卵泡刺激素的结构、功能与疾病关系

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卵泡刺激素的结构、功能与疾病关系慕云詹显全*作者单位：中国湖南省长沙市湘雅路87号中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室、结构生物学与药物设计湖南省工程实验室、抗癌药物国家地方联合工程实验室(邮编410008)*通讯作者:詹显全,Email:yjzhan2011@gmail.com,Tel:86-731-84327905基金项目：国家高技术“863计划”子项目（2014AA020610-1），国家自然科学基金(81272798;81572278)，湖南省自然科学基金（14JJ7008），湖南省百人计划基金（詹显全），和湘雅医院人才引进基金（詹显全）。摘要：卵泡刺激素是垂体糖蛋白激素家族中的一种，它对于维持正常的生殖功能具有十分重要意义，尤其是对阐明生殖生理过程、诊断和治疗生殖系统疾病非常重要。卵泡刺激素的生物学活性是一系列复杂进程的综合：从垂体中合成释放，存在于血液循环中，随血液循环转运至靶器官，与靶点受体结合，调节生长发育，卵泡成熟和精子发生等。本文综述了近年来在卵泡刺激素结构、功能及其与疾病关系的研究进展。关键词：卵泡刺激素、结构与功能、临床治疗应用Thestructureandfunctionsoffollicle-stimulatinghormoneanditsrelationshipwithdiseasesMUYun,ZHANXianquan*KeyLaboratoryofCancerProteomicsofChineseMinistryofHealth,HunanEngineeringLaboratoryforStructuralBiologyandDrugDesign,StateLocalJointEngineeringLaboratoryforAnticancerDrugs,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,87XiangyaRoad,Changsha,Hunan410008,P.R.China*Correspondingauthor:ZHANXianquan,Email:yjzhan2011@gmail.com,Tel:86-731-84327905Abstract：Follicle-stimulatinghormone(FSH)isamemberofglycoproteinhormone19 superfamily.Itiscrucialinmaintainingnormalfertilization,especiallyinelucidatingfertilizationprocess,diagnosingandcuringreproductivesystemdiseases.TheactivationofFSHisaseriesofcomprehensiveprocess.Itissynthesizedandsecretedbythegonadotrophcellsintheanteriorpituitaryglandandtransportedthroughbloodtothetargetorganandbindstothetargetreceptorstoregulatedevelopment,growth,follicularmaturation,andspermatogenesis.Thisarticlereviewstheresearchprogressinthestructure,function,andrelateddiseasesofFSHtheseyears.Keywords:Follicle-stimulatinghormone,structureandfunction,clinicaltherapeuticapplicationFundprogram:China“863”PlanProject(GrantNo.2014AA020610-1toX.Z.),NationalNaturalScienceFoundationofChina(81272798;81572278toX.Z.),theHunanProvincialNaturalScienceFoundationofChina(GrantNo.14JJ7008toX.Z.),HunanProvincialHundredTalentPlanFunds(toX.Z.),andtheXiangyaHospitalFundsforTalentIntroduction(toX.Z.).1.卵泡刺激素的定义垂体糖蛋白激素(glycoproteinhormones,GPH)是一类具有相似结构的激素家族，除了卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)外，它还包括胎盘绒毛膜和脑垂体前叶分泌的绒毛膜促性腺激素（chorionicgonadotropink,CG）、脑垂体分泌的黄体生成素(luteinizinghormone,LH)、腺垂体分泌的促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone,TSH)[1]。FSH是由垂体前叶分泌的，通过下丘脑-垂体-性腺轴来调节卵巢和睾丸的功能，具有促进类固醇生成和生殖腺中配子发育形成作用的一种促性腺激素[2]。对于雌性，FSH能刺激卵泡成熟、粒层细胞增殖，引起雄性激素转化酶芳香酶合成[3]。FSH和FSH受体的浓度持续升高，然后陡然下降LH引起排卵作用。对于雄性，FSH刺激睾丸支持细胞增殖和维持精子发生[4]。2.基本结构糖蛋白激素是经典的蛋白质激素中结构最复杂的。它由两个亚基通过非共价键连结。α亚基对于所有糖蛋白激素来说是一样的，β亚基有一定的激素特异性但是也因为与共同的α19 亚基结合而出现一定的同源性[5]。糖蛋白激素共同的α-亚基多肽链是一个单个基因的产物，它包含90-96个氨基酸残基，对于某些特定物种它表现出N-末端长度的多态性。绝大部分垂体激素的β亚基包含118-121个残基。α亚基和β亚基分别包含5个和6个二硫键，而且它们的位置在所有激素中是一样的。α亚基中有十个半胱氨酸，其位置在物种之间高度保守。所有的β亚基一共有十二个半胱氨酸，其位置不仅在物种间而且在不同的激素间也是高度保守。共同的α-亚基基因位于6号染色体，包含4个外显子，其中第一个外显子是非编码的。α亚基基因中存在几种沉默多态性，但是都不影响氨基酸序列[6]。迄今为止，在这个基因中只发现了一个氨基酸的改变-----Glu56Ala替代，这是在一种肿瘤异位产生的hCG中鉴定出的。FSH、LH、TSH、hCG这四种糖蛋白激素在序列、结构和功能上是非常相似的。FSH和hCG的晶体结构揭示了α-亚基和β-亚基都包含了相似的胱氨酸节点折叠结构[7]。每一个α亚基都有两个N-联寡聚糖位点，TSH和LH的β亚基有一个N-联寡聚糖位点，CG和FSH有两个N-联寡聚糖位点。糖蛋白的N-联寡聚糖位点对于适当的折叠、组装、分泌、代谢清除、血浆半衰期和生物活性意义重大。在内质网中，寡聚糖促进二硫键的形成和正确折叠[8]。人卵泡刺激素可以被定义为一个异源二聚体糖蛋白激素的分子集合（图1），卵泡刺激素存在多种多样的分子结构，每种结构在生理过程和生化检验中的反应类型也各不相同。因此，卵泡刺激素并不是一个单独的整体，而是一个多种不同结构混杂集结成的集合。其α亚基和β亚基分别包含92个氨基酸和111个氨基酸，每一个亚基都有两个N连接糖基化位点，它们各自的结构是由作用于分子内的二硫键决定的。α亚基的半胱氨酸节点的二硫键已经被证实对于异源二聚体的形成和分泌至关重要。出现在与不同激素特定的β亚基连接时的构象变化，可能在α亚基分子的重要核心区域之外。β亚基的48QKTCT52氨基酸序列对于卵泡刺激素异源二聚体的形成非常重要，进一步研究发现α-亚基的His90-Lys91对于FSH与受体结合非常重要，目前已经鉴定出受体结合位点是在FSHβ-亚基C端区域93-99个氨基酸序列内。每一个亚基的激素特异性位于一个在CG的β亚基Cys93和Cys100之间跟其他β-亚基相对应的序列形成的决定圈。这个圈在异源二聚体的α-亚基周围形成了一个类似安全带的结构[9]。人FSH属于胱氨酸节点生长因子家族，α亚基和β亚基有着相似的拓扑结构，这些拓扑结构中胱氨酸节点是中心模块。在这个模块中，半胱氨酸α10（β3）和α60（β51）之间的二硫键穿过了半胱氨酸28-82和半胱氨酸32-84组成的环形。三个β发夹从胱氨酸节点延伸出来，其中两个在决定圈L1和L3的一个终点的tightβ-turn处终止，另一个在另一端形成了一个更长更开放的决定圈（L2）。α-亚基的L219 决定圈包含了分子中唯一的螺旋形片段，即一个1.5转的垂直于β股的α-螺旋。Β发夹通过二硫键相互交联形成稳定结构。hFSH的二硫键配对α7-31，α10-60,α28-82，α32-84，α59-87，β3-51，β17-66，β20-104，β28-82，β32-84，β87-94与hCG的二硫键配对是同样的，两种亚基都是对齐的头部朝向尾部，彼此间紧密缠绕，这样βL2、αL1和αL3形成了一个延伸的弯曲的异源二聚体结构的终点，αL2、βL1和βL3形成另一个。两个亚基之间通过分子间接触紧密连接，包埋了单体溶剂及表面的32%[10]。FSHβ基因位于11号染色体，包含3个外显子，其中第一个是非编码的。迄今为止只发现了4个女性3个男性出现钝化FSHβ突变。第一个突变，即61号密码子（Val）上纯合子2-bp缺失是在一个原发无月经不育的女性上发现的。这个突变引起氨基酸61-87序列的整体改变，然后提前出现终止密码子。这些改变引起蛋白无法形成正常的、作用于分子内的二硫化物桥梁和正常的三级结构，加速其在分子内降解，阻碍与α-亚基的连接，最终影响FSH生物活性。出现这种改变的女性肾上腺正常，但是没有初潮和乳腺初发育，因为卵泡发育和粒层细胞雌激素产生时缺乏FSH[11]。FSH和相应的受体FSHR对于性腺的正常发育、青春期性成熟和生殖细胞的产生都非常重要。正常的FSH调节卵泡的成熟和雌激素的产生已经支持精子发生。FSHR是G蛋白偶联受体，在由卵巢中的粒层细胞和睾丸中的支持细胞表达[12]（图2）。FSHR编码基因2号染色体2p16.3的短臂。人类FSHR基因横跨54kb，包含10个外显子和9个内含子。人类FSHR基因的细胞外区域是由9个外显子编码的。整个基因编码695个氨基酸，其中包括一个由18个氨基酸构成的信号肽。9个内含子在大小上差异非常明显，VIII号内含子是108bp，I号内含子是15kb.在外显子大小和外显子内含子连接点高度保守性方面人类FSHR基因结构表现出与鼠FSHR基因的高度相似性[13]。FSHR目前已经发现四种变异体（图3），其中FSHR-precursor只在卵巢粒层细胞中表达，与卵泡成熟和粒层细胞分化相关。其与FSH结合引起不同的G蛋白活化，刺激cAMP的产生。有研究发现，FSHR-precursor与多种信号转导通路相关，如MAPKs,ERKs,SFKs等。FSHR-1被称为“结构域阴性”，因为它的结构使之与FSH能高亲和力结合，但是缺乏与FSH结合后活化G蛋白的能力。FSHR-2有一个单跨膜结构域，而且FSHR-2的整体拓扑结构与I型生长因子受体的结构一致。FSHR-2引起钙离子大量内流，还能直接激活粒层细胞的MAPK通路。FSHR-3缺乏跨膜结构域，是一种可溶性FSHR。FSHR-3的功能尚未清楚。有研究推测其功能与胰岛素样生长因子-1-结合蛋白类似[14]。19 图1：人卵泡刺激素总体折叠[10]图2.FSH/FSHR基本结构[15]19 图3.FSHR的变异体[16]图4.FSH与FSHR结合的晶体结构认识[16]19 3.卵泡刺激素的功能3.1卵泡刺激素的基本功能关于FSH的功能有一个普遍概念是FSH受体（R）分子连结一个激素分子（图2，图4），它们通过GS蛋白腺苷酸环化酶共同激活来催化第二信使——cAMP的产生,cAMP随之引起一系列细胞内的反应，从而实现调节蛋白表达及细胞发育进程（图5）。除了几种已知的突变损害FSH或FSH受体功能[17,18]，FSH受体多态性已经被证实会影响卵巢对FSH刺激的敏感性[19]，FSH受体有几个剪接变异体，可表达成生长因子或带单跨膜域的细胞因子受体样蛋白[20]，不同FSH的作用是通过这些相应的受体来调节的。垂体前叶主要由5种类型细胞组成，它们各自分泌特定的激素，其中只有促性腺激素细胞能分泌FSH和LH两种激素。然而这两种激素的分泌是有差异的，这种差异对于它们各自的生物学功能具有重要意义。无论男性还是女性，FSH和LH都是有节奏的分泌来调控生殖过程。对于男性而言，这两种激素能促使睾丸激素的合成以及精细胞的产生和发育。对于女性而言，FSH诱使卵泡成熟，LH的突然猛增促进排卵（图6,图7）。令人意外的是，FSH和LH的差异分泌都是由源于下丘脑的促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲式释放引起的。GnRH通过特定的模式触发促性腺激素细胞[21]中Ca2+波动，从而差异性的触发FSH和LH的释放。与GnRH受体（GnRHR）协同作用调整细胞内Ca2+的信号通路已经被阐明了。目前已有研究在动物上证实FSH在雌鼠体内跟突触结合蛋白-9（syt-9）是高度共定位的，syt-9的减少导致FSH释放减少的现象仅存在于雌鼠，syt-9作为Ca2+感受器在Ca2+触发雌鼠体内FSH释放的过程中发挥重要作用[22]。FSH的生物学功能可总结为：对于男性，FSH与睾丸激素相结合来激起和维持正常精子生成的质量和数量。尽管有研究数据证实在转基因小鼠身上FSH对于雄鼠的生育能力并不重要，但缺乏FSH时精子生成并不完全正常。此外，FSH在灵长类比啮齿类更具争议性。对于女性，FSH对于卵巢滤泡的筛选和发育以及源于雄性激素底物的雌激素的生成非常重要。形成部分细胞和组织的一些中间产物可促进FSH刺激性腺并最终引起排卵。这些细胞反应证明FSH作用的复杂性。FSH是一种生长因子或者回归线激素，一种促分泌激素，也是一种细胞发育的调节器。通常认为FSH绝大部分的细胞外功能是通过cAMP介导的信号通路，尽管FSH也能利用其它信号转导通路如Ca2+[9]。最近研究发现FSH能促进脂质合成和脂滴形成，还能改变瘦素和脂联素的分泌（并非使其增多）。FSH的作用是通过FSH受体偶联Gai蛋白质。因此，Ca2+内流被激活，cAMP19 反应元件结合蛋白质发生磷酸化，一系列脂质合成的基因被激活。FSH能随着年龄增长调节脂肪组织积累和再分布[23]。图5.cAMP信号通路[24]19 图6.卵巢类固醇激素分泌通路[24]19 图7.卵泡成熟过程[24]3.2临床用途3.2.1治疗从人尿液中提取的FSH自从1960年就投入临床使用[25-27]。随着分子生物学技术的发展，可以通过克隆共同α亚基和FSH特异性β亚基的基因来得到人FSH。当包含编码这些亚基的cDNA或者基因组DNA被导入哺乳动物细胞，由此获得有生物活性的人FSH。FSH已被广泛应用于不孕症的治疗[28-30]。它在助孕技术的用途有三项：（1）需要单个健康卵母细胞时，促进排卵；（2）当助孕技术可以有多个胚胎时，促进多重排卵来提高助孕成功率；（319 ）刺激精子发生。治疗女性不育的前提条件就是患者在其他方面是健康的，而生殖方面的一般疾病如无法排卵性不孕可以用安全有效的方法治疗。然而FSH使用的剂量安全窗很窄，即刺激一个卵泡生长的阈值超过最大剂量时可能引起过度排卵。因此，非常容易出现因为医生的治疗而引起卵巢过度刺激综合征或者多胎妊娠。不同的生理和临床状态可能会影响FSH治疗的阈值或者上限水平[9]。3.2.2诊断测定循环中FSH水平被广泛用于诊断多种生殖系统紊乱疾病[31-33]。FSH测定主要用于评估性腺功能。通过经典的内分泌反馈通路，FSH水平增高意味着性腺功能下降或者失去功能。血清FSH浓度正常说明性腺功能正常。血清中低水平的FSH可能代表下丘脑或者垂体有问题。测量血清FSH、LH、雌二醇和睾丸激素可能对于发现儿童性早熟或者预防性早熟是很有帮助的，尤其是可以作为一项敏感的指标在出现临床青春期表现之前发现激素变化[34,35]。FSH测定对于男性可以预测无精子症或者严重的少精子症，借此来判定性腺衰竭的程度。卵巢储备或者说卵巢内剩余的卵母细胞的总量随着卵巢年龄增长而减少，但是并不总是等于女性的年龄。血清FSH基础测定，通常是从月经周期的第3日开始，能很好的预测育龄期妇女卵巢储备。一组上下波动的FSH基线水平是卵巢功能的集中反映。如果将来能将血清雌二醇和抑制剂跟FSH的测定结合起来，这个基线将有更大的提示作用。在不规律的月经周期中，很难在原定的时间收集样品，因此必须在卵巢超声扫描下收集多个样本来确定周期的不同时相。测量FSH也有助于判定是否存在生殖系统的基础疾病如多囊卵巢综合征，表现为血清LH水平升高而FSH水平正常[9]。FSH和其他几种促性腺激素、LH是由垂体前叶分泌产生的，它是通过下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴来调节卵巢和睾丸的重要功能，包括雌性激素的产生和卵泡成熟及精子发生[36-38]。现在重组FSH（rFSH）是几种生殖系统疾病的主流药物。对于女性来说，下丘脑分泌的脉冲式GnRH维持了类似于垂体前叶脉冲式分泌的FSH和LH，促进了卵巢调节拉格夫卵泡和粒层细胞雌激素产生的激素性能和细胞活动。4.卵泡刺激素与疾病之间的关系4.1卵泡刺激素与精子生成Matsumoto等研究发现：FSH和LH19 治疗通过用睾酮诱导的促性腺激素，停止分泌抑制精子发生来提高精子的数目。通过一套现有的标准检测不育的精子超微结构和功能来评估FSH对男性生殖能力尤其是精子质量的疗效。这一套标准过去是用来验证精子超微结构和不同辅助生殖技术之间的关系，此套标准非常灵敏有效。把精子作为男科检测仪来体现FSH疗法的功效取决于精子缺陷类型。在很多临床病例中，FSH反应阳性，这个反应可以通过检测射出精子的状态来判断[39]。4.2卵泡刺激素与女性不孕女性通过服用纯化的FSH来刺激卵巢滤泡的发育和成熟，因此来提高不孕不育夫妇的受孕几率。过去只能通过绝经前妇女的尿液中纯化获取人FSH[40,41]。现在随着分子生物学方法技术的出现，可以通过克隆人FSH的共有α亚基和激素特异性的β亚基的基因来获得人rFSH[42-45]。正在接受放化疗的有生育需求的年轻女性常会采取卵巢移植的措施，FSH可通过促进移植后血管再生,防止移植的卵巢发生局部缺血损伤。4.3卵泡刺激素与女性骨质疏松症导致妇女绝经期后骨质疏松是人口老龄化社会中发病率和死亡率增高的主要原因[46]。通常，这种骨质流失仅仅因为雌激素水平下降。然而，最近研究发现垂体FSH的分泌是受到雌激素的反馈，直接促进破骨细胞形成和发挥作用。FSHβ亚基的缺失在发生严重性腺机能减退时保护骨质不受损[47]。许多研究发现围绝经期骨质流失的比率远高于绝经期[48,49]，然而围绝经期血清中雌激素水平正常[50]。因此，雌激素缺乏不能完全解释更年期后骨密度的下降。一项临床调查研究发现：FSH水平与绝经期妇女骨再吸收标志物显著相关[51]。有研究表明：雌鼠缺乏FSHβ或者FSHR会出现抵抗骨流失，尽管伴发生殖功能不良[47]。这些数据大大增加了FSH是独立于雌激素之外的妇女绝经后骨质疏松症的可能性。在体外，在破骨细胞中发现FSHR，FSH的单克隆或多克隆抗体抑制FSH诱导的破骨细胞形成，在某种程度上类似于FSHR敲除细胞[52]。FSH跟FSHR结合，抑制G蛋白的α亚基激活与细胞增殖相关的信号蛋白，最终刺激破骨细胞的形成和骨再吸收。FSH是一个骨流失的独立预测因素。在之前的研究中，无月经的病人的骨质量显著下降，而血中FSH水平上升。对全国妇女的研究（SWAN）表明血清FSH水平和骨流失有很强的相关性[53]。4.4卵泡刺激素与肿瘤最近有研究发现在许多不同时期的肿瘤的血管表面发现FSHR，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌和平滑肌肉瘤。在另一些肿瘤中，如肾上腺癌、甲状腺癌、神经内分泌肿瘤和软组织肉瘤中，发现肿瘤细胞中也有FSHR。尽管G19 蛋白偶联受体信号转导是生长因子调节细胞增殖的主要生化通路，但是FSH信号在肿瘤血管中的功能以及FSHR与瘤周血管形成的关系仍不清楚[54-58]。在大部分非肿瘤细胞中FSHR表达水平很低，而在恶性肿瘤组织微环境中表达水平较高，表明FSHR可能会是一个诊断和治疗的工具，它在恶性内皮细胞的表达水平可能对于疾病进展，尤其是对于肿瘤血管生成的靶向治疗有指示性意义。FSHR在恶性肿瘤发生过程中的作用，如促进血管生成和恶性肿瘤生长因子等亟待证实[14]。5.总结在过去三十年的研究中关于FSH及其受体结构、信号通路、功能、临床应用方面有了很多进展，但是仍有很多问题亟待解决。最近几年关于FSH的研究领域也不再局限于生殖系统，关于FSH与骨质疏松症、破骨细胞的形成的关系及机制，成了新的热点。还有一些关于FSH与肿瘤血管形成的关系的研究也在进行中。随着人们视野与实验水平的提高，会有对FSH这一复杂多样的激素性蛋白质有更深入的认识。参考文献1.JiangX,FischerD,ChenX,etal.Evidenceforfollicle-stimulatinghormonereceptorasafunctionaltrimer.JBiolChem,2014;289(20):14273-14282.2.Dias,J.A.Molecular,structural,andcellularbiologyoffollitropinandfollitropinreceptor.VitamHorm,2002;64:249-322.3.MayorgaM,GromollJ,BehreH,etal.Ovarianresponsetofollicle-stimulatinghormone(FSH)stimulationdependsontheFSHreceptorgenotype.JClinEndocrinolMetab,2000;85(9):3365-3369.4.ThemmenAPN,Huhtaniemi,IT.Mutationsofgonadotropinsandgonadotropinreceptors:elucidatingthephysiologyandpathophysiologyofpituitary-gonadalfunction.EndocrRev,2000;21:551-583.5.RyanRJ,CharlesworthMC,McCormickDJ,etal.Theglycoproteinhormones:recentstudiesofstructure-functionrelationships.FASEBJ,1988;2(11):2661-2669.6.ThemmenAPN,HuhtaniemiIT.Mutationsofgonadotropinsandgonadotropinreceptors:Elucidatingthephysiologyandpathophysiologyofpituitary-gonadalfunction.EndocrRev,2000;21:551-583.7.SzkudlinskiM.Newfrontieringlycoproteinhormonesandtheirreceptors19 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