是HPV16、18在宫[10,20]颈癌组织中的检出率比其他类型的HPV的检出率要高。但不同的国家和地区以及地理环境和种族之间可能存在差异。因此明确不同国家地区宫颈癌及相关组织中主要流行的HPV型别，将会对宫颈癌的预防个防治具有重要的意义。6.2宿主因素与宫颈癌的发生相关的宿主因素主要包括性行为，年龄，生育次数，吸烟，长期口服避孕药等因素。6.2.1性行为持续的HR-HPV感染是宫颈癌发生的必要条件，而许多与性行为有关的因素会增加HPV感染或重复感染的几率。例如妇女的性伴侣个数，初次性行为的年龄等都能够明[50,51,52]显的增加HPV的感染几率。6.2.2年龄国外宫颈癌流行病学调查显示，25-35岁年轻宫颈癌患者的发病率在20世纪50年[53]代为9%，20世纪80年代已上升到24%，提示宫颈癌有向年轻化的趋势发展。有研究表明HPV的感染会存在两个高峰。第一个感染高峰约在20-25岁，在此阶段的年轻[54]女性由于性生活频繁，免疫系统尚未得到完善，因此易受到HPV的感染；但是随着年龄的增长，尤其是绝经期妇女体内激素水平波动较大，着对宿主的生理和免疫系统的调节会产生较大影响，宿主对病毒感染的清除或抑制作用减弱，致使HPV出现持续感[55]染，在此阶段出现HPV感染的第二高峰。另外，不同的地区感染高峰的出现可能会存在不同的差异，这与当地的医疗条件以及对宫颈癌的筛查力度有关。例如在缺乏宫颈病变筛查的地区，发生宫颈浸润癌的年龄会比其他地区的早。6.2.3生育次数有学者研究发现多产能增加HPV感染的几率，因为多次生产会使宫颈口外翻，恢[56]复缓慢；还有多次生产会改变机体雌激素和孕激素的水平，影响机体免疫系统的功能[57]。6.2.4口服避孕药关于口服避孕药是否会增加宫颈癌的发病率，尚存在争议。一些流行病调查数据显[58]示长期使用口服避孕药的患者发生宫颈癌的几率要明显提高。但也有学者认为宫颈癌8 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[59]的使用并不能增加宫颈癌的患病率。6.2.5吸烟吸烟可能与宫颈癌的发生有关，研究表明吸烟患者宫颈癌的患病率比不吸烟患者的[58]患病率要高，这主要是因为吸烟会抑制机体的免疫系统，增加HPV的感染几率。Núñez[61]等对委内瑞拉女工人调查显示CIN和宫颈癌发生的几率会随着女性每日吸烟量和吸烟时间的增加而增加。另外，一些其他因素也会增加宫颈癌的患病机率，如机体免疫力减低或存在免疫缺陷时，更易受到HPV的感染。人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV）[62,63,64]血清学阳性的妇女HPV感染的几率会明显增加；宿主的遗传背景对HPV的感染[65]与持续感染都存在着重要的影响。7宫颈癌的预防由于人们已经知道宫颈癌发生的危险因素，因此首先提出的预防宫颈癌的方法是从[49]改变生活习惯入手，适龄生育，杜绝性乱，及时诊治性传播疾病。但这种预防方法是有限的。由于已经明确了HPV与宫颈癌的关系，因此预防宫颈癌的方法得到了很大的提高。这主要体现在两方面：（1）加大宫颈癌的普查力度；（2）HPV疫苗的研究。7.1宫颈癌的普查由于宫颈癌是唯一一个病因相对明确的肿瘤，也是唯一一个可以早发现和预防的肿瘤同时还是唯一一个可以治愈的肿瘤，因此宫颈癌是WHO唯一建议的在世界范围内开[66,67][68]展筛查的恶性肿瘤。WHO推荐的筛查年龄在30岁以上，而在美国>21岁的妇女[69]就要进行细胞学筛查。半个世纪以来，宫颈癌筛查在多数西方发达国家得到了广泛地应用，并且获得了很好的效果。但是，由于宫颈癌的筛查需要完善的卫生保健基本设施（包括实验室条件和高级技术人员）以及有效的后续治疗，并且需要多次重复检查。这对于资源匮乏地区（如我国的西北地区）妇女来说是不可能的的。另外，由于种族差异、移民状态、居住环境、宗教信仰、认识不足、教育缺乏以及尴尬等因素都影响着宫颈癌筛查的实施和推广。7.2疫苗预防由于HPV不能在体外培养，这一直限制着HPV疫苗的研究进展。21世纪以后，灵长类动物HPV抗体检验方法的建立，以及利用分子生物学方法在酵母中表达HPV16、18型的（virus-likeparticles,VLPs），成功地诱导动物机体产生抗HPV病毒的免疫反应9 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[70,71]。目前HPV疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要诱导机体产生体液免疫反应，产生的中和性抗体，在HPV进入机体前即能与病毒的抗原结合，从而防止HPV的感染的发生。治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性T细胞能识别和攻击被HPV感染的细胞，其中也包括HPV感染引起的恶性肿瘤细胞。7.2.1预防性疫苗[72]预防性疫苗一般以HPV的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，其作用在于诱发机体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应，以阻止HPV的长期感染和再感染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能够自我装配形成VLPs，其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，将其置入机体后可刺激产生中和[73]抗体IgG和IgA，达到预防相应型别HPV的感染，而且不包括病毒DNA，安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可能性。目前已经被批准上市的预防性HPV疫苗有两种，它们分别是美国默克（Merck&Co.,Inc.）公司生产的四价疫苗“Gardasil”（商品名）和英国葛兰素（GlaxoSmithKline,GSK）[74]公司的双价疫苗“Cervarix”。2006年，“Gardasil”被批准上市，这是世界上第一个可预防HPV6、11、16、18型的商品化宫颈癌预防性疫苗。2007年，英国葛兰素公司生产的二价疫苗“Cervarix”上市，该疫苗是由HPV16、18型的L1-VLPs组成的重组混合型疫苗。这两种疫苗主要接种未发生HPV感染的人群，并且只能预防HPV的感染以及相关疾病的发生而没有治疗性。两种疫苗的抗原都是HPV的主要衣壳蛋白L1。临床试验结果表明，两种疫苗均具有较好的耐受性，且没有严重的不良反应。另外各国专家委员会[75,76]推荐疫苗接种的目标人群为9-26岁的女性。尽管9-55岁的女性在接种后都能产生有力的免疫应答，但两种疫苗的研究结果均表明，青春早期少女比15岁以上女性所产[77]生的免疫应答强度更高。因此进行全面常规免疫接种的最佳年龄约在12岁左右。2014年美国Merck公司又研发出了九价预防型HPV疫苗，主要可以预防HPV6、11、[78]16、18、31、33、45、52、58九种HPV基因型的感染。目前正在进行III期临床试验。作为人类第一个针对肿瘤的预防性疫苗，HPV疫苗的诞生具有里程碑式的意义。但需要指出的是，目前的疫苗在预防宫颈癌的实际应用中还存在着许多局限性。首先，临床实验表明，目前已上市的两种疫苗只针对个别型别的HPV感染，而对不包括疫苗在内的其他HPV型别的感染是没有预防作用的。因此疫苗的整体预防效果取决于人群中HPV的基础感染型别，但不同地区HPV感染的类型是不同的。并且两种疫苗的III期实验人群主要集中在北美洲，欧洲，拉丁美洲等地区，而亚洲国家只占很少一部分（尤其是Gardasil）。因此疫苗在不同地区不同人群中应用时需要有完善的流行病学资料作为指导。其次，现有的疫苗价格非常昂贵，而且需要在低温保存，这极大地限制了其在经济相对落后的发展中国家的应用。再次，现有的疫苗的免疫持续时间、长期效果、安全性、不良作用、是否需要强化接种及最终预防效果的评定都还有待时间和Ⅳ期临床试验证实10 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[79,80,81]。因此目前，当前可用的疫苗尚还不能替代宫颈癌筛查。但如果能够妥善处理疫苗的费用问题，覆盖更多的高危型别，并配套制定合理的接种程序，那么HPV疫苗将是一种比传统的细胞学-活检-治疗的筛查方案更经济，更有效的宫颈癌防治手段。7.2.2治疗性疫苗由于预防性疫苗对于已经感染HPV并引起癌前病变的患者是没有保护能力的，因此治疗性疫苗的研究是目前研究者研究的热点。目的是通过细胞免疫来减少已经感染HPV的细胞表达晚期基因和阻止整合病毒颗粒的细胞向癌前病变和癌症发展。由于HPV感染引发的癌前病变以及癌症的发生主要是由HPVE6、E7的协同作用所致，因此目前[82]针对以E6、E7为靶抗原的HPV治疗性疫苗成为研究的重点。由于HPVE6、E7蛋白具有致癌性，通常会对这两种蛋白进行修饰（突变和改造），使其失去致癌性，只保留免疫原性，降低将HPVE6、E7蛋白疫苗应用于治疗性疫苗开发的风险，保证其安全。目前存在的HPV治疗性疫苗的类型主要有：DNA疫苗、多肽/蛋白质疫苗、活病毒载体疫苗、RNA疫苗。但目前尚无有效的HPV治疗性疫苗问世。但重组蛋白疫苗、多肽疫苗已进入二期临床试验，并显示出良好的前景。8宫颈癌的检测方法8.1细胞学检查包括传统的巴氏涂片（PapSmear）和液基薄层细胞学（Thinprepcytologictest,TCT）技术。该方法操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查，但凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理学医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率高、不能对HPV进行分型等不足。8.2感染组织中HPV蛋白的检测该方法主要针对HPV抗原，主要是利用衣壳蛋白制备抗体，通过免疫学方法进行检测。该方法原理明确，操作简单，但由于HPV至今尚不能在体外培养，且其免疫原性较弱，因此血清学方法检测的灵敏度较低。8.3HPV感染的血清学检查该方法通过检测人体血清中是否存在有针对HPV感染产生的抗体，通过免疫学方11 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立法进行检测。但该方法检测的对象主要是抗原抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，因此血清学检测对无免疫应答和HPV潜伏期感染者会产生漏检。8.4HPV检测由于HPV检测更具与敏感性，目前已成为宫颈癌筛查的重要方法之一。目前依据于聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）的HPV检测技术得到了快速的发展，该技术是在1985年由美国人Mullis和Saiki创建的，它是一种在体外由引物介导的DNA[83,84]序列酶促合成反应，又称之为基因扩增技术。这一技术的出现给HPV检测的各个方面提供了巨大的发展空间。目前用PCR来扩增基因是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，它可以用于检测、病毒载量、DNA测序和突变分析，以及多重扩增。因此以PCR为基础的检测方法来对HPVDNA检测及分型是目前认为最好的方法。HPVDNA的PCR扩增主要可以分为型特异性PCR和普通PCR。8.4.1型特异PCR型特异性PCR法(Type-SpecificPCR,TSPCR)是通过型特异性引物，来对HPV进行感染的诊断。不同的HPV基因型要选用不同的型特异性引物来扩增。用型特异性PCR后即可确定特定型别的HPV，但只能扩增序列已知的HPV基因型并且这种方法费时费力，为了检测一个临床样本中HPVDNA的存在，需要分别完成多个型特异性PCR反应。8.4.2通用引物PCR通用引物PCR是使用通用引物来扩增广谱的HPV，针对不同HPV型别之间的保守区域来设计引物。由于在HPV基因组中L1区是最为保守的区，因此目前经常使用的通[85]用引物就针对这个区，如GP5+/6+、MY09/11、SPF10等。这些引物可以有效的扩增现在已知的大部分HPV基因型，尤其是生殖道感染的HPV基因型别。同时这些通用引物还可以发现新的病毒基因型、亚型、以及病毒变异体。为提高普通PCR的敏感性，也常用巢式PCR，如先用MY09/11扩增后用其扩增产物作模板再用GP5+/6+扩增，可[86]检测到较低的病毒含量。除上述两种方法外，目前较常用的方法还包括实时荧光定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR），该方法由于操作时是闭管操作，因此可消除核酸之间的交叉污染，并且灵敏度高、并且具备定量功能。但工作量太大，成本较高，不适合大规模推广使用。目前以PCR为基础的检测方法在宫颈癌的筛查以及治疗中存在着重要的临床价值。例如：（1）对于没有明确意义的不典型鳞状上皮细胞（AtypicalsquamousCellofUndeterminedSignification,ASCUS）和轻度的CIN可以做进一步的判断，从而进一步分类，它能将CIN从细胞学结果为没有明确意义的非典型鳞状细胞/腺细胞（ASCUS/AGUS）中有效地检出，减少了通过阴道镜下活检来明确宫颈癌前病变的数量；（2)单独或联合细胞学对宫颈癌患者进行初筛，简单易行，该方法对大规模的筛查宫颈12 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立癌高危人群具有重大的价值；（3）根据患者感染的HPV基因型来预测受检者的发病风险，决定其筛查间隔,对于细胞学和HPV均阴性者，可适当延长其筛查间隔，细胞学阴性而HR-HPV阳性者，发病风险率较高，对此类人群要定期随访；（4）高度宫颈上皮内病变和癌症治疗后的监测。PCR技术在诊断HPV感染和致癌机制的研究中具有广阔的应用前景。不仅可以用于确定临床上HPV与宫颈病变的关系、调查不同人群或个体HPV的感染率，应用于大范围内的流行病调查；而且还可以更多地应用到HPV致病、致癌机理的研究中。另外，可更进一步的应用于宫颈癌疫苗的研发以及治疗手段的评估。除PCR法外，另一个常用的HPV检测方法是由美国Digene公司开发的第二代杂交捕获法（HydridCapture2,HC2），该方法是目前美国食品和药物管理局（FoodandDrugAdministration,FDA）唯一批准的可在临床使用的HPVDNA检测技术，已获得欧洲CE及中国SDA的认证。该方法采用96孔平板法和非放射性RNA作为探针，可同时检测出13种HR-HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）和5种LR-HPV[87]（6、11、42、43和44型）。该方法具有灵敏度高、特异性好的特点，但是易存在交叉污染，且不能对病毒进行分型，对未知的HPV基因型或存在变异的HPV则不能有效地扩增。除以上两个常用方法，还有一些方法也可以用来进行HPV检测，如：Southern杂交法，原位杂交法等。这些方法虽然各自有着一些优点，但它们的灵敏度不好，并且不适用于样本量较大的检测。随着HPVDNA检测及分型方法的迅速发展，在子宫颈癌及癌前病变的预防性筛查，协助诊断，预后判断等方面发挥了重要作用。但是，随着HPV的检测目的不同，适用的方法也就不同。与发达国家相比，我国的子宫颈癌防治工作中的主要问题是缺乏性能优异、价格低廉、易于普及推广的HPV检测产品。因此我国仍迫切的需要可应用于大面积人群早期筛查、诊断的高质量HPV检测方法。8.5酶联免疫吸附试验技术酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay,ELISA）自上世纪70年[88]代初问世以来，凭借其高度的敏感性被广泛应用于生物学和医学科学等许多领域。如今历经四十多年的发展，已被更广泛的应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。8.5.1ELISA方法的基本原理建立ELISA方法包括两个基础：（1）抗原/抗体的固相化，即结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性；（2）抗原/抗体酶标记，即酶标记的抗原或抗体既保留了其免疫学活性，又保留酶的活性。在检测时，将抗原和抗体稀释后，加入到固相载体上，使其与固相载体进行结合；再将待检的抗体/抗原与之进行反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原/抗体，13 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立通过反应，使其结合在固相载体上。这样固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例结合，然后洗去未结合的酶标记物，接着加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，因此可以根据显色反应的深浅来定性或定量分析待检抗原/抗体的量。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，从而使检测方法达到很高的灵敏度。8.5.2方法的分类ELISA方法既可以用于检测抗原，也可用于检测抗体。基于以上原理，可以设计出不同类型的ELISA检测方法。主要包括四类：（1）直接ELISA；（2）间接ELISA；（3）夹心ELISA；（4）竞争性ELISA。其他ELISA是在这几种ELISA的基础上发展起来的。8.5.2.1直接ELISA直接ELISA是所有ELISA检测方法中操作最简单的一种，其方法是用包被缓冲液将抗原按一定的比例稀释之后包被在固相载体上，用特异性的酶标抗体进行检测。该方法操作简单，步骤简练，但这种ELISA方法在检测过程中只经过了一步信号的方法（酶的放大），所以其灵敏性不是很好，测定的对象也是有限的。8.5.2.2间接ELISA间接ELISA是检测抗体最常用的方法。其原理是利用酶标记的抗抗体来检测已经与固相结合的受检抗体。在间接ELISA中，待检抗体（一抗）与包被在固相载体上的抗原结合，之后加入酶标记的二抗（抗抗体），它可以与第一种抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。当二抗的量一定的时候，最终的显色结果与一抗的量呈正相关。由于在该反应中，信号经过两次放大，提高了检测的灵敏度。此外，二抗制备比较容易，已经开始商品化，所以不需要再将一抗进行酶标，这样可以大大缩减工作量。8.5.2.3双抗体夹心ELISA双抗体夹心ELISA是在间接ELISA方法基础上发展起来的一种常用检测抗原的方法。原理是用两种抗体包裹待测抗原，最后通过酶标记抗体的显色反应读出具体的数据计算出最终浓度，由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，因此只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可包被固相载体和制备酶结合物建立此方法。双抗体夹心ELISA具有检测的抗原范围广；检测灵敏度高；检测特异性强；检测的稳定性好；可定量检测抗原等特点。它作为检测抗原的最常用的一种方法目前已被应用于多个领域，如病毒的检测，细菌的检测，寄生虫的检测等方面。8.5.2.4竞争性ELISA竞争法既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。其主要原理是用待检抗原或抗体去干扰已经预先设计好的体系，最终的显色结果与待检抗原或抗体的干扰程度呈负相关。14 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立竞争性ELISA灵活性很好，步骤简单，能快速的得到检测结果，主要用于小分子抗原的检测。在此基础上设计出了更复杂的实验方案，比如直接竞争抑制ELISA、间接竞争抑制ELISA、夹心竞争ELISA等特殊的ELISA方法。除上述介绍的几种基本的ELISA外，人们可以根据自己的实际需要来灵活设计其他类型的ELISA，例如斑点ELISA、ELISA-聚合酶链式反应等。目前中国宫颈癌中HPV流行的特点可概括为：（1）中国宫颈癌的发病率仍处于一个较高的水平，尤其是在经济较为落后的地区；（2）中国各地区宫颈癌中HPV感染及型别分布情况目前还没有一个全面的了解。国内不同地区之间HPV型别的分布情况可能存在较大差异；（3）对在中国流行的HPV16型以及其它HR-HPV型别的基因变异情况，缺乏调查和分析数据；（4）在疫苗还没有在中国大陆地区推广之前，筛查仍然是降低宫颈癌发病率的首要方法，但目前缺乏一种经济适用、适合大规模筛查的HPV检测方法。本研究的主要目的：（1）了解新疆北疆部分地区近年来HPV的流行情况以及宫颈病变样本中HPV基因型分布；（2）在分子水平上评估新疆北疆部分地区流行株L1基因全长的变异情况，从而为制备适合该地区的预防性疫苗提供基础；（3）以HPV16型为例，制备单克隆抗体，并初步建立适合新疆北疆部分地区的HPV双抗体夹心ELISA检测方法。15 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立第二章实验一新疆北疆部分地区HPV的流行状况摘要：为了研究新疆北疆部分地区HPV的流行状况，宫颈病变人群中HPV基因型的分布，以及多重感染情况。我们收集了2010年1月-2014年12月就诊于新疆石河子大学第一附属医院妇产科进行HC2检测的7298位病人的病例资料，并收集了2014年1月-2014年12月就诊病人的宫颈脱落细胞样本，挑选出宫颈病变样本并进行分子检测，结果显示：（1）新疆北疆地区人乳头病毒的发生率仍处于一个较高的水平，其中在年龄<25岁和≥55岁时出现感染高峰；（2）HR-HPV的检出率随着宫颈病变等级的增加而增加，LR-HPV随宫颈病变程度的变化，其检出率变化不大；（3）在新疆北疆部分地区至少存在29种HPV基因型，其中HR-HPV17种，LR-HPV12种，其中发生率较高的HR-HPV依次为HPV16、53、52、58、35；（4）在多重感染检测中，以HPV16型的合并感染最为常见，其次是HPV52。在多重感染中，以二重感染为主，还出现了三重、四重、五重、六重感染，并且多重感染与宫颈病变的严重程度无关。关键词：HPV；宫颈病变；基因型；年龄；多重感染[1]宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在世界范围内仅次于乳腺癌，位于第二位。[89]近年来我国宫颈癌的发生有明显上升趋势，发病率以每年2%-3%的速度增长。新疆地处我国西北地区，多民族聚集，由于其卫生条件相对较差，缺乏相应的健康知识，以及饮食及生活习惯各异等因素，因此宫颈癌的发生率处于一个较高的水平。有研究报道[90]，新疆局部地区宫颈癌的患病率为490-527/10万。流行病学调查显示，HPV是宫颈癌和癌前病变的主要致病因子。目前已分离出100多种HPV，其中约40多种与生殖道[11]疾病相关。其中HR-HPV至少19种(HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73和82)，LR-HPV至少12种（HPV6、11、40、[13,15]42、43、44、54、61、70、72、81、CP6108、CP8104和90等）。不同类型的HPV致病力存在较大的差异。而其中以HR-HPV的持续感染与CIN和宫颈癌的发生最为密[14]切。因此对HPV进行分型检测已经成为筛查和预防宫颈癌的关键问题之一，而分型检测明确宫颈病变中存在的主要HPV型别，对临床CIN的筛查，宫颈细胞学异常的评估，病程的进展，以及人群的流行病学的状态以及疫苗的研制都有重要的意义。本研究的主要目的：（1）通过对2010年1月-2014年12月病例资料的整理统计分析，探讨新疆北疆部分地区HPV的流行状况；（2）利用分子学检测对经阴道镜检查病理诊断确认为有宫颈病变病人的宫颈脱落细胞样本进行HPV的分型检测，得出该地区主要的HPV流行型别以及宫颈病变样本中HR-HPV的流行情况；（3）探讨HR-HPV多重感染与宫颈病变的关系，从而为新疆北疆部分地区HPV发生情况进行流行调查。16 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1材料与方法1.1材料1.1.1样本收集2010年1月-2014年12月，收集新疆北疆（石河子，沙湾，塔城，玛纳斯，克拉玛依）部分地区就诊于新疆石河子大学第一附属医院进行过HC2检测的7298位病人的病例资料，并收集2014年1月-2014年12月就诊病人的宫颈脱落细胞样本，年龄18-76岁，平均年龄41.57岁。病人采样期须在非月经期，采样前3天内禁止使用阴道栓剂，禁止性生活。并筛选出经阴道镜检查异常且病理检测结果证实有宫颈病变的样本598例，其中宫颈炎481例，CINI47例，CINII-III20例，宫颈癌50例。标本保存于-20℃冰箱，待检。17 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.1.2主要仪器表1-1主要仪器设备Table1-1Themainequipmentofthestudy仪器设备生产厂商Millipiore纯水装置美国Millipiore公司-80℃超低温冰箱日本SYNYO公司-20℃低温冰箱青岛海尔YXQ-SG46高压蒸汽灭菌器上海佳胜实验设备有限公司SW-CJ-2F超净工作台上海博讯实业有限公司医疗设备厂SHH.W21电热恒温水浴箱北京光明医疗仪器厂GNP-9080隔水式电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司水平摇床北京六一仪器厂XW-80A涡旋振荡器上海精科实验有限公司水平震荡仪上海卖尚科学仪器有限公司ImageLabVersion3.0凝胶成像仪美国Bio-Rad公司Labofuge4008高速冷冻离心机德国Heraeu公司T-GRADIENTPCR仪美国Bio-Rad生物工程公司DYY-6B型电泳仪北京六一仪器厂JA2003N电子分析天平上海精密科学仪器有限公司1000ul、200ul、20ul、10ul、2.5ul微量加样器、排Eppendorf公司产品枪22SWG标准接种环北京玻璃仪器厂电转仪Eppendorf公司产品核酸蛋白检测仪美国Thermo公司ZHWY-1102C双层小容量恒温摇床上海百典设备有限公司雪花制冰机北京长流微波炉顺德格兰仕电器厂有限公司DYCZ-24DN蛋白凝胶电泳仪上虞艾科仪器设备有限公司JY-ZY5电泳槽北京市君意东方电泳设备有限公司96孔酶标板上海生工生物科技公司MK3型酶标仪美国Thermo-Fisher公司18 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.1.3实验所需试剂表1-2主要实验试剂Table1-2Themainlaboratoryreagents实验试剂生产厂商TaqDNA聚合酶TaKaRadNTPTaKaRa10×LoadingBufferTaKaRaGoldviewI核酸染料北京莱宝科技有限公司琼脂糖西班牙生物工程公司产品氨苄青霉素北京索莱宝科技有限公司吐温-20天津市福晨化学试剂厂产品DNAMarker北京TIANGEN生化科技有限公司pGM-T克隆试剂盒北京TIANGEN生化科技有限公司DNA提取试剂盒北京TIANGEN生化科技有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒北京TIANGEN生化科技有限公司4×SDS-PAGEloadingbuffer北京TIANGEN生化科技有限公司增强型HRP-BAD底物显色试剂盒北京TIANGEN生化科技有限公司westernBlot膜封闭液北京TIANGEN生化科技有限公司蛋白预染Marker(10-170KD)北京经科宏达生物技术有限公司辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG北京博奥森公司脱脂奶粉内蒙古伊利实业集团股份有限公司HPV16L1全长蛋白(ab119880)上海艾博抗公司HPV16L1抗体（ab30908）上海艾博抗公司四甲基联苯胺（TMB）北京天根生化科技有限公司其它所用试剂均为进口或国产分析纯。PCR引物合成、测序均由上海生工生物科技公司完成。1.1.4实验所需部分试剂配制方法（1）LB液体培养基（2L）：胰蛋白胨20g，NaCl20g，酵母提取物10g，最后定容至2L，200mL每瓶分装于锥形瓶中，再每5mL每支分装于试管中，塞好相应规格的塞子，121℃高压灭菌15min后放置于室温保存。（2）氨苄霉素（A+）（10mL）：将1g氨苄霉素溶于10mL超纯水中，使其终浓度为100mg/mL，用0.22μm滤膜过滤，再以每管1mL分装于1.5mLEP中，置于-20℃保存。（3）氨苄霉素（A+）LB固体培养基（500mL）：称取蛋白胨5g，NaCl5g，酵母提取物2.5g，琼脂粉6g，溶解于400mL超纯水，待完全溶解后加水定容至500mL。高压灭菌后待温度降至50℃，加入氨苄霉素，使其终浓度为100μg/mL，倒入平板（12cm），19 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立于-4℃保存。（4）氨苄霉素（A+）LB液体培养基（500mL）：称取蛋白胨5g，NaCl5g，酵母提取物2.5g，溶解于400mL超纯水，待完全溶解后加水定容至500mL。高压灭菌后待温度降至50℃，加入氨苄霉素，使其终浓度为100μg/mL，分装于试管中，于-4℃保存。（4）50×TAE（1L）：Tris242g，冰醋酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(PH=8.0)100mL，搅拌至完全溶解，加入去离子水定容至1L。（5）1×TAE（1L）：20mL50×TAE加入980mL的纯水。1.2方法1.2.1宫颈样本DNA的提取使用TIANampGenomicDNAKit（天根生化科技有限公司），按照试剂盒说明术提取宫颈样本DNA，具体步骤如下：（1）取50-100μl上述宫颈样本置于1.5mL灭菌EP管中，每管加入200µLBufferGA，分别做好标记。（2）加入4μlRNaseA（100mg/mL），漩涡振荡15s，室温放置5min，用于去除宫颈样本中的RNA。（3）加入20µLProteinaseK，样品彻底混匀，放于56℃水浴中过夜，直至样本完全溶解。（4）加入200µLBufferGB，涡旋震荡混均，70℃放置10min，使溶液变清亮。（5）加入200µL无水乙醇，涡旋震荡混均，此时可能会出现絮状沉淀。（6）将上一步骤所得溶液和絮状沉淀都加入到收集管中的吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（7）向吸附柱CB3中加入500µLBufferGD，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（8）向吸附柱CB3中加入600µL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（9）重复上一操作步骤。再以12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（10）将吸附柱放于新的灭菌离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加100µL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min。收集各个宫颈样本的DNA，-20℃保存备用。1.2.2PCR引物设计以B-globin基因作为内参照，双蒸水（double-distilledwater,ddH2O）为阴性对照。[91,92]通用引物MY09/11、以及19种HR-HPV的型特异引物参考文献引物，委托上海生20 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立工生物科技公司合成，引物序列见表1-3。表1-3HPVL1基因片段扩增引物Table1-3PrimersofHPVL1sequences，，扩增片段引物名称引物序列（5-3）片段大小（bp）B-globinFCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTAC274B-globinRCCACCAACTTCATCCACGTTCACCL1MY09CGTCCMARRGGAWACTGATC450MY11GCMCAGGGWCATAAYAATGG16FTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAG21516RTGAGAACAGATGGGGCACACAAT18FGACCTTCTATGTCACGAGCAATTA23618RTGCACACCACGGACACACAAAG26FCGAAATTGACCTACGCTGCTACG23926RTGGCACACCAAGGACACGTCTTC31FAGCAATTACCCGACAGCTCAGAT21031RGTAGAACAGTTGGGGCACACGA33FACTGACCTAYACTGCTATGAGCAA22933RTGTGCACAGSTAGGGCACACAAT35FCAACTGACCTATACTGTTATGAGC23435RTGTGAACAGCCGGGGCACACTA39FTTGTATGTCACGAGCAATTAGGAG35739RGACACTGTGTCGCCTGTTTGTTTAE745FGACCTGTTGTGTTACGAGCAATTA23645RTGCACACCACGGACACACAAAG51FGCTACGAGCAATTTGACAGCTCAG24251RATCGCCGTTGCTAGTTGTTCGCA52FACTGACCTAYACTGCTATGAGCAA22952RCAGCCGGGGCACACAACTTGTAA53FACCTGCAATGCCATGAGCAATTGAA25353RTTATCGCCTTGTTGCGCAGAGG56FACCTACARTGCAATGAGCAATTGG24456RTGATGCGCAGAGTGGGCACGTTA58FGCTATGAGCAATTATGTGACAGCT21958RTGTGCACAGSTAGGGCACACAAT59FACCTTGTGTGCTACGAGCAATTAC24359RGCTGCACACAAAGGACACACAAA66FACCTACARTGCAATGAGCAATTGG24466RTGATGCGCAGAGTGGGCACGTTA21 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立扩增片段引物名称引物序列（5，-3，）片段大小（bp）68FTTGTATGTCACGAGCAATTAGGAG25868RGATTACTGGGTTTCCGTTGCACAC70FCACGAGCAATTAGAAGATTCAGACA237E770RTTCCCGATGCACACCAGGGACA73FCTTACATGTTACGAGTCATTGGAC22173RGTTTCTGGAACAGTTGGGGCAC82FGCTACGAGCAATTTGACAGCTCAG24082RCATTGCCGATGTTAGTTGGTCGCA注：M=A/C；R=A/G；W=A/T；Y=C/T1.2.3PCR反应体系所有引物在同一PCR反应体系下进行，见表1-4。表1-4PCR反应体系Table1-4PCRreactionsystem反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mmol)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNApolymerase0.6ddH2O16总体积251.2.4PCR反应条件通用引物PCR反应共进行37个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，见表1-5。表1-5PCR反应条件Table1-5ReactionconditionofPCR温度（℃）时间（s）9530094455445724572480B-globin引物、型特异性引物PCR反应共进行38个循环，产物经1.5%琼脂糖凝胶22 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立电泳分析，见表1-6。表1-6PCR反应条件Table1-6ReactionconditionofPCR温度（℃）时间（s）95300944563457245724801.2.5目的片段的回收按照上海天根生物科技有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行。操作如下：（1）柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500µL平衡液BL，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入3倍体积溶胶液PN。50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（4）将上一步所得溶液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（5）向吸附柱中加入600µL漂洗液（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。（6）向吸附柱中加入600µL漂洗液PW，12000rpm（13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液。（7）将吸附柱放回收集管中，12000rpm（13400×g）离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（8）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液，室温放置5min，12000rpm（13400×g）离心2min收集含有宫颈样本DNA的溶液。1.2.6DNA回收产物与T-载体的连接按照pGM-T连接试剂盒说明书进行，将DNA回收产物与克隆载体pGM-T连接，16℃，连接12-16h。连接体系见表1-7。23 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表1-7连接体系Table1-7SystermofTvectorligeration连接组分体积(μL)10×Ligationbuffer1.0pGM-T载体(50ng/ul)0.5回收目的PCR片段5.0T4DNALigase(3U/ul)1.0ddH2O2.5总体积10.01.2.7感受态细胞DH5α的制备1.2.7.1受体菌的培养从E.coliDH5α甘油保存管中取20μL菌液放入20mL液体LB培养基中（1:100），37℃，200rpm过夜培养至对数生长后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于100mL的液体LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养1.5～3h至OD为0.4～0.6。1.2.7.2感受态细胞的制备-CaCl2法（1）将培养液取出于50mL离心管中，冰上放置5-10min。（2）于4℃离心机，12000rpm（13400×g）离心5min，回收细胞。（3）弃上清，尽量倒尽最后残留的培养液。（4）加入10mL预冷的0.1mol／LCaCl2水溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min。（5）于4℃离心机，12000rpm（13400×g）离心5min，回收细胞。（6）重复步骤3。（7）加入4mL预冷的含有20%甘油的0.1mol／LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，即成感受态细胞悬液。（8）将制备好的感受态细胞分装成200µL的小份并放于1.5mLEP管中，贮存于-80℃。1.2.8转化E.coliDH5α感受态细胞（1）加5µL连接产物于100µL感受态细胞DH5α中（低温取出的感受态细胞要自然融化），冰浴30min。（2）42℃水浴中热击90s后，冰浴3-5min。（3）加入800-1000µL不含抗生素的液体LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养1h。r（4）8000rpm离心2min，弃上清，剩余80-100µL菌液，涂布于含Amp的LB琼脂平板，37℃倒置培养12-18h。r（5）挑取单个白色菌落，在含Amp的液体LB培养基内激活培养，37℃，200rpm，培养3-4h。取200µL，加入终浓度为50%的200µL无菌甘油，送上海生工生物科技公司进24 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立行测序。1.2.9数据分析将所有样本的HC2检测结果，按25岁及以下，25-29岁，30-34岁，35-39岁，40-44岁，45-49岁，50-54岁，55岁及以上共8个年龄段进行统计分析。测序结果经人工校正后获得各个HPV基因型的基因序列，将各个基因序列输入到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/中的nucleotideblast程序中进行序列比对分析。如果一个序列与某一HPV亚型参考序列的匹配性≥90％，该序列将被认为是这种亚型。利用Sequin软件工具向GenBank核酸数据库提交序列，序列登录号见附表1。2结果2.1HPV检出率本研究共收集了2010年1月-2014年12月份的共7298份就诊病人的病例资料，根据HC2检测结果，可以看出：（1）参加筛查的人群随着年份的递增而逐渐增加；（2）阳性率则在逐渐减少，从2010年的51.8%减少到了2014年的41.5%，但仍处于一个较高的水平。图1.2010-2014年新疆北疆地区HPV筛查情况Fig.1HPVscreeninginNorthernXinjiangin2010-201425 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.2宫颈脱落细胞样本中HPV感染率2014年共有2046位病人参加了HC2检测，其中有101位病人是进行复查。因此最后的检测人数为1945人。HC2检测阳性805例（41.4%）。从图2我们可以直观的发现，HPV的感染率呈双峰模式，其中两个峰值分别在<25岁和≥55岁两个年龄段，感染率在25岁时下降，直至54岁，在此年龄段HPV感染率波动不大。图2.2014年宫颈样本中HPV的检出率与年龄的关系Fig.2TheprevalenceofHPVaccordingtoageinaathecervicalsamples2.3PCR检测结果2014年的1945例样本中共筛选出598例宫颈病变样本，对598例宫颈病变样本的DNA进行PCR检测。2.3.1B-globinPCR检测结果使用B-globin引物对DNA样本进行扩增，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增的目的PCR产物的大小分别约为274bp（图3）图3.B-globin基因PCR检测结果M=600bp；1-9：宫颈病变样本PCR检测结果；10：阴性对照Fig.3DetectionofB-globingeneofPCRM:600molecularweightmarker;1-9:TheDNAsamplesofcervicallesionssamples;10:Negativecontrol26 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.3.2通用引物PCR检测使用MY09/11通用引物对DNA样本进行扩增，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，所扩增的目的PCR产物的大小约为450bp（图4）。图4.通用引物MY09/11PCR检测结果M=600bp；2-10：宫颈样本PCR检测结果；1：阴性对照Fig.4DetectionofconsensusprimerofPCRM:600molecularweightmarker;2-10:TheDNAsamplesofcervicallesionssamples;1:Negativecontrol2.3.3各级宫颈病变样本中HC2和PCR检测阳性样本的比例在598例宫颈病变样本中，HC2阳性样本占总样本数的39.2%，PCR检测阳性样本占总样本数的33.6%。在各级宫颈病变中，HC2筛查中HPV的阳性检出率随着宫颈病变等级的增加依次为37.4%，57.4%，60.6%和88%，在PCR检测中检出HPV感染的样本，随着宫颈病变等级的增加，检出率依次为27.9%，53.2%，50%，64%。通过两种检测方法发现，随着宫颈病变等级的增加，HPV的检出率逐渐增加。表1-8不同宫颈病变中HPV的检出率Table1-8TheprevalenceofHPVindifferentcervicallesions宫颈炎CINICINII-III宫颈癌（n，%）总数（n,%）（n,%）（n,%）（n,%）平均年龄(Yrs39.9±9.6938.1±9.846.8±6.951.6±10.540.7±10.3±SD)样本数481,80.347,1020,5.550,4.2598HC2阳性180,37.427,57.412,6044,88235,39.2PCR阳性134,27.925,53.210,5032,64201,33.627 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.4HR-HPV检测2.4.1高危型特异性PCR引物检测通用引物MY09/11PCR检测为阳性的宫颈病变样本的DNA进行19种HR-HPV的型特异性PCR检测，共检测出17种HR-HPV。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，各HPV型引物所扩增的目的PCR产物的大小见图5。图5.特异型引物PCR检测结果M=600bp；16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、58、59、66、68、73分别代表HPV基因型；NC=阴性对照Fig.5DetectionofspecificprimersofPCRM:600molecularweightmarker;16,18,26,31,33,35,39,45,51,52,58,59,66,68,73representtheHPVgenotype,respectively;NC=Negativecontrol28 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.4.2PCR检测的HPV各型的发生情况高危型特异性PCR引物检测为阳性以及通用引物检测阳性且HR-HPV型特异性引物为阴性的样本，均回收目的片段，并连接T-载体后，对阳性克隆的菌液进行测序。对测序成功的序列进行整理后，在NCBI基因库中用BLAST在线分析软件进行比对并统计分析后发现，共获得17种HR-HPV，分别是HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73；12种LR-HPV，分别是HPV6、11、34、42、43、54、55、61、62、81(CP8304)、84、89(CP6108)和90。其中感染率最高的HPV基因型为HPV16、53、52、58、35。图6.各HPV基因型的发生情况Fig.6TheprevalenceofdifferentHPVgenotypes2.4.3HR-HPV在各级宫颈病变的发生情况在201例PCR检测阳性的样本中，HR-HPV166例，占总样本数的27.8%（166/598），LR-HPV35例，占总样本数的5.8%（35/598）。其中HR-HPV的发生率随宫颈病变等级的增加而增加，而LR-HPV的发生率随着宫颈病变等级的增加而变化不大。HPV16在各级宫颈病变中的感染率均较高，而CINII-III中感染率最高的HPV基因型是HPV33和53型。在宫颈癌组中感染率最高的HPV基因型是HPV16、52、53和58，在CINI中感染率最高的HPV基因型是HPV16、53、52和58。在宫颈炎组中感染率最高的HPV基因型是HPV16、53、58和52。29 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表1-9不同宫颈病变中HPV基因型的分布及发生率Table1-9DistributionandoccurrencefrequencyofdifferentHPVgenotypesatdifferentlevelsoflesions宫颈炎CINICINII-II宫颈癌合计（n,%）（n,%）（n,%）(n,%)HRtypes107(22.2)19(40.4)9(45)31(62)166(27.8)LRtypes27(5.6)6(12.8)1(5)1(2)35(5.8)HR-HPV1645(27.1)10(6.0)1(0.6)17(10.2)73(44.0)185(3.0)002(1.2)7(4.2)261(0.6)003(1.8)4(2.4)317(4.2)2(1.2)1(0.6)010(6.0)3312(7.2)1(0.6)3(1.8)016(9.6)3518(10.8)2(1.2)1(0.6)8(4.8)29(17.5)399(5.4)1(0.6)04(2.4)14(8.4)453(1.8)1(0.6)1(0.6)05(3.0)515(3.0)001(0.6)6(3.6)5225(15.1)6(3.6)1(0.6)10(6.0)42(25.3)5328(16.9)8(4.8)2(1.2)10(6.0)48(28.9)5611(6.6)004(2.4)15(9.0)5826(15.7)3(1.8)08(4.8)37(22.3)594(2.4)1(0.6)1(0.6)06(3.6)668(4.8)002(1.2)10(6.0)683(1.8)002(1.2)5(3.0)731(0.6)0001(0.6)X5(3.0)4(2.4)5(3.0)2(1.2)16(9.0)注：CIN：宫颈上皮内瘤样病变，HPV：人乳头瘤病毒；X：未测序成功的HPV基因型；因为出现了多重感染因此总样本数超过166。CIN:Cervicalintraepithelialneoplasia,HPV:humanpapillomavirus;X:UndeterminedHPVgenotype;Totalsurpass166becausewomenwithmultipleinfectionsarecountedatleasttwice.2.5多重感染2.5.1HR-HPV各基因型多重感染情况166例PCR检测为阳性的样本中，其中有150例被成功测序，16例未测序成功。其中以HPV16型的多重感染最为常见，在二重、三重、四重、五重、六重感染中的比30 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立例分别为44.6%(25/56)、54.6%(18/33)、53.3%(8/15)、100%(2/2)和100%(2/2)。HPV52是第二个最常见的合并感染型别。HPV26和73的发生率是低的，分别出现在六重感染和四重感染中，且-9属的发生率大于-7属（图7）。图7.高危型HPV基因型的分布和多重感染Fig.7HR-HPVgenotypesdistributionandthemultipleinfections2.5.2宫颈病变与多重感染的关系在150例测序成功的宫颈样本中，多重感染108例（65.1%，108/166），单一感染42例(25.3%，42/166)。在宫颈炎、CINI、CINII-III、宫颈癌四组中，多重感染的比例分别为41.0%、7.2%、1.2%、15.7%，多重感染率随宫颈病变等级的增加没有呈现出一定的规律性。在108例多重感染的样本中，二重感染56例，三重感染33例，四重感染15例，五重感染2例，六重感染2例。31 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表1-10不同宫颈病变中多重感染的发生率Table1-10Theprevalenceofmultipleinfectionsindifferentcervicallesions宫颈炎（n,%）CINI（n,%）CINII-II（n,%）宫颈癌（n,%）合计单一感染26(15.7)7(4.2)3(1.8)6(3.6)42(25.3)多重感染68(41.0)12(7.2)2(1.2)26(15.7)108(65.1)二重感染35(21.1)8(4.8)1(0.6)12(7.2)56(33.7)三重感染21(12.7)3(1.8)1(0.6)8(4.8)33(19.9)四重感染10(6.0)1(0.6)04(2.4)15(9.0)五重感染2(1.2)0002(1.2)六重感染0002(1.2)2(1.2)2.5.3多重感染与年龄的关系从图8可以发现，HPV的感染率在≥55岁时最大，其次是在＜25岁。单一HPV型别的感染率在25-34岁之间感染率最大。多重HPV的感染率在≥55岁时最大。图8.宫颈病变样本中HPV的阳性率与多重感染率与年龄的关系Fig.8CorrelationbetweenmultipleHPVinfectionrateandHPVpositiveratewithageofthepatientsincervicallesions3讨论宫颈癌是少数几个能够借助筛查而降低死亡率的恶性肿瘤之一，从宫颈癌前病变发32 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立[93]展到宫颈癌是一个漫长过程，这大约需要10年时间。这是一个重要的、不可忽视的阶段，它为早期诊断和治疗提供了宝贵的时机。疫苗和筛查是防治宫颈癌的主要手段。[74]目前，主要应用于预防宫颈癌的疫苗有两种，分别是Gardasil疫苗和Cervarix疫苗。但是由于这两种疫苗的价格较高，疫苗临床试验中亚洲人样品比例小，疫苗的保护范围有限等原因，使这两种疫苗很难在宫颈癌发生率较高且经济较为落后的发展中国家使用。我国从2009年首次进行HPV疫苗临床试验后，至今未能批准HPV疫苗的上市，而这数年间可能导致了中国未来38万的宫颈癌的新发病例。因此，HPV的筛查以及宣传教育仍然是我国预防宫颈癌的主要手段。从对2010年1月-2014年12月就诊于石河子大学第一附属医院病人的病例资料进行统计分析发现：（1）目前，新疆北疆部分地区进行HPV筛查的人群在逐渐增加，说明越来越多的人已经认识到宫颈癌的危害以及进行HPV筛查的重要性；（2）在新疆北疆部分地区HPV的发生率仍然处于一个较高的水平。年龄是HPV感染的重要因素之一，在我们的研究中发现：年龄≤25岁及≥55岁时出现HPV的感染高峰。这与Lazcano等[94]报道：在普通人群中，HPV的检出率在年龄＜25岁（16.7%）和＞65岁的女性（23.10%）中最高的报道结果相似。这可能的原因是：（1）≤25岁初次性生活后不久，HPV感染达到高峰，而随着年龄的增长，由于获[53]得了自身的免疫力，其感染率开始下降；（2）年龄＞55岁的妇女随年龄增长体内原有的免疫力逐渐消失或卵巢功能减退而导致体内激素水平变化，使生殖道抵抗力下降而[54]呈现易感性。而不同的文献报道结果不同，这可能与女性初次性生活年龄、性伴侣数量、性生活的卫生状况有关。宫颈癌的发生和发展是一个缓慢、渐进的过程。它的发生、发展是由量变到质变、由渐变到突变，通常是由子宫颈不典型增生（CINI→CINII→CINIII）逐渐发展为癌症的连续发展过程。郎景和指出宫颈癌是一个可以预防和治愈的疾病，这是因为：①其发病原因主要是HPV感染；②认真地普查和随诊，积极处理癌前病变，可以阻断病程，预防宫颈癌，特别是宫颈浸润癌的发生；③早期诊断可以达到治愈。随着分子流行病学的发展，HPV与宫颈病变的关系越来越明确。研究表明子宫颈癌发病的生物学危险因素主[38]要集中在HPV感染上，99.8%的宫颈癌患者中均可以发现HPV的感染。本文分别通过HC2和PCR检测对存在宫颈病变病人样本中HPV的感染状况进行了分析，结果发现随着宫颈病变等级的增加，HC2-HPVDNA阳性率依次为37.4%，57.4%，60.6%和88%，在宫颈炎、CINI、CINII-III、宫颈癌中PCR-HPVDNA的阳性率分别为33.6%、45.2%、47.4%和63.3%。两种检测方法均表明HPV的感染率随宫颈病变等级的增加而逐渐增加。这说明HPV的感染与CIN的发生发展密切相关。所以，对宫颈癌以及癌前病变进行筛查并预防具有重要意义。不同地区流行的HPV基因型是不同的。通过对本研究不同宫颈病变病人的宫颈脱落细胞样本进行HPV检测分型发现，该地区共发现了29种HPV基因型，其中HR-HPV17种（HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73；33 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立LR-HPV12种（HPV6、11、34、42、43、54、55、61、62、81(CP8304)、84、89(CP6108)和90）。其中感染率较高的HPV基因型依次为HPV16、53、52、58、35。在宫颈炎症组中以HPV16、53、58、52的感染最为常见；在CINI中以HPV16、53、52、58为主；而在CINII-III中，以HPV33、53为主；在宫颈癌中HPV16、52、53、58的感染率最高。另外，HPV16、53、52、58在本研究中的发生率最高，分别为：HPV16(44.0%,73/166)，53(28.9%,48/166),52(25.3%,42/166),58(22.3%,37/166)和35(17.5%,29/166)。而不同地区HPV的人群感染率不同，所携带的型别不同，与宫颈病变相关的型别也不尽相同。很多学者对世界范围内的HPV感染的地区差异进行了大量的研究，世界癌症研究中心[95]的Clifford等应用Meta分析对8308例低度鳞状上皮内瘤变患者(来自55篇已发表的论文)中的HPV感染的研究发现,最主要的是HPV16,其次依次为HPV31，HPV51，HPV[96]53。Lee等对南韩地区的患者进行HPV分型的结果为：HPV16最常见，其余依次为HPV58，HPV18，HPV52。本研究结果与上述结果基本一致，在对中国多个地区的感染率的研究中发现HPV58和52均具有较高的感染率，如中国的南部（广州和香港），[30,97]而HPV53是我国的常见亚型，因此在开发适合该地区HPV多价疫苗的时候，也可以将HPV53，52，58考虑在内，这将会有效的预防该地区宫颈癌的发生率。HPV18在本研究中所占的比例较少，可能是因为HPV18常见于宫颈癌患者中，而本研究样本中宫颈癌患者的数量较少，也可能是由于不同地区之间存在着差异。在本研究中[98]CINII-III病变组，HPV感染率最高的为HPV33，孙波等在研究HR-HPV33型与宫颈病变的关系时发现HPV33是引起宫颈恶性病变的致病基因型，所以HPV33也应该引起我们的重视,但本研究出现上述结果也可能是由于本研究样本数目较少所致。由于HR-HPV的持续感染与CIN和宫颈癌的发生最为密切，因此本研究只对HR-HPV进行了分型检测，并且对通用引物阳性而特异性引物检测为阴性的样本进行了测序分析，这可能是导致本研究中LR-HPV检出率较低的原因。多重感染是指合并感染了两种或两种以上的HPV基因型。由于HPV各型之间没有相互免疫，因此当患者已经感染了一种HPV亚型时，会很容易获得另外亚型HPV的感染而造成不同亚型HPV的多重感染。但是多重HPV感染能否增加宫颈疾病的癌变，一[99]直是研究的热点。有研究认为多重感染与宫颈病变的严重程度相关。Lee等用HPVDNA芯片技术研究宫颈癌中HPV的多重感染，该作者通过多因素分析发现HPV多重[25]感染使个体患宫颈癌的风险比单一HPV感染的高；Munoz等2003年总结了1985-1997年9个国家的11项病例对照研究认为，HPV多重感染与单一感染在发生宫颈癌的风险[100]方面没有显著差异以及Kay等对南非宫颈癌和CINII-III的患者进行研究认为，多重感染与宫颈癌的级别无关，多重感染并不增加宫颈癌的发生率。在本研究中HPV感染主要为多重感染为主，166例阳性样本中，108例（65.1%）为多重感染，42例（25.3%）为单一感染。在HPV的多重感染类型中，以HPV16型的合并感染最为常见，其次是HPV52，在多重感染的类型中，以二重感染最为常见。在各级病变中，多重感染率依次为宫颈炎组（41%），宫颈癌（15.7%）、CINI（7.2%）、CINII-III（1.2%）。多重感染在34 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立各组病变的发生率并没有呈现出一定的规律性，这可能说明多重感染与宫颈病变的级别无关。HPV的多重感染是否会增加和促进宫颈病变的发生发展目前却无统一的说法，但多重HPV感染在疾病进程中依旧是一个重要的因素，这提示我们在宫颈疾病的筛查中，应高度注视多重HPV感染的情况，为筛查随访及治疗提供相应的依据，也为我们在多价宫颈疫苗的研究方面提供帮助。很多研究者发现年轻的女性更容易导致多重HPV感染。本研究结果发现，在年龄<25岁时HPV多重感染率较高，在年龄≥55岁是HR-HPV的多重感染率也较高。这可能[54,56]是由于<25岁机体的免疫功能不完善，产生抗体的能力有限，也可能与性活动有关。而在25-55岁性活跃期感染率较低，可能是此年龄段的大部分人群都获得了自身的免疫力，感染可能处于被抑制状态或者被清除。年龄≥55岁时HR-HPV的感染率和多重感染率均较高，可能是因为该年龄段的妇女大部分处于绝经期，卵巢功能减退激素水平变化致生殖道抵抗力下降呈现易感性还有可能是由于随年龄增长体内原有的免疫力逐渐[55,101]消失以及HPV的多重感染。但我们发现各年龄段HPV的感染率均较高，提示我们对宫颈病变人群不管年龄大小都应该进行定期的宫颈病变筛查，尤其应该把筛查重点放在<25和≥55岁年龄段的人群。35 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立实验二HPV流行基因型L1基因的克隆与分析摘要：对新疆北疆地区流行的HR-HPVL1基因进行了特异性引物的设计，经扩增、测序、比对、拼接后获得了HPV16、52、53、58以及在世界范围内发生率较高且致癌性较强的HPV18型的L1基因序列全长，与现有的疫苗株/美国株序列进行比对后发现均发生了序列的改变，有些改变甚至还导致了氨基酸的改变。以HPV16型为例，对新疆株与疫苗株进行分子生物信息学分析，发现两者之间均存在差异。这为新疆北疆地区疫苗的引进以及多价疫苗的研发提供理论依据。同时本章还参照以往报道，筛选出保守性较好的多肽片段，为下一章节单克隆抗体的制备奠定基础。关键词：HPV流行基因型；L1基因序列；多肽[1]宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌，占恶性肿瘤的第二位。由HPV感染引起的感染性疾病由于较易复发，不易根治，且具有潜在致癌性，而逐渐引起了人们的重视。因此研制有效的HPV疫苗，预防HPV感染和进行免疫治疗已经成为国内学者研究的热点。HPV有两个衣壳蛋白：主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPVL1编码的L1蛋白是一种糖蛋白，其结构相对稳定，在侵入宿主体内后，作为主要的特异性抗原，能够引起机体的免疫反应。且L1具有自行组装成VLPs的特性，在这种病毒样颗粒上存在着中和表位，可以引起宿主产生细胞免疫。此外，还可诱导产生中和抗[72,73]体，用来制备HPV疫苗。预防性疫苗的主要成分是L1，但不同地区的HPVL1基因序列多态性决定了其编码的L1蛋白的多肽性，因此不同地区的不同型别HPV感染需[102]要针对性的疫苗来预防。[14]研究已经表明HR-HPV持续感染是宫颈癌及癌前病变发生的主要原因。而其中以HPV16是高危型中最常见的型别，上一章节的研究已经表明，我国新疆北疆部分地区宫颈病变患者中HPV16型所占的比例为44%，是感染率最高的HPV基因型。有研究表明在50%-60%的宫颈癌病例中均可以发现HPV16的存在。并且HPV16型的致癌性最强，主要引起人类的鳞状细胞癌。在目前已将上市的两种HPV预防性疫苗（Cervarix和Gardasil）均可以对HPV16型的感染起到预防作用，但是新疆北疆部分地区流行的HPV16基因型在分子水平上与疫苗株相比是否会存在差异，目前是不清楚的。由于目前存在的HPV基因型型别较多以及不能在体外进行增值培养等原因，使在HPV相关疾病的诊断以及疫苗的研究等方面还存在很多问题，目前合成肽的研究为这些问题提供了新的研究思路。有研究表明，通过VLPs或HPV蛋白肽段能够检测到潜在[103]的HPV感染引起的免疫应答反应。例如肽段391IHSMNSTIL399可以区别HR-HPV[104]和LR-HPV感染以及被诊断出患有低度鳞状上皮内损伤（LSIL）的妇女。Urquiza等报道位于HPV16L1氨基酸序列中的保守肽段18283（55PNNNKILVPKVSGLQYRVFR74）和18294（275LYIKGSGSTANLASSNYFPT294）36 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立对识别宫颈癌和癌前病变患者具有较高的敏感性和特异性。因此本研究主要分为两部分：（1）对新疆北疆流行的HR-HPV基因型别进行扩增、测序，并在氨基酸水平上比较该地区流行的HPV基因性型别与目前已有的疫苗株/美国株相比较是否存在变异，从而为制备和引进适合该地区特异性疫苗提供依据；（2）以HPV16型为研究对象，通过分子生物信息学分析，比较新疆株与疫苗株之间存在的差异。并参照Urquiza等的报道，比较新疆株HPV16L1基因相应的氨基酸序列在18283和18294两个肽段是否保守，为下一章节单克隆抗体的制备提供基础。1材料与方法1.1材料1.1.1主要实验仪器与与主要实验试剂实验所需主要仪器及试剂见实验一1.1.2和1.1.3，部分试剂的配置方法见实验一1.1.4。1.2方法1.2.1PCR引物设计[104,105,106]参考文献引物，以及参照GenBank序列（NC001593），利用Prime5.0软件设计HPV53L1引物（表2-1），引物由上海生工生物科技公司合成。表2-1用于扩增主要衣壳蛋白L1的PCR引物Table2-1PCRprimersusedfortheidentificationoftheL1majorcapsidproteingene基因引物序列(5’-3’)参考文献HPV16-1FATAGTTCCAGGGTCTCCAHPV16-1RAGTCCATAGCACCAAAGCHPV16[105]HPV16-2FGAACACTGGGGCAAAGGATCHPV16-2RTACAATGAATAACCACAACAHPV18-1FGTAACGGTCCCTTTAACCTCCTCHPV18-1RCATTGTCCCTAACGTCCTCAGHPV18-2FAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATHPV18[106]HPV18-2RAGAGCCACTTGGAGAGGGAGAATACHPV18-3FGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCHPV18-3RATTACTTCCTGGCACGTACACGCACHPV52-1FCCATTACCTTCGTTACCCACAHPV52[107]HPV52-1RAGGATGCCCACTAATACCC37 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立基因引物序列(5’-3’)参考文献HPV52-2FGCTTGGAAATCGGTAGGGHPV52-2RGCAGTATTGCCAGAGTTAGACCHPV52-3FAGGGTCTAACTCTGGCAATACHPV52-3RCCTGTAGCCCTGCCTGTAHPV52-4FATGAAAATTTTAAGGAATACCHPV52-4RACATACATAACATGCAAACAACHPV53-FGGGACATCCTTATTACCCCATTTHPV53HPV53-RAGTAGAAGCAGAGCGTTTTTTAGHPV58-1FGTGTCATTGGAACCTGGTCCAHPV58-1RGCCAAGTTTTCCAGCCCTATTHPV58[104]HPV58-2FGCCAGTGAACCTTATGGGGATHPV58-2RTTTGCGTTTGGTGGATGGT1.2.1PCR扩增体系所有引物在同一PCR反应体系下进行，见表2-2。表2-2PCR反应体系Table2-2PCRreactionsystem反应组分体积（μL）10×PCRbuffer2.4dNTP(10mmol)2senseprimer(20μM)1antisenceprimer(20μM)1模板DNA(约50ng)2TaqDNApolymerase0.6ddH2O16总体积25μL1.2.2PCR反应条件（1）HPV16、58L1基因的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸7min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。（2）HPV18L1基因的PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，38 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立共35个循环；最后72℃延伸8min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。（3）HPV52L1基因的PCR扩增反应条件为：93℃预变性5min，93℃变性1min，（L1-1）55℃退火45s，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。L1-2、L1-3、L1-4的反应条件与L1-1只有退火温度不一样，分别为L1-2（52℃）、L1-3（57℃）、L1-4（57℃），其余步骤与L1-1完全一致。（4）HPV53L1基因的PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，共38个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收。1.2.3各HPV基因型L1片段序列的测定将目的片段进行切胶回收后，将回收片段与pMD18-T载体连接，转化E.coliDH5αr感受态细胞中，在AmpLB平板培养基上37℃下过夜培养，挑取单菌落扩增培养，培养的菌液送至上海生工生物科技公司进行测序。测序结果经人工校正后获得各个HPV基因型的L1基因序列，将各个基因序列输入到http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/中的nucleotideblast程序中进行序列比对分析。DNAMAN软件对各基因序列进行拼接、校对。利用Sequin软件工具向GenBank核酸数据库提交整理好的序列，序列登录号见附表1。本研究所涉及到的胶回收、载体连接以及转化均参考实验一。利用DANMAN软件推导各HPV基因型L1基因编码的氨基酸序列，并和国际参考株以及疫苗株进行序列比对分析。HPV16L1基因型编码的蛋白的二级结构、B细胞抗原表位以及三级结构分别用在线分析软件PredictSecondaryStructure(PSIPREDv3.0)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/);BepiPred1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/);GalaxyTBM(http://galaxy.seoklab.org/)进行分析。2结果2.1HPV16、58L1基因的扩增分别采用HPV16、58L1基因的2对特异性引物对HPV16、58L1基因全长进行分段PCR扩增，得到产物16（I）、16（II）和58（I）、58（II）片段，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR扩增产物大小分别为734bp、1236bp和985bp、771bp。39 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图2-1HPV16，58L1基因的PCR扩增M=2000bp；PCR扩增产物：16(I)=734bp，16(II)=1236bp；58(I)=985bp，58(II)=771bp；NC=阴性对照Fig.2-1PCRamplificationofHPV16,58L1genesequencesM:2000molecularweightmarker;AmplificationproductofPCR:16(I)=734bp,16(II)=1236bp;58(I)=985bp,58(II)=771bp;NC=Negativecontrol2.2HPV18、52L1基因的扩增分别采用HPV18型L1基因的3对引物和HPV52型L1基因的4对引物对HPV18、52的L1基因进行分段PCR扩增，得到产物18（I）、18（II）和18（III）以及52（I）、52（II）、52（III）和52（IV）片段，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物大小分别为650bp、505bp、636bp和526bp、547bp、596bp、560bp。40 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图2-2HPV18、52L1基因的PCR扩增M=1200bp；PCR扩增产物：18(I)=650bp，18(II)=505bp，18(III)=636bp；52(I)=526bp，52(II)=547bp，52(III)=596bp，52(IV)=560bp；NC=阴性对照Fig.2-2PCRamplificationofHPV18、52L1genesequencesM:1200molecularweightmarker;AmplificationproductofPCR:18(I)=650bp,18(II)=505bp,18(III)=636bp;52(I)=526bp，52(II)=547bp,52(III)=596bp,52(IV)=560bp;NC=Negativecontrol2.3HPV53L1基因的扩增采用Primer5.0设计的引物对HPV53L1基因进行PCR扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物大小约为1515bp，见图2-3。图2-3HPV53L1基因的PCR扩增M=2000bp；PCR扩增产物：HPV53=1515bp；NC=阴性对照Fig.2-3PCRamplificationofHPV53L1genesequencesM:2000molecularweightmarker;AmplificationproductofPCR:HPV53=1515bp;NC=Negativecontrol.2.4HPVL1的生物信息分析2.4.1HPV流行基因型（HPV16、18、52、53、58）L1基因编码的氨基酸水平的分析将回收得到的目的片段与T载体连接，PCR检测阳性克隆，同时将菌液送往测序公41 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立司进行测序，测序结果经拼接之后，在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/中用nucleotideblast在线比对确定基因型，并用DANMAN软件和疫苗株/国际参考株（HQ537740、EF546482、HQ537762）进行比对，发现本研究中获得的流行HPVL1基因编码的氨基酸序列与疫苗株/国际参考株之间均存在着差异，尤其是HPV58和美国参考株（HQ537762）之间存在的差异较大，见表2-3。表2-3HPVL1的氨基酸改变Table2-3AminoacidchangebasedonHPVL1whenbeingcomparedwiththereferenceaminoacidHPV基因型序列登录号参考序列登录号(地区)突变位点(氨基酸)228(D-H)292(A-T)KU721786HPV16（疫苗株）*449(S-.)*466(.-D)228(D-H)292(A-T)HPV16KU721787HPV16（疫苗株）*449(S-.)466(.-D)228(D-H)292(A-T)KU721788HPV16（疫苗株）*449(S-.)*466(.-D)25(R-Q)64(L-M)91(P-R)HPV18（疫苗株）KU721789149(T-N)344(P-R)399(P-R)535(G-R)25(R-Q)HPV1891(P-R)KU721790HPV18（疫苗株）344(P-R)399(P-R)539(K-T)25(R-Q)91(P-R)KU721791HPV18（疫苗株）344(P-R)399(P-R)KU721792HQ537740(美国株)386(N-K)HPV52KU721793HQ537740(美国株)386(N-K)42 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立HPV基因型序列登录号参考序列登录号(地区)突变位点(氨基酸)KU721799EF546482(美国株)58(T-A)145(I-V)KU721800EF546482(美国株)262(S-A)HPV5358(T-A)KU721801EF546482(美国株)145(I-V)262(S-A)10(V-A)150(L-F)159(G-S)163(T-P)292(T-K)KU721777HQ537762(美国株)296(P-A)299(N-D)311(G-V)325(I-M)378(D-G)383(N-D)5(L-F)10(V-A)HPV58144(I-V)150(L-F)159(G-S)163(T-P)292(T-K)296(P-A)KU721778HQ537762(美国株)299(N-D)311(G-V)325(I-M)378(D-G)383(N-D)410(V-I)420(N-D)422(D-N)43 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立HPV基因型序列登录号参考序列登录号(地区)突变位点(氨基酸)10(V-A)144(I-V)159(G-S)163(T-P)259(D-G)292(T-K)296(P-A)KU721779HQ537762(美国株)299(N-D)311(G-V)376(K-T)378(D-G)383(N-D)410(V-I)420(N-D)422(D-N)注：KU721777-KU721779，KU721786-KU721793，KU721799-KU721801为本研究获得的序列得序列的登录号，HPV16*（疫苗株）、HPV18（疫苗株）L1的氨基酸序列见附表1。：表示此位点碱基缺失。2.4.2HPV16L1基因编码的氨基酸序列以及蛋白质结构分析预测及表位预测在核酸水平比较时，本研究获得的三株HPVL1基因序列（KU721786、KU721787、KU721787）与疫苗株之间均存在差异，但在其编码的氨基酸的水平上比较时，三株与疫苗株之间存在的氨基酸差异以及位点是一样的，因此我们以KU721786为例，比较蛋白结构与表位之间存在的差异。HPV16L1基因编码的氨基酸序列与疫苗株的氨基酸序列之间的比对结果见附件2，其中变异位点均用红色标出。蛋白二级结构预测结果见附件3。结果显示新疆分离株HPV16（KU721786）与疫苗株的L1基因的蛋白二级结构存在一些共性，即都以无规则卷曲（coil）为主，其次是β折叠（strand），α螺旋（helix）最少；但是它们之间也存在一些差异，其中新疆分离株（KU721786）的α螺旋为6个，多于疫苗株，而疫苗株的β折叠比新疆分离株（KU721786）要多，为20个。这表明新疆分离株与疫苗株L1基因在蛋白的二级结构上存在不同。其中不同部分用（）表示，见附表3。用BepiPred1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)在线软件预测蛋白B细胞抗原表位，结果见表2-4。预测结果显示：新疆分离株（KU721786）的蛋白抗原表位数量与分离株是相等的，存在24个抗原表位，但新疆分离株（KU721786）与疫苗株之间在蛋白抗原表位的序列上存在不同，不同的抗原表位序列已在表2-4中用红色字体表示。44 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表2-4KU721786株与疫苗株蛋白表位预测Table2-4TheproteinepitopepredictionbetweenKU721786strainandvaccinestrain编号起始/终止位点蛋白抗原表位肽链长度36/49（KU721786）TVYLPPVPVSKVVS14136/49（疫苗株）TVYLPPVPVSKVVS1452/54（KU721786）EYV3252/54（疫苗株）EYV376/84（KU721786）FPIKKPNNN9376/84（疫苗株）FPIKKPNNN9104/121（KU721786）PDPNKFGFPDTSFYNPDT184104/121（疫苗株）PDPNKFGFPDTSFYNPDT18133/142（KU721786）VGRGQPLGVG105133/142（疫苗株）VGRGQPLGVG10153/168（KU721786）DDTENASAYAANAGVD166153/168（疫苗株）DDTENASAYAANAGVD16189/213（KU721786）PPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPP257189/213（疫苗株）PPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPP25224/229（KU721786）GDMVDT68226/227（疫苗株）MV2241/246（KU721786）ANKSEV69241/246（疫苗株）ANKSEV6266/269（KU721786）EPYG410266/269（疫苗株）EPYG4292/300（KU721786）AVGENVPDD911291/300（疫苗株）GTVGENNPDD10302/313（KU721786）YIKGSGSTANLA1212302/313（疫苗株）YIKGSGSTANLA12315/327（KU721786）SNYFPTPSGSMVT1313315/327（疫苗株）SNYFPTPSGSMVT13331/332（KU721786）QI214331/332（疫苗株）QI2342/346（KU721786）AQGHN515342/346（疫苗株）AQGHN5362/365（KU721786）TTRS416362/365（疫苗株）TTRS4375/384（KU721786）STSETTYKNT1017375/384（疫苗株）STSETTYKNT10395（KU721786）E118362（疫苗株）E1430/441（KU721786）FGLQPPPGGTLE1219430/441（疫苗株）FGLQPPPGGTLE12455/468（KU721786）QKHTPPAPKEDPLK1420454/468（疫苗株）QKHTPPAPKEDDPLK1545 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立编号起始/终止位点蛋白抗原表位肽链长度482/483（KU721786）SA221482/483（疫苗株）SA2501/503（KU721786）KAK322501/503（疫苗株）KAK3505/507（KU721786）KFT323505/507（疫苗株）KFT3510/527（KU721786）KPKATPTTSSTSTTAKRK1824510/527（疫苗株）KPKATPTTSSTSTTAKRK18用GalaxyTBM(http://galaxy.seoklab.org/)预测新疆分离株（KU721786）和疫苗株的蛋白三级结构信息见图，发现新建株和疫苗株的L1基因在相应蛋白的三级结构上存在不同。图2-4KU721786和疫苗株的蛋白质三级结构预测（左）：疫苗株；（右）：KU721786Fig.2-4ProteintertiarystructurepredictionoftheKU721786andvaccinestrains(Left):vaccinestrain;(Right):KU7217863讨论HPV是一种重要的致瘤性DNA病毒，可引起人生殖道、肛门皮肤和粘膜产生肿瘤。HPV在宫颈癌的发生发展过程中起着重要的作用。目前，临床上尚无有效的预防HPV感染的措施，中晚期宫颈癌的化疗和手术治疗效果也不理想。因此研制高效、安全、廉46 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立价的疫苗对于HPV感染的预防有着十分重要的意义。目前随着分子生物学的发展和基因工程技术的成熟，关于HPV疫苗的研究得到了快速发展。HPVL1基因编码病毒的主要衣壳蛋白能够诱导产生病毒中和抗体，且L1基因表达后能够自发组装成与天然病毒颗粒相似的VLPs，这是HPV预防性疫苗的主要抗原。目前世界范围内已经研发并被批准上市的预防性HPV疫苗有英国葛兰素公司生产的预防HPV16、18型的双价疫苗“Cervarix”和美国默克公司生产的可以预防HPV6、11、16、18型的四价疫苗“Gardasil”，以及正在进行III期临床试验由默克公司生产的可以预防九种HPV（HPV6、11、16、[74,78]18、31、33、45、52、58）的九价预防性疫苗。但这些疫苗只能预防疫苗范围内的HPV基因型，对其他的HPV基因型是没有预防效果的，并且不同地区HPV基因型的流行及变异情况是不同的。本研究对新疆北疆部分地区流行的HR-HPV（16、53、52、58）以及在世界范围内发生率较高且致癌率较强的HR-HPV18型的主要衣壳蛋白L1基因序列全长进行了扩增，发现该地区宫颈病变样本中HPVL1的基因序列存在着变异，有的变异甚至导致了氨基酸的改变。本研究通过对该地区流行的HR-HPV基因型在氨基酸水平上进行了变异分析，为引进并研发适合该地区的疫苗提供前期基础。以HPV16型为例，我们分析了HPVL1编码的氨基酸的遗传变异性，同时通过生物信息学分析，发现新疆株与疫苗株在HPVL1相应蛋白的二级结构、三级结构和抗原表位之间存在差异。主要表现在新疆株α螺旋数量明显比疫苗株要多，而β折叠数量却少于疫苗株；HPVL1相应蛋白的二级结构会直接影响空间构象及结构，从而影响其蛋白的功能；蛋白功能的改变可能会导致HPV病毒的免疫原性和抗原性。这可能会影响该地区宫颈疾病的发病与治疗，如果使用现有的两种疫苗，可能会达不到或影响疫苗的功效。抗原表位（Epitope）又称抗原决定簇（Antigenicdeterminant），是免疫细胞表面受体识别或抗体分子结合的一个特定部位。同一蛋白分子内有众多抗原表位，各表位对抗原性的贡献是不同的。此外，抗原表位的数量及序列、相对位置及稳定性、构象特征等也与表位功能密切相关。本研究中发现新疆分离株HPVL1相应蛋白的抗原表位与疫苗株相比，数量是相等的，高达24个，但是在大小、相对位置以及表位序列之间存在差异。而这种遗传变异可能会导致病毒侵染宿主细胞的易感性以及逃避宿主免疫防御机制的功能，从而导致不同程度的临床宫颈病变。[108]从1982年Bittle等利用合成肽作为免疫原诱导宿主产生中和抗体和保护性抗体，并成功利用合成的多肽与单克隆抗体中和反应的方法确定口蹄疫病毒的B细胞表位以来。人们逐渐认识到利用合成肽来进行疫苗的研究以及疾病检测的重要性。1993年[109]Tosi等人基于HPV16型E6蛋白合成的多肽所诱导的抗体诊断生殖器HPV感染的[110]损伤；1995年，Dreyfus等又利用HPV16E2ORF的合成多肽检测HPV感染病人血[104]清和阴道分泌物中的IgG和IgA抗体。Urquiza等报道位于HPV16L1氨基酸序列中的18283（55PNNNKILVPKVSGLQYRVFR74）和18294（275LYIKGSGSTANLASSNYFPT294）对识别宫颈癌和癌前病变患者具有较高的敏感性和特异性。本研究通过比对HPV16L1在对应氨基酸和蛋白二级结构水平上，比较了47 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立新疆株和疫苗株的L1基因对应的氨基酸序列在两个肽段之间是否存在差异时发现，两肽段保守性均较好，我们选取18283肽段作为保守肽段，为下一章节单克隆抗体的制备提供基础。48 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立实验三HPV16型单克隆抗体的检测以及双抗体夹心ELISA检测方法的建立摘要：本研究利用上一章（实验二）筛选得到的两个保守片段中的一个（18283）肽段进行多肽的合成以及KLH偶联后，免疫小鼠，获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用Westernblot检测后，发现有两株特异性良好，对得到的两株阳性克隆进行纯化之后，以一株辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）标记后的单抗作为检测抗体，另一株单抗作为捕获抗体，以此为基础建立检测HPV的双抗体夹心ELISA。通过对抗体稀释液等条件进行优化，确定捕获抗体的最佳浓度为16.9μg/mL，检测抗体的工作效价为1:100，样品反应时间为45min；酶标抗体作用时间为40min；显色时间为15min；该方法特异性及重复性较好，并用建立的双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR方法同时检测66份临床宫颈脱落细胞样本，符合率为81.8%。该方法可初步应用于临床宫颈脱落细胞样本中HPV的检测。关键词：双抗体夹心ELISA；捕获抗体；检测抗体；特异性宫颈癌是世界范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来在全球的发病率逐渐增[1]高，并呈年轻化的趋势发展，这严重危害了妇女的健康。国内外研究表明，宫颈癌是[66]唯一一种经过有效的干预后，能够使发病率和死亡率下降的恶性肿瘤。目前存在的宫颈癌检测方法都在降低宫颈癌和癌前病变的过程中发挥了重要的作用，但基本上都会存在一些弊端。酶联免疫分析技术是将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性[88]和专一性结合起来的一种免疫检测技术。其发展由早期的直接法、竞争法、以及竞争法发展到现在的双夹心法。双抗体夹心ELISA是一种主要检测大分子抗原抗原的酶联免疫技术，由于其具有灵敏度高、稳定性好、操作简单等特点而被广泛应用于临床检测。在实验二筛选出多肽保守片段的基础上，本研究主要分为两部分：i）对18283（55PNNNKILVPKVSGLQYRVFR74）多肽片段进行多肽的合成并进行KLH偶联后，免疫小鼠，用Westernblot对获得的含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的细胞上清进行筛选；ii）对筛选得到阳性克隆株进行纯化以及辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）标记。在此基础上拟建立检测HPV的双抗体夹心ELISA方法,并对包被抗体和捕获抗体浓度以及反应条件进行优化，为检测病人宫颈脱落细胞中HPV的感染打下基础。49 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1材料及方法1.1材料1.1.1主要实验仪器与主要实验试剂见实验一1.1.2和1.1.3。1.1.2主要溶液的配置（1）30%丙烯酰胺丙烯酰胺（Acrylamide）：145.0g亚甲基双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）：5.0g溶于300mL的ddH2O中，充分搅拌，使其溶解，然后用ddH2O定容至500mL，用0.45µm的滤膜过滤，可防止或推迟沉淀的形成，置于棕色瓶中4℃保存备用。（2）10%SDS（十二烷基硫酸钠）SDS：10gddH2O：100mL50℃水浴下溶解，室温保存，若长期保存过程中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。（3）Tris-HCl（PH8.8）Tris：90.85g溶于400mL的ddH2O中，充分搅拌，使其溶解，用浓HCl将PH调至8.8，最后用ddH2O定容至500mL，4℃保存备用。（4）10%APS（过硫酸铵）APS：10gddH2O：100mL磁力搅拌器搅拌，使其充分溶解，0.22µm的滤膜过滤，1.5mLEP管分装后，-20℃保存备用。（5）1.5mol/LTris(PH8.8)Tris：60.55gddH2O：500mL溶解后，用浓HCl将PH调至8.8，最后用ddH2O定容至500mL，4℃保存备用。（6）1mol/LTris（PH6.8）Tris：60.55gddH2O：500mL溶解后，用浓HCl将PH调至6.8，最后用ddH2O定容至500mL，4℃保存备用。（7）TBST1MTris-Hcl(PH8.0)：20mL50 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立NaCl：8.8gTween-20：0.5mLddH2O：800mL溶解后，用ddH2O定容至1000mL，4℃保存备用。（8）普通5×电泳缓冲液Trisbase：15.1gGlycine：94.0gSDS：5.0g溶于800mLddH2O中，充分搅拌，使其溶解，最后用ddH2O定容至1000mL，室温保存即可。若配制1×电泳缓冲液，直接加ddH2O稀释即可。（9）封闭液脱脂奶粉：2.5gTBST：50mL搅拌充分溶解，防止大量的泡沫产生，-20℃保存备用。（10）转膜缓冲液Tris：2.9g甘氨酸（Glycine）：1.45gSDS：0.185gddH2O：300mL搅拌使其充分溶解，再加入甲醇100mL，最后用ddH2O定容至500mL，室温保存。（11）0.05mol/L包被液（CB）的配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加ddH2O至1000mL，调PH至9.6，溶解后4℃保存备用。（12）0.01mol/LPBS的配制：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，加ddH2O至1000mL，充分溶解后调PH至7.4，溶解后4℃保存。（13）PBST洗涤液：PBS溶液1000mL，Tween-200.5mL，溶解后4℃保存。（14）封闭液：以PBST为介质的5%的脱脂奶粉，溶解后4℃保存。（15）底物溶液0.1mol/L柠檬酸溶液（A液）：柠檬酸21g，ddH2O加至1000mL，溶解后4℃保存。0.2mol/LNa2HPO4溶液（B液）：Na2HPO4·12H2O71.6g，ddH2O加至1000mL，溶解后4℃保存。0.75%H2O2溶液（C液）：30%H2O2溶液0.25mL，ddH2O9.75mL，混匀后4℃保存。（16）TMB显色液（现配现用）：A液5.6mL，B液4.4mL，C液42µL，TMB溶液100µL，混匀。（17）终止液：98%浓H2SO422.2mL，ddH2O177.8mL，混匀后4℃保存。51 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.1.2临床检测样本来源临床检测样本来源于新疆石河子大学第一附属医院就诊病人的新鲜的宫颈脱落细胞样本。用于双抗体夹心ELISA检测方法的抗原以及阳性对照抗体分别购自上海艾博抗公司。1.2方法1.2.1HPVL1偶联多肽免疫小鼠方案本研究中多肽的合成和多肽的KLH偶联以及以偶联片段作为免疫原免疫小鼠获得含有单克隆抗体的细胞上清等工作均有上海市强耀生物工程有限公司完成。具体实验方案流程如下：1.2.2含有单克隆抗体的细胞上清的westernblot检测52 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表3-112％分离胶配方试剂组分体积（10mL）纯水3.3mL30%丙稀酰胺混合液4.0mL1.5mol/LTris·HCl(PH8.8)2.5mL10%SDS0.1mL10%过硫酸铵0.1mLTEMED0.004mL表3-25％浓缩胶配方试剂组分体积（5mL）纯水3.4mL30%丙稀酰胺混合液0.83mL1.0mol/LTris·HCl(PH8.8)0.63mL10%SDS0.05mL10%过硫酸铵0.05mLTEMED0.005mL1.2.3Westernblot鉴定（1）把玻璃板洗干净，晾干后使用。（用蒸馏水测漏，若不漏水，将玻璃板中间的水倒掉）。（2）配置12%的分离胶10mL，将分离胶倒入两块玻璃板之间的缝隙中，切勿倒满，应留有10-15mm的空隙，用蒸馏水将胶压平。（3）待分离胶凝固后，配制5mL5%SDS-PAGE浓缩胶，将玻璃板上部的水倒出，倒入浓缩胶，并插上梳子。（4）浓缩胶凝固后（浓缩胶与分离胶之间会产生一条线），将玻璃板取下，夹于电泳装置。（5）于电泳槽的上下倒入适量的缓冲液（1×Tris-GlycineBuffer），将梳子取下。（6）各孔加样后（蛋白：4×SDS-PAGEloadingbuffer=3:1，混匀，开水煮沸5-10min），即可电泳。电压90V左右。（7）切胶：尽量避免用手摸（可戴上手套），将含有目的蛋白的凝胶切下。53 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立（8）剪6张滤纸和1张NC膜（大小与凝胶大小一致，并将右上角剪去），分别浸入到转膜缓冲液中5-10min。（9）将三层滤纸放于半干式电转移仪中，其上平铺切下的凝胶，后将NC膜着于其上，后上再铺三层滤纸，200mA，（1min-1KD）。各层之间切勿有气泡。（10）小心取出NC膜，切勿用手触到。（11）将NC膜放入杂交瓶中，杂交瓶先用TBST冲洗，然后将NC膜放入，注意转移的方向（没有蛋白的一面与瓶子紧密接触），加入5mL封闭液，37℃作用1h。（12）将NC膜放入盛有TBST的平皿中，（摇床）冲膜三次，每次10min。（13）将NC膜放入杂交瓶中，放入5mL（5mL的TBST，5μL的一抗）一抗（单克隆抗体），4℃孵育过夜。（14）重复步骤（12）。（15）将NC膜放入杂交瓶中，放入5mL（1μL的二抗，5mL的TBST）二抗(兔抗鼠)，37℃作用1h。（16）重复步骤（12）。（17）将NC膜放入杂交瓶中，加入1mL显色液（DAB，现配现用），37℃作用30-50s，尽量避光。（18）显色后，用去离子水终止显色。1.2.4单克隆抗体的纯化与HRP标记将筛选出的阳性克隆株送至上海強耀生物工程有限公司对其进行纯化和HRP标记。1.2.5双抗体夹心ELISA检测方法的建立将纯化以及HRP标记后的单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA检测方的法建立。1.2.5.1双抗体夹心ELISA方法的操作步骤（1）包被：用0.05MPH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释抗体，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液PBST洗3次，每次5min。（2）洗涤：弃去孔中液体，每孔加入洗涤缓冲液PBST100µL，将酶标板置于微量振荡器震荡30s，室温静置5min，弃去孔中液体后用吸水纸拍干，重复3次。（3）封闭：每孔加入100µL的脱脂奶粉溶液，放于湿盒中37℃封闭3h。（4）洗涤：弃去孔中液体，每孔加入100µLPBST洗涤3次，每次5min。（5）加样：加一定稀释的抗原100µL于上述已包被的反应孔中，置37℃湿盒中孵育1小时。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。（6）洗涤：弃去孔中液体，每孔加入100µLPBST洗涤3次，每次5min。（7）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体100µL，37℃湿盒中孵育0.5-1小时，洗涤。（8）洗涤：弃去孔中液体，每孔加入100µLPBST洗涤3次，每次5min。54 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立（9）加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃避光显10-30min。（10）加终止液：当阳性对照孔中出现明显的颜色变化时，每孔加入50µL终止液终止反应。（11）在ELISA检测仪上，于450nm处，读取每个反应孔的OD值。1.2.5.2各组分最适浓度优化1.2.5.2.1单克隆抗体包被浓度的确定将一株单克隆抗体（蛋白含量约为1.69mg/mL）作为捕获抗体，用包被缓冲液分别作10倍、50倍、100倍、200倍稀释后包被，每孔加100μL，4℃包被过夜。次日，将板子中包被液弃掉，加入PBST清洗一遍，用吸水纸将其拍干。加入封闭液37℃封闭3小时后，加入商品化的HPVL1全长蛋白抗原（50μg/mL）作为标准样品，稀释倍数分别为10倍、50倍、100倍，每孔100μL，每个组合两个重复，置于37℃温育1h。将商品化的HPVL1全长蛋白抗体作为阳性对照，PBST作为阴性对照。然后加入稀释的HRP标记的抗体，37℃反应1min，PBST清洗3次后拍干。然后每孔加入显色液，37℃15min后，各加入50μL终止液。在波长为450nm处读取数值。阳性样品平均OD值为P值，阴性样品平均OD值为N值，计算每个稀释度的P/N值，P/N值最大时的包被抗体浓度即为最适抗体包被浓度。1.2.5.2.2最适酶标抗体工作浓度的确定以最适的浓度的单克隆抗体包被酶标板，加入稀释度分别为10倍、50倍、100倍的商品化全长蛋白抗原（50μg/mL），用PBST稀释液将HRP标记好的抗体按1:100、1:200、1:400、1:800倍比稀释，其余检测方法同1.2.5.2.1，计算P/N值，当P/N值最大时所对应的稀释度为最适的酶标抗体的工作浓度。1.2.5.3最佳反应时间优化1.2.5.3.1最适样品反应时间将单克隆抗体按照上述确定好的浓度进行包被，封闭后，抗原于37℃分别作用15min、30min、45min、60min、75min和90min后，加入已经确定好的最佳的HRP标记的抗体浓度，其他步骤不变，测定OD450nm值，并计算P/N值。P/N值最大的对应的时间为最佳抗原反应时间。1.2.5.3.2最佳酶标作用时间同样的方法，将确定好最佳酶标抗体的作用时间分别设为10min、20min、30min、40min、50min和60min，其他步骤不变，测定OD450nm值，并计算P/N值。P/N值最大的对应的时间为最佳酶标作用时间。55 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立1.2.5.3.3最佳显色时间同样的方法，将底物显色的时间分别设为5min、10min、15min、20min、25min和30min，其他步骤不变固定，测定OD450nm值，并计算P/N值。P/N值最大时对应的显色时间为最佳显色时间。1.2.5.3.4双抗体夹心ELISA方法临界值的确定按上述建立的双抗体夹心ELISA方法对20份经HC2筛查和型特异性PCR检测均为阴性的宫颈脱落细胞样本进行检测，测定其OD450nm值并进行统计学分析，计算出20份样品的平均值（X）和标准差（S），确定双抗体夹心ELISA方法的阴阳性临界值（X+2S），OD450nm值≥X+2S时为阳性，否则为阴性。1.2.5.4建立的HPV双抗体夹心ELISA法的质量评价1.2.5.4.1特异性用已经建立好的的双抗体夹心方法去检测牛血清、羊血清、人血清及鼠血清，验证该方法的特异性。1.2.5.4.2重复性随机抽取3个不同时间段包被的酶标板各1块，每板抽取2条，每条抽取3孔共6孔，分别检测同一抗原，计算CV%，分析该方法的批内和批间重复性。1.2.5.5TS-PCR检测与双抗体夹心ELISA检测方法的比较66份新鲜宫颈脱落细胞样本，分别加入1mL生理盐水，震荡洗脱宫颈脱落细胞，离心弃上清，加入300µL蒸馏水，-20℃充分冻融2-3次以裂解细胞，离心取上清，利用本试验建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测，并将检测结果与TS-PCR检测结果进行比较，确定该方法的特异性、敏感性以及符合率。TS-PCR检测的阴性样品用双抗体夹心ELISA方法检测为阴性的检出率即为特异性；TS-PCR检测的阳性样品用ELISA检测为阳性的检出率即为敏感性；两种方法检测结果一致的宫颈脱落细胞样本总数占总体样本的比例即为符合率。2结果2.1杂交瘤细胞培养上清的筛选以偶联的多肽片段偶联小鼠，最终共获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的细胞上清。由Westernblot筛选鉴定发现只有10#、5#的细胞上清发生了特异性反应；其56 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立余株的细胞上清无反应。采用辛酸-硫酸铵法对5#和10#的杂交瘤细胞培养上清进行纯化，并对10#进行HRP标记。图3-1.细胞上清WB检测结果Marker=蛋白Marker；4、25、22、20、19、18、15、13、11、10、8、5、3、2、1分别代表不同株的细胞培养上清Fig.3-1WesternblotinganalysisofcellsupernatantMarker=ProteinMolecularWeightMarker;4,25,22,20,19,18,15,13,11,10,8,5,3,2,1representthediffenerentstrainscellsupernatant2.2双抗体夹心ELISA检测方法建立中各条件的优化2.2.1最适单克隆包被浓度的确定不同浓度的5#单克隆抗体包被后，4℃包被过夜，与不同稀释度的抗原作方阵滴定，酶标抗体稀释度为1:100时，测定各样本的OD450nm值。并计算P/N值，然后以包被浓度为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制折线图，见图3-1。在不同的抗体稀释度中，以100倍稀释，即当单克隆抗体以16.9μg/mL浓度包被，所对应的P/N值最大，因此16.9μg/mL是单克隆抗体的最适包被浓度。57 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图3-2单克隆抗体最适包被浓度的确定Fig.3-2Determinationofthecoatingconcentrationofmonoclonalantibodies2.2.2最适酶标抗体浓度的确定将HRP标记的10#单克隆抗体按1:100、1:200、1:400、1:800稀释，以酶标抗体的稀释度为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制折线图，见图3-2。在各稀释浓度中，1:100浓度的P/N值最大，因此1:100为酶标抗体的最佳稀释浓度。图3-3酶标抗体工作浓度的确定Fig.3-3DeterminationofworkingconcentrationforHRP-labeledmonoclonalantibodies58 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立2.2.3最适样品反应时间的确定在加入抗原后37℃分别温育15min、30min、45min、60min、75min和90min，其他条件固定，TMB显色后，读取OD值，计算P/N值，以样品温育的时间为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制折线图，见图3-3。其中在温育45min时，P/N值最高，因此抗原反应的最适时间为45min。图3-4抗原最适作用时间确定结果Fig.3-4Theoptimalfunctiontimeforantigen2.2.4酶标抗体最佳作用时间在加入酶标抗体后，在37℃条件下分别温育10min、20min、30min、40min、50min和60min，其他条件固定，加入TMB显色后，以酶标抗体的作用时间为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制折线图。见图3-4。当酶标抗体的作用时间为40min时，P/N值最大，因此40min为酶标抗体的最佳作用时间。59 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立图3-5酶标抗体作用时间测定结果Fig.3-5TheoptimalfunctiontimeforHRP-labeledmonoclonalantibodies2.2.5最佳显色时间的确定将底物显色时间分别确定为5min、10min、15min、20min、25min和30min，其他条件不变，以显色时间为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制折线图，见图3-5。当显色时间为15min时，P/N值最高。因此显色15min为底物的最佳显色时间。图3-6最佳显色时间测定结果Fig.3-6Theoptimalfunctiontimeforcoloration2.2.6双抗体夹心ELISA方法临界值的确定TS-PCR检测为阴性的宫颈脱落细胞样本20份，用建立的双抗体夹心ELISA方法60 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立进行检测，计算出20份阴性样品的平均OD450nm值（Χ）为0.0761，标准差（S）为0.0355。在阴性和阳性对照成立的情况下，确定阴阳性临界值（Χ+2S）为0.147，若样本OD450nm值≥0.147时，判为阳性；OD450nm值＜0.147时判为阴性。2.3双抗体夹心ELISA方法验证2.3.1特异性检测用已经建立好的的双抗体夹心方法去检测牛血清、羊血清、人血清及鼠血清，验证该方法的特异性。检测结果见图3-6，发现仅人血清的检测结果为阳性，表明该方法特异性良好。图3-7特异性分析Fig.3-7Thespecificityanalysisofthemethod2.3.2重复性分析随机抽取3个不同时间段包被的酶标板各1块，每板抽取2条，每条抽取3孔共6孔，分别检测同一抗原，检测结果见表3-3。3个批次批内变异系数CV%分别为2.60%、2.40%和5.03%，基本上均小于5%，符合要求，说明批内重复性较好；批间变异系CV%分别为3.00%、2.99%、2.56%、3.40%、1.90%、3.00%，均小于5%，说明批间重复性较好。61 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立表3-3批内/批间变异系数Table3-3Intra-assay/Inter-assaycoefficientofvariation第一批第二批第三批标准差均值C/V（%）0.3290.3360.3490.010150.3383.000.3450.3250.3360.010020.3352.990.3290.3350.3460.008620.3372.56OD450nm值0.3450.3340.3220.01150.3343.400.3350.3280.3410.006510.3351.900.3240.3150.3050.00950.3153.00标准差0.008850.008040.1675均值0.3350.3290.333C/V（%）2.602.405.032.3.3TS-PCR检测与双抗体夹心ELISA检测方法的比较结果利用本试验建立的双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR检测同时检测66份宫颈脱落细胞样本，检测结果见表3-4，利用制备的单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA与型特异性PCR的符合率为81.8%。表3-4双抗体夹心ELISA方法与型特异性PCR检测的比较结果Table3-4ComparisonofbetweensandwichELISAandTS-PCRtestfordetectingclinicalsamplesTS-PCR双抗体夹心ELISA阳性1911阴性4755总数6666符合率（%）81.83讨论宫颈癌是少数几个能够借助筛查而降低死亡率的恶性肿瘤之一，宫颈癌的防治已成[66]为全球关注的公共卫生问题。由于目前存在的宫颈癌筛查方法多种多样，在过去的几[111]十年间，宫颈涂片作为一种常用的宫颈筛查方法而被广泛推广使用。但是由于血液、粘液的存在以及固定不及时、染色不均以及在结果诊断的时候容易受人的主观因素的影[112,113]响，这常常会导致误诊、漏诊等情况的发生。据报道，每年有超过300万的女性，因为不确定的细胞涂片结果而要进一步的接受HPV、阴道镜或者宫颈的活组织检查，以[114]排除恶性的可能。目前在我国因为缺乏完整、统一、规范的宫颈筛查方法而使宫颈癌的发生率处于较高发的水平，尤其是在经济较为落后的地区，如新疆北疆地区，因此62 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立寻找一种操作方便且适合当地经济发展水平的筛查方法尤为重要。考虑到以上原因，本研究旨在建立一种新的、操作简单、价格低廉、病人更愿意接受的宫颈检测方法。本研究在获得保守多肽片段的基础上对多肽片段进行偶联，并用偶联的多肽片段免疫小鼠，最终共获得15株含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的细胞上清。由Westernblot筛选鉴定发现只有10#、5#的细胞上清发生了特异性反应；其余株的细胞上清无反应。采用辛酸-硫酸铵法对5#和10#的杂交瘤细胞培养上清进行纯化，并对10#进行HRP标记。其中以纯化后的5#单抗作为捕获抗体，以纯化后进行HRP标记的10#单抗作为检测抗体来建立双抗体夹心ELISA检测方法。双抗体夹心ELISA检测方法由于检测灵敏度高、特异性强、稳定性好，可定量检测等优点，已被应用于多方面的研究，如病毒、细菌和寄生虫的检测。本实验在建立起双抗体夹心ELISA检测方法的基础上对在检测过程中可能会影响其检测结果的条件进行了逐个优化，以期建立起一种快速检测HPV抗原的双抗体夹心ELISA方法。为验证双抗体夹心ELISA检测方法是否具有较好的特异性，用建立起的双抗体夹心ELISA检测方法分别检测牛血清、羊血清、人血清以及鼠血清，发现只与人血清产生了特异性反应，而与牛血清、羊血清等其他几种血清不会产生特异性反应，说明了该检测方法的特异性良好。该研究在对双抗体夹心ELISA检测方法的重复性进行验证后，发现该检测方法重复性良好，从而保证了该方法的可靠性以及准确性，这对HPV的检测以及筛查有着重要的意义。本试验建立的双抗体夹心ELISA，可应用于快速检测HPV抗原，与TS-PCR方法进行比较，符合率为81.8%。由此可见，双抗体夹心ELISA方法与TS-PCR的检测结果的符合率较高。ELISA检测方法中的各个步骤都会影响测定结果，本实验对单克隆抗体的包被浓度以及酶标抗体的最佳稀释浓度、抗原和酶标抗体的作用时间以及最佳显色时间都进行了优化，结果判定是以P/N值较大为标准。在本实验中OD450nm值较低，这可能和酶的活性不高有关。还有可能是两株单克隆抗体所识别抗原分子上的不同抗原结合位点发生了重叠现象。另外，本实验所制备的单克隆抗体只是针对HPVL1基因中的部分保守片段，而对于其他基因型所引起的HPV感染，所建立的双抗体夹心ELISA方法是不能检测的。本研究中所建立的ELISA检测方法，操作简单、结果易读。但由于一些条件还未优化（如检测抗原的最低浓度等），还没有在临床样本上进行预实验。目前查阅国内外文献，尚未见其相关的报道。因此推测该检测方法可初步应用检测宫颈脱落细胞中的HPV抗原，从而为为宫颈癌及癌前病变的早期诊断提供基础。63 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立全文总结与展望总结1、首次对新疆北疆地区HPV的流行进行了调查，发现：（1）新疆北疆地区HPV的感染率仍然处于一个较高的水平，其中在年龄<25岁和≥55岁时出现感染高峰；（2）HR-HPV的检出率随着宫颈病变等级的增加而增加，而LR-HPV随着宫颈病变程度的增加，其检出率变化不大；（3）共检测出29种HPV基因型，其中HR-HPV17种，LR-HPV12种，其中发生率较高的HR-HPV依次为HPV16、53、52、58、35；（4）在对宫颈病变样本中HPV多重感染的检测中发现，主要以二重感染为主，其中以HPV16型的合并感染最为常见，其次是HPV52，同时还出现了三重、四重、五重、六重感染，并且多重感染与宫颈病变的严重程度无关。2、成功扩增出了HPV16、18、52、53、58基因型的L1基因序列全长，通过与疫苗株/美国株序列进行比对，发现在氨基酸水平上均发生了突变。并以HPV16型为研究对象，通过生物信息学分析，新疆株与疫苗株在HPVL1基因对应的蛋白二级结构、三级结构以及抗原表位均存在着差异，这为引进和研制适合新疆北疆地区特点的HPV疫苗奠定基础；本研究还参照以往的研究，筛选出了（55PNNNKILVPKVSGLQYRVFR74）为多肽合成序列。3、合成的多肽与KLH进行偶联后免疫动物，获得单克隆抗体，并以纯化和纯化后进行HRP标记的单克隆抗体分别为捕获抗体和检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。该方法预计可初步应用于宫颈脱落细胞中HPV的检测。不足本实验因为未对LR-HPV进行型特异性检测而导致本研究中LR-HPV的发生率较低，未准确得出LR-HPV在宫颈病变样本中的流行状况；本研究的研究样本主要来源于汉族以及有宫颈病变的人群，而少数民族样本所占较少；本实验中抗原与单克隆抗体的结合位点还不是很清楚；所构建的双抗体夹心ELISA法的各个反应条件仍需要进一步的优化。而此方法目前只是在实验室进行了初步验证，而未应用于临床样本的检测，并且检测水平仅处于μg/ml级，还需要进一步提高敏感性。展望本研究主要的研究人群为汉族有宫颈病变的人群，而对少数民族以及正常人群中HPV的感染情况未进行研究，因此，在此基础上我们可以扩大研究样本的来源，来确定在新疆北疆地区不同民族，不同人群中HPV的流行情况；64 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立本研究通过对流行HR-HPV基因型的主要衣壳蛋白的L1基因序列进行扩增，得出疫苗株和美国株之间的变异情况，并利用软件模拟蛋了白质的二级结构和三级结构。在此基础上可对新疆北疆部分地区流行HPV基因型进行预测，最终制备出符合该地区HPV流行特点的多价HPV预防性疫苗。本实验通过对HPVL1单克隆抗体的制备与鉴定以及双抗体夹心法的构建，在此基础上，可以进行下一步研究：所构建的单抗-酶标单抗的双抗体夹心ELISA法可进一步优化，目前该检测方法只是初步建立，但是其灵敏度仍需要进一步的提高，从而使其更好的应用到宫颈脱落细胞样本中HPV感染的检测；制备的抗HPVL1的单克隆抗体除了能用于过氧化物酶标记建立ELISA法外，还能利用荧光、胶体金等标记技术建立相关的免疫学检测方法，用于医学领域应用研究。65 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立参考文献[1]朱亚莎,周艳秋,张薇,等.宫颈癌及癌前病变相关危险因素分析[J].中国妇幼保健健康,2008,19(5):425-428.[2]ParkinDM,BaryF,FerlayJ,etal.Estimatingtheworldcancerburden:Globocan2000[J].IntJCancer,2001,94(2):153-156.[3]李秀娟.宫颈癌流行病学及高危因素研究进展[J].实用医技杂志,2006,13(19):3517-3518.[4]张丹丹,高琴.细胞周期依赖性蛋白激酶8在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达[J].海南医学院学报,2015,21(1):24-26.[5]李国慧.人类乳头状瘤病毒载量与宫颈病变关系研究进展[J].中国医药,2013,8(7):1039-1040.[6]李华,高国兰.HPV与宫颈癌的研究进展[J].实用癌症杂志,2007,22(4):420-422.[7]龙香娥,费红军.病原微生物感染与宫颈癌关系的研究进展[J].山东医药,2011,51(47):115-116.[8]赖亭吉.HPV感染所致宫颈病变组织中树突状细胞的变化及其机制初探[D].南京医科大学.[9]BernardHU,BurkRD,ChenZ,etal.Classificationofpapillomaviruses(PVs)basedon189PVtypesandproposaloftaxonomicamendments[J].Virology,2010,401(1):70-79.[10]吴意,周晓梅,吴正林,等.人乳头状瘤病毒基因分型在宫颈组织病变筛查中的应用[J].中国微生物学和免疫学杂志,2009,29(2):191-192.[11]余兰,张捷,魏丽华.福建省宁德市门诊女性就诊人群人乳头瘤病毒感染状况分析[J].实用医技杂志,2013,20(10):1065-1067.[12]孔迎辉,周毅成,刘慧瑜,等.雌、孕激素与HPV感染协同致病作用[J].ChinJLeprSkinDis,2012,28(1):32-34.[13]汤惠茹,吴瑞芳,周艳秋,等.不同程度宫颈病变感染人乳头瘤病毒的亚型种类[J].实用医学杂志,2007,23(9):1334-1336.[14]石玲玲.宫颈上皮内病变中Pinl、CyclinD1的表达与HPV16/18感染的关系[D].沈阳:中国医科大学,2008.[15]施迎迎.高危型人乳头瘤病毒感染与宫颈病变的关系[D].福建医科大学,2011.[16]deVilliersEM,FauquetC,BrokerTR,etal.Classificationofpapillomavirus[J].Virology,200,324(1):17-27.[17]LoffredoD'OttavianoMG,DiscacciatiMG,AndreoliMA,etal.HPV16IsRelatedtotheProgressionofCervicalIntraepithelialNeoplasiaGrade2:ACaseSeries[J].ObstetGynecolInt,2013,2013,1-5.[18]StebenM,Duarte-FrancoE.Humanpapillomavirusinfection:epidemiologyandpathoPHysiology[J].GynecolOncol,2007,107(2Suppl1):S2-5.[19]潘敏,莫伯辉.72例宫颈细胞学ASCUS诊断的病理分析[J].现代实用医学,2006,18(9):640-641.[20]AltekruseSF,LaceyJVJr,BrintonLA,etal.Comparisonofhumanpapillomavirusgenotypes,sexual,andreproductiveriskfactorsofcervicaladenocarcinomaandsquamouscellcarcinoma:N66 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立ortheasternUnitedStates[J].AmJObstetGynecol,2003;188(3):657-663.[21]PirogEC,KleterB,OlgacS,etal.PrevalenceofhumanpapillomavirusDNAindifferenthistologicalsubtypesofcervicaladenocarcinoma[J].AmJPathol,2000,157(4):1055-1062.[22]deCremouxP,delaRochefordièreA,SavignoniA,etal.Differentoutcomeofinvasivecervicalcancerassociatedwithhigh-riskversusintermediate-riskHPVgenotype[J].IntJCancer,2009,124(4):778-782.[23]AlonsoI,TornéA,Puig-TintoréLM,etal.High-riskcervicalepithelialneoplasiagrade1treatedbyloopelectrosurgicalexcision:follow-upandvalueofHPVtesting.AmJObstetGynecol,2007,197(4):359.e1-6.[24]CliffordGM,SmithJS,AguadoT,etal.ComparisonofHPVtypedistributioninhigh-gradecervicallesionsandcervicalcancer:ameta-analysis.BrJCancer,2003,89(1):101-105.[25]MuñozN,BoschFX,deSanjoséS,etal.Epidemiologicclassificationofhumanpapillomavirustypesassociatedwithcervicalcancer[J].NEnglJMed,2003,348(6):518-527.[26]CalifanoJ.Humanpapillomavirus-relatedoralcancer[J].DentalAbstracts,2014,59(3):159-160.[27]FranceschiS.TheIARCcommitmenttocancerprevention:theexampleofpapillomavirusandcervicalcancer[J].RecentResultsCancerRes,2005,166:277-297.[28]AnHJ,ChoNH,LeeSY,etal.Correlationofcervicalcarcinomaandprecancerouslesionswithhumanpapillomavirus(HPV)genotypesdetectedwiththeHPVDNAchipmicroarraymethod[J].Cancer,2003,97(7):1672-1680.[29]KimCJ,JeongJK,ParkM,etal.HPVoligonucleotidemicroarray-baseddetectionofHPVgenotypesincervicalneoplasticlesions[J].GynecolOncol,2003,89(2):210-217.[30]余小定,陈盈盈,赵莹.2009年-2013年余姚市中医医院2390例妇女HPV感染情况分析[J].中国卫生检验杂志,2014,24(23):3425-3427.[31]Chinanationalcause-of-deathsurveys.http://cancernet.cicams.ac.cn/data/epi/censusChinaCancerDatabaseWebsite.[32]郝敏,王静芳.宫颈癌流行病学研究与调查[J].国外医学妇幼保健分册,2005,16(6):404-406.[33]BurchellAN,WinerRL,deSanjoséS,etal.Chapter6:EpidemiologyandtransmissiondynamicsofgenitalHPVinfection[J].Vaccine,2006,24Suppl3:S3/52-61.[34]BoschFX,LorinczA,MuñozN,etal.Thecausalrelationbetweenhumanpapillomavirusandcervicalcancer[J].JClinPathol,2002,55(4):244-265.[35]MatshaT,ErasmusR,KafukoAB,etal.HumanpapillomavirusassociatedwithoesoPHagealcancer[J].JClinPathol,2002,55(8):587-590.[36]张三泉,曾抗,赵彤.HPV-16E6/E7在宫颈癌发生机制及疫苗中的研究[J],中国临床肿瘤.2004,31(16):955-957.[37]范洁琳.HPV感染与宫颈病变关系及相关危险因素研究[D].2014,湖南:中南大学湘雅三医院.[38]郎景和等.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇[J].中华妇产科杂志,2002,37:129-131.[39]RodríguezAC,SchiffmanM,HerreroR,etal.Longitudinalstudyofhumanpapillomavirusp67 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立ersistenceandcervicalintraepithelialneoplasiagrade2/3:criticalroleofdurationofinfection[J].JNatlCancerInst.2010,102(5):315-324.[40]SchneiderA.PathogenesisofgenitalHPVinfection[J].GeniourinMed,1993,69:165-173.[41]王为民.CK8和CK17在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达及意义[D].山东：济南市妇幼保健院。[42]CliffordGM,RanaRK,FranceschiS,etal.Humanpapillomavirusgenotypedistributioninlow-gradecervicallesions:comparisonbygeograPHicregionandwithcervicalcancer[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2005,14(5):1157-1164.[43]NamujjuPB,HedmanL,HedmanK,etal.Lowavidityofhumanpapillomavirus(HPV)type16antibodiesisassociatedwithincreasedriskoflow-riskbutnothigh-riskHPVtypeprevalence[J].BMCResNotes,2011,4:170.[44]VaccarellaS,FranceschiS,SnijdersPJ,etal.Concurrentinfectionwithmultiplehumanpapillomavirustypes:pooledanalysisoftheIARCHPVPrevalenceSurveys[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2010,19(2):503–510.[45]ChaturvediAK,KatkiHA,HildesheimA,etal.Humanpapillomavirusinfectionwithmultipletypes:patternofcoinfectionandriskofcervicaldisease[J].JInfectDis,2011,203(7):910-920.[46]DicksonEL,VogelRI,BlissRL,etal.Multiple-typehumanpapillomavirus(HPV)infections:across-sectionalanalysisoftheprevalenceofspecifictypesin309,000womenreferredforHPVtestingatthetimeofcervicalcytology[J].IntJGynecolCancer,2013,23(7):1295–1302.[47]LeeSA,KangD,SeoSS,etal.MultipleHPVinfectionincervicalcancerscreenedbyHPVDNAchip[J].CancerLett,2003,198(2):187-192.[48]MunagalaR,DonàMG,RaiSN,etal.SignificanceofmultipleHPVinfectionincervicalcancerpatientsanditsimpactontreatmentresponse[J].IntJOncol,2009,34(1):263–271.[49]乌恩其.中国部分地区宫颈癌及相关组织中人乳头瘤病毒分子流行病学调查[D].2009,吉林：生物化学与分子生物学.[50]KatajaV,SyrjänenK,SyrjänenS,etal.Prospectivefollow-upofgenitalHPVinfections:survivalanalysisoftheHPVtypingdata[J].EurJEpidemiol,1990,6(1):9-14.[51]BurkRD,HoGY,BeardsleyL,etal.Sexualbehaviorandpartnercharacteristicsarethepredominantriskfactorsforgenitalhumanpapillomavirusinfectioninyoungwomen[J].JInfectDis,1996,174(4):679-689.[52]FrancoEL,VillaLL,RuizA,etal.Transmissionofcervicalhumanpapillomavirusinfectionbysexualactivity:differencesbetweenlowandhighoncogenicrisktypes[J].JInfectDis,1995,172(3):756-63.[53]潘子旻，吕卫国.绝经激素治疗在宫颈癌术后的应用[J].实用妇产科杂志,2014,30(12):887-888.[54]KjaerSK,SvareEI,WormAM,etal.HumanpapillomavirusinfectioninDanishfemalesexworkers.Decreasingprevalencewithagedespitecontinuouslyhighsexualactivity[J].SexTrans68 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立mDis,2000,27(8):438-445.[55]AlthoffKN,PaulP,BurkeAE,etal.Correlatesofcervicovaginalhumanpapillomavirusdetectioninperimenopausalwomen[J].JWomensHealth(Larchmt),2009,18(9):1341-1346.[56]张咏梅.7455例人乳头瘤病毒检测临床分析[D].2013,河北：河北医科大学.[57]苏丽,周俊.雌激素、孕激素与免疫调控关系的研究进展[J].国际免疫学杂志,2009,32(6):442-445.[58]MorenoV,BoschFX,MuñozN,etal.Effectoforalcontraceptivesonriskofcervicalcancerinwomenwithhumanpapillomavirusinfection:theIARCmulticentriccase-controlstudy[J].Lancet,2002,359(9312):1085-1092.[59]ShieldsTS,BrintonLA,BurkRD,etal.Acase-controlstudyofriskfactorsforinvasivecervicalcanceramongU.S.womenexposedtooncogenictypesofhumanpapillomavirus[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2004,13(10):1574-1582.[60]刘立新.92例宫颈上皮内瘤样变的临床分析[D].2007,吉林:吉林大学第一临床医院.[61]NúñezJT,DelgadoM,PinoG,etal.SmokingasariskfactorforpreinvasiveandinvasivecervicallesionsinfemalesexworkersinVenezuela[J].IntJGynaecolObstet,2002,79(1):57-60.[62]ChaturvediAK,MyersL,HammonsAF,etal.Prevalenceandclusteringpatternsofhumanpapillomavirusgenotypesinmultipleinfections[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2005,14(10):2439-2445.[63]Didelot-RousseauMN,NagotN,Costes-MartineauV,etal.Humanpapillomavirusgenotypedistributionandcervicalsquamousintraepitheliallesionsamonghigh-riskwomenwithandwithoutHIV-1infectioninBurkinaFaso[J].BrJCancer,2006,95(3):355-362.[64]MbulawaZZ,CoetzeeD,MaraisDJ,etal.Genitalhumanpapillomavirusprevalenceandhumanpapillomavirusconcordanceinheterosexualcouplesarepositivelyassociatedwithhumanimmunodeficiencyviruscoinfection[J].JInfectDis,2009,199(10):1514-1524.[65]AbbaMC,VillaverdeLM,GómezMA,etal.Thep53codon72genotypesinHPVinfectionandcervicaldisease[J].EurJObstetGynecolReprodBiol,2003,109(1):63-66.[66]马杰.浅谈宫颈癌的治疗[J].按摩与康复医学,2011,7(下):131.[67]费华丽,吕卫国,谢幸.宫颈癌筛查研究进展[J].国际妇产科学杂志,2010,37(5):314-317.[68]卞美璐.WHO(2006年)宫颈癌综合防治实践指南简介[J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(7):557-560.[69]王宝晨,薛凤霞.《2015年美国宫颈癌筛查过渡期临床指南》解读[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2015,34(6):495-498.[70]PalkerTJ,MonteiroJM,MartinMM,etal.Antibody,cytokineandcytotoxicTlymPHocyteresponsesinchimpanzeesimmunizedwithhumanpapillomavirusvirus-likeparticles[J].Vaccine,2001,19(27):3733-3743.[71]KoutskyLA,AultKA,WheelerCM,etal.Acontrolledtrialofahumanpapillomavirustype69 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立16vaccine[J].NEnglJMed,2002,347(21):1645-51.[72]胡园园,肖长义.制备HPVL1VLP的基因工程技术应用进展[J].山东医药,2008,48(33):115-116.[73]高广宇.HPV16型重组表位疫苗的研制[D].2010,吉林:白求恩医学院.[74]冯靖.多型别HPVL2片段的融合表达及免疫效果研究[D].2009,北京:中国疾病预防控制中心,病毒病预防控制所.[75]FDA批准人乳头瘤疫苗预防肛门癌.临床合理用药,2011,4(1B):18.[76]Merck公司的HPV疫苗对较大年龄妇女有预防作用[J].国外药迅,2009,8:34-35.[77]BrownEC,LittleP,LeydonGM.CommunicationchallengesofHPVvaccination[J].FamPract,2010,27(2):224-229.[78]LuxembourgA,BrownD,BouchardC,etal.PHaseIIstudiestoselecttheformulationofamultivalentHPVL1virus-likeparticle(VLP)vaccine[J].HumVaccinImmunother,2015,11(6):1313-1322.[79]BlockSL,NolanT,SattlerC,etal.ComparisonoftheimmunogenicityandreactogenicityofaproPHylacticquadrivalenthumanpapillomavirus(types6,11,16,and18)L1virus-likeparticlevaccineinmaleandfemaleadolescentsandyoungadultwomen[J].Pediatrics,2006,118(5):2135-2145.[80]VillaLL,CostaRL,PettaCA,etal.HighsustainedefficacyofaproPHylacticquadrivalenthumanpapillomavirustypes6/11/16/18L1virus-likeparticlevaccinethrough5yearsoffollow-up[J].BrJCancer,2006,95(11):1459-1466.[81]OlssonSE,VillaLL,CostaRL,etal.InductionofimmunememoryfollowingadministrationofaproPHylacticquadrivalenthumanpapillomavirus(HPV)types6,11,16,18L1virus-likeparticle(VLP)vaccine[J].Vaccine,2007,25(26):4931-4939.[82]庞正.HPV6型L2E7E6融合蛋白治疗性疫苗的原核表达及其免疫效果评价[D].2010,北京:中国疾病预防控制中心,病毒病预防控制所.[83]MullisKB,FaloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction[J].MethodsEnzymol,1987,155:335-350.[84]SaikiRK,ScharfS,FaloonaF,etal.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia[J].Science,1985,230(4732):1350-1354.[85]KoskinenWJ,BrøndboK,MellinDahlstrandH,etal.Alcohol,smokingandhumanpapillomavirusinlaryngealcarcinoma:aNordicprospectivemulticenterstudy[J].JCancerResClinOncol,2007,133(9):673-678.[86]王瑜敏,陶志华,陈占国,等.巢式PCR检测人乳头瘤病毒的方法学建立及初步临床应用[C].全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议.[87]蓝巨辉,赵劲松.实时荧光定量PCR法与杂交捕获法在高危型HPV检测中的比较[J].标记免疫70 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立分析与临床,2013,20(2):124-125.[88]EngvallE,PerlmannP.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)[J].QuantitativeassayofimmunoglobulinG.Immunochemistry,1971,8(9):871-874.[89]蒋志琴.LEEP刀宫颈锥切的围手术期护理[J].实用临床医药杂志,2011,15(6):17-19.[90]玛依努尔.尼牙孜,李丽,陈凤,等.新疆维吾尔族女性人乳头瘤病毒感染与宫颈癌相关性的流行病学调查[J].临床肿瘤学杂志,2011,16(4):322-325.[91]VenceslauEM,BezerraMM,LopesACM,etal.HPVdetectionusingprimersMY09/MY11andGP5+/GP6+inpatientswithcytologicand/orcolposcopicchanges[J].J.Bras.Patol.Med.Lab,2014,50(4):280-285.[92]GheitT,TommasinoM.Detectionofhigh-riskmucosalhumanpapillomavirusDNAinhumanspecimensbyanovelandsensitivemultiplexPCRmethodcombinedwithDNAmicroarray[J].MethodsMolBiol,2011,665:195-212.[93]XuQX,ZhangZY.High-riskhumanpapillomavirusgenotypesincervicallesionsandvaccinationchallengesinChina[J].AsianPacJCancerPrev,2015,16(6):2193-2197.[94]Lazcano-PonceE,HerreroR,MuñozN,etal.EpidemiologyofHPVinfectionamongMexicanwomenwithnormalcervicalcytology[J].IntJCancer,2001,91(3):412-420.[95]CliffordGM,RanaRK,FranceschiS,etal.Humanpapillomavirusgenotypedistributioninlow-gradecervicallesions:comparisonbygeograPHicregionandwithcervicalcancer[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2005,14(5):1157-1164.[96]LeeGY,KimSM,RimSY,etal.Humanpapillomavirus(HPV)genotypingbyHPVDNAchipincervicalcancerandprecancerouslesions[J].IntJGynecolCancer,2005,15(1):81-87.[97]王焕妮,王慧儒,胡鹏,等.宫颈上皮内瘤变II-III级患者HPV感染的分型及特点[J].广西医科大学学报,2014,31(2):220-222.[98]孙波,张冰,李建华.高危亚型HPV33和HPV52感染与宫颈病变的关系[J].解剖科学进展,2012,18(5):435-437.[99]LeeSAKangD,SSS,JeongJK,etal.MultipleHPVinfectionincervicalcancerscreenedbyHPVDNAChip[J].CancerLetters,2003,198(2):187-192.[100]KayP,SoetersR,NevinJ,etal.HighprevalenceofHPV16inSouthAfricanwomenwithcancerofthecervixandcervicalintraepithelialneoplasia[J].JMedVirol,2003,71(2):265-273.[101]施迎迎.高危型人乳头瘤病毒感染与宫颈病变的关系[J].2011,福建:福建医科大学.[102]陈俊,董海艳,朱珊丽,等.温州地方株HPV16型L1基因多态性及蛋白特性分析[J].温州医学院学报,2009,39(6):538-540.[103]MatsumotoK,YoshikawaH,YasugiT,etal.IgGantibodiestohumanpapillomavirus16,52,58,and6L1capsids:case-controlstudyofcervicalintraepithelialneoplasiainJapan[J].JMedVirol,2003,69(3):441-446.[104]UrquizaM,GuevaraT,EspejoF,etal.TwoL1-peptidesareexcellenttoolsforserological71 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立detectionofHPV-associatedcervicalcarcinomalesions[J].BiochemBioPHysResCommun,2005,332(1):224-232.[105]YueYF,YangHY,WUK,etal.GeneticVariabilityinL1andL2GenesofHPV-16andHPV-58inSouthwestChina[J].PLoSOne,2013,8(1):e55204.[106]ShenMJ,DingXP,LiTJ,etal.SequencevariationanalysisofHPV-18isolatesinsouthwestChina[J].PLoSOne,2013,8(2):e56614.[107]LuoZY,ChenQ,YangLY,etal.AnalysisofL1genepolymorPHismofhumanpapillomavirustype52fromChaozhouareaofChina[J].ChinJLabDiagn,2013,17:793-798.[108]BittleJL,HoughtenRA,AlexanderH,etal.Protectionagainstfoot-and-mouthdiseasebyimmunizationwithachemicallysynthesizedpeptidepredictedfromtheviralnucleotidesequence[J].Nature,1982,298(5869):30-33.[109]TosiP,PalliniV,CintorinoM,etal.UseofantibodiesagainstasyntheticpeptideoftheE6proteinofhumanpapillomavirus(HPV)type16forthediagnosisofgenitalHPVlesions[J].Cytopathology,1993;4(1):3-15.[110]DreyfusM,BaldaufJJ,RitterJ,etal.SericandlocalantibodiesagainstasyntheticpeptideofHPV16[J].EurJObstetGynecolReprodBiol,1995,59(2):187-191.[111]PapanicolaouGN.NewCancerDiagnosis.RaceBettermentFoundation,BattleCreek,MI,pp.1928,528–534.[112]BoucherJ,Anku-BertholetC,TemmarR,etal.Evaluationofp16INK4a,minichromosomemaintenanceprotein2,DNAtopoisomeraseIIalPHa,ProExC,andp16INK4a/ProExCincervicalsquamousintraepitheliallesions[J].HumPathol,2009,40(6):904-905.[113]SiddiquiMT,HornamanK,CohenC,etal.ProExCimmunocytochemistryandhigh-riskhumanpapillomavirusDNAtestinginpapanicolaoutestswithatypicalsquamouscell(ASC-US)cytology:correlationstudywithhistologicbiopsy[J].ArchPatholLabMed,2008,132(10):1648-1652.[114]ShroyerKR,HomerP,HeinzD,etal.ValidationofanovelimmunocytochemicalassayfortopoisomeraseII-alPHaandminichromosomemaintenanceprotein2expressionincervicalcytology[J].Cancer,2006,108(5):324-330.72 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立附件1本研究所获得序列的GENBANK登录号：KU721777-KU721803;KU195223-KU195254;KT943723-KT94374;KT070090-KT070137;KT884597HPV16（疫苗株）的L1的氨基酸序列MQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQMSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVHTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGTVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTQAIACQKHTPPAPKEDDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKLHPV18（疫苗株）的L1的氨基酸序列MCLYTRVLILHYHLLPLYGPLYHPRPLPLHSILVYMVHIIICGHYIILFLRNVNVFPIFLQMALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTPTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMPASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTPSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTSSKPAKRVRVRARK73 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立附件2新疆株与疫苗株的氨基酸比对结果疫苗株.seqMQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQMSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVA55KU721786.seqMQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQMSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVA55KU721787.seqMQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQMSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVA55KU721788.seqMQVTFIYILVITCYENDVNVYHIFFQMSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVA5518283疫苗株.seqRTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFG110KU721786.seqRTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFG110KU721787.seqRTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFG110KU721788.seqRTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFG110疫苗株.seqFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANA165KU721786.seqFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANA165KU721787.seqFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANA165KU721788.seqFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANA165疫苗株.seqGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTV220KU721786.seqGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTV220KU721787.seqGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTV220KU721788.seqGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTV220疫苗株.seqIQDGDMVHTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFY275KU721786.seqIQDGDMVdTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFY275KU721787.seqIQDGDMVdTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFY275KU721788.seqIQDGDMVdTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFY27518294疫苗株.seqLRREQMFVRHLFNRAGTVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDA330KU721786.seqLRREQMFVRHLFNRAGaVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDA330KU721787.seqLRREQMFVRHLFNRAGaVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDA330KU721788.seqLRREQMFVRHLFNRAGaVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDA330疫苗株.seqQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTN385KU721786.seqQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTN385KU721787.seqQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTN385KU721788.seqQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTN385疫苗株.seqFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTL440KU721786.seqFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTL440KU721787.seqFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTL440KU721788.seqFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTL44074 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立疫苗株.seqEDTYRFVT.QAIACQKHTPPAPKEDDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKF494KU721786.seqEDTYRFVTsQAIACQKHTPPAPKED.PLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKF494KU721787.seqEDTYRFVTsQAIACQKHTPPAPKED.PLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKF494KU721788.seqEDTYRFVTsQAIACQKHTPPAPKED.PLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKF494疫苗株.seqLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL531KU721786.seqLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL531KU721787.seqLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL531KU721788.seqLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL53175 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立附件3HPVL1疫苗株的蛋白二级结构预测76 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立HPV16L1新疆株蛋白二级结构预测77 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立致谢时光荏苒，岁月如梭。三年的研究生生活，忙碌却很充实，喜悦中夹杂着忧伤，不但学业有成，收获了许许多多的知识，同时也收获了那浓浓的师生情，同窗情，他们的陪伴，使我能够坚定的走下去，他们的存在给我带来了喜悦和感动，正是他们情深义重的支持和帮助，才使我的研究生生涯这么的有意义。在此，我要衷心感谢我的两位亲爱的导师：动物科技学院王鹏雁副教授和医学院王远志副教授，本论文是在两位导师的悉心指导下完成的。从选题、设计到实施,两位导师都倾注了大量的心血,值此论文完稿之际，衷心感谢两位导师三年来对我的辛勤培育，以及在我做论文过程中给予的指导以及莫大的帮助，两位导师在科学研究上的认真和创新给我树立了榜样，我希望未来有一天我也能够像他们一样。感谢蒋建军老师和柳建新老师，在我研究生期间给予的各方面的关心和帮助，在此致以诚挚的谢意。其次感谢石河子大学第一附属医院病理科任艳老师以及皮肤科贾雪松老师对本实验中所涉及的医学相关问题的帮助，同时感谢石河子大学第一附属医院病理科以及皮肤科对实验样本和病例资料的提供，以及最终病理结果的解释。感谢石河子大学医学院病原生物学与免疫学以及石河子大学动物科技学院人畜共患病实验室的所有老师对我学术上的指导以及生活中的关心与帮助。同时还要感谢师兄师姐师弟师妹们对我实验过程中的鼓励与帮助，使我愉快的度过了三年难以忘怀的研究生生活。最后我要感谢我的家人。感谢你们陪伴我成长，感谢你们培养了我良好的生活习惯，感谢你们对我一直在外求学的宽容与理解，感谢你们对我学习上一如既往的默默支持。千言万语也难以道尽我对你们所有人的感激，请接受我对你们由衷的感激与深深的敬意，祝福我敬爱的老师们以及我的爸妈身体健康，万事如意！祝福我辈都能事业有成！同时，感谢百忙中抽出宝贵时间审阅我论文的各位专家。谢谢您们对我论文所提出的宝贵意见！王丽娜2016年6月78 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立作者简介王丽娜，女，生于1989年8月，籍贯河南。2013年毕业于石河子大学动物科技学院，获农学学士学位。2013年9月起在石河子大学动物科技学院攻读硕士学位。在学期间主要参与的研究项目1.参加了国家科技支撑计划《新疆地方常见疾病防治适宜技术研究与应用》（2013BAI05B05）的部分研究工作。在学期间发表的文章(1)王丽娜，任艳，牟路萌，杜景云，王远志，王鹏雁.新疆北疆部分地区HPV的流行情况及高危型HPV16,18与宫颈病变的关系，石河子大学学报自然科学版，2015,34（1）：58-62.(2)LinaWang,YanRen,LumengMu,YaliZhang,JingyunDu,ZhankunGuo,JianjunJiang,XuesongJia,ChuangfuChen,YuanzhiWang,PengyanWang.Prevalenceoftype-specifichumanpapillomavirusandthecervicalintraepithelialneoplasiainnorthernXinjiang:across-sectionalstudybasedonpopulation[J].ExperimentalandTherapeuticMedicine,accepted.79 新疆北疆部分地区HPV的分子流行病学调查及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅书80