牛源金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究

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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文牛源金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＲｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＳｔａｈｌｏｃｏｃｃｕｓＡｕｒｅｕｓｆｒｏｍＣｏｗｐｙ硕士研究生：赵吴静指导教师：蒲万霞申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州畜牧与兽药研究所研究生院２０１８年５月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文牛源金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究AntimicrobialResistanceandMolecularEpidemiologyoftheStaphylococcusAureusfromCow硕士研究生：赵吴静指导教师：蒲万霞申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州畜牧与兽药研究所研究生院2018年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationAntimicrobialResistanceandMolecularEpidemiologyoftheStaphylococcusAureusfromCowM.S.Candidate：ZhaoWujingSupervisor：ProfessorPuWanxiaDegree：MasterofVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMedicineMay2018 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。—研宄生签名：时间：年丄月攻日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留，即：、使用学位论文的规定中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名时间：：ｈｉ％年７＾０导师签名时间：年ｊｒ月日 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表‘论文题目牛源金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究不：区研究论文作者赵吴静专业兽医研究方向ＩｒＩ万￡￥冋丨：指；导教师蒲万霞培养单位（研究所）兰州畜牧与兽药研究所Ｉ姓名职称Ｉ硕（博）单位专业签名：－—评ｒ硕导口ｎ吴润教授？Ｂ农业大学预防兽医学甘肃ｒ７１ｆｃｉ？—＿阅＿ｉ硕导口＾振灵曾教授华农业础兽医南大学基学人｜肃省业賴甘义贺奋研究员＝Ｔ紐兽医学！生研刘永究员丽兽医学ｇｇ，口硕导ａ甘省学学研究生化学，肃医科物与ｉ＾７／＾ｒ口麟分子生物学＾ａ张勇农业学临兽医教授甘肃大床学．卜離當－ａ硕导口中国农业科学院兰州７ｒ々由苗ｒ＾、么丨丨？开九贝医子；作廷导Ｂ与博畜牧兽药研究所—，硕导口口博导；员」、５ｉ￥口导博；口导硕．导口博丨Ｌ（）议记录秘书周磊会２０１８５１，国业学院兰畜药研所地年６Ｒ中农科州牧与兽究答辩时间点月论文 摘要近年来，细菌耐药性已成为全球热议的话题，尤以金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）耐药菌株的出现，引起了全世界研究者的关注，它的出现使得人和动物的临床治疗愈来愈难，且造成了巨大的经济损失。目前，预防和治疗金黄色葡萄球菌感染较为有效的药物仍是抗生素，然而由于抗生素大量不合理的使用出现了愈来愈多的耐药菌及耐药基因，给临床的治疗带来了巨大的困扰和挑战。为了解我国部分地区乳源金黄色葡萄球菌的流行病学特点及其耐药现状和耐药基因携带情况，本研究对分离自广东省和甘肃省某规模化奶牛场奶样的81株金黄色葡萄球菌进行了药敏试验、耐药基因鉴定及分子特征研究。结果如下：金黄色葡萄球菌分离鉴定。对分离自广东省和甘肃省某规模化奶牛场临床乳房炎奶样中的细菌进行增菌纯化培养后，利用细菌16SrRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc及VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统对分离菌进行种属鉴定，共分离鉴定出81株金黄色葡萄球菌，其中广东省57株，甘肃省24株。对81株金黄色葡萄球菌进行了药物的药敏试验及耐药基因分析。通过测定MIC和药敏纸片试验发现81株金黄色葡萄球菌对14种抗生素的耐药率由高到低依次是：氟苯尼考（80.2%）、青霉素（66.7%）、环丙沙星（33.3%）、红霉素（32.1%）、卡那霉素（25.9%）、氨苄西林（25.9%）、克林霉素24.7%、头孢噻呋（6.2%）、苯唑西林（4.9％）、庆大霉素（2.5%）、头孢唑林（2.5%）、万古霉素（0）、四环素（0）、利奈唑胺（0）。其中对3种药物具有耐药性的菌株共有16株、对4种药物具有耐药性的菌株共有5株、对5种药物具有耐药性的菌株共有7株、对6种药物具有耐药性的菌株共有6株、对7种药物具有耐药性的菌株共有1株、对8种药物具有耐药性的菌株共有1株、对9种药物具有耐药性的菌株共有2株、对10种药物具有耐药性的菌株共有2株。菌株对抗菌药物呈多重耐药现象。14种耐药基因检测结果显示共有MRSA20株（24.7%），MSSA61株（75.3%）；检出率由高到低依次是：aac(6)/aph(2")（100%）、femA（100%）、ermB（100%）、vanB（100%）、tetM（100%）、floR（80.2%）、ermC（77.8%）、fexA（50.6%）、mecA（24.7%）、tetA（0）、tetC（0）、nor（0）、vanA（0）、vanC（0），所有菌株均携带了至少5种以上的耐药基因。对81株金黄色葡萄球菌进行了分子特征研究。对所有菌株采用spa及MLST方法进行分型，共发现14种ST型20种spa型；对20株MRSA进行SCCmec分型，分为5种SCCmec型，其中有4株MRSA菌株被鉴定为ST9-SCCmecIVb-t899型为相对优势型别，有9株MRSA菌株分别被鉴定为ST398-SCCmecI-t034、ST398-SCCmecIVc-t034、ST398-SCCmecV-t034、ST1-SCCmecI-t114、ST2632-SCCmecIII-t091、ST398-SCCmecIII-t8617、ST398-SCCmecIII-t034、ST692-SCCmecIII-t2247、ST188-SCCmecIII-t189型，另有7株SCCmecIII型MRSA未获得MLST及spa分型。结合上述MLST及spa分型结果发现MRSA的优势型别为ST9-t899，MSSA的优势型别为ST398-t034，广东省主要优势型别为ST9-t899，甘肃省主要优势型别为ST398-t034。且本研究中共检出PVL基因阳性菌株1株，携带率为1.2%，为MSSA，MLST及spa分型为ST1289-t16824，分离自甘肃地区。I 关键词：金黄色葡萄球菌，耐药性，MLST分型，spa分型，SCCmec分型II AbstractRecentlyyears,bacterialresistancehasbecomeahotlydebatedtopicintheworld.TheemergenceofresistantstrainsofStaphylococcusaureushasattractedtheattentionofresearchersaroundtheworld.Itsappearancehasledtotheclinicaltreatmentofhumansandanimals.Whichbecomingharderandharder,andithascausedhugeeconomiclosses.Atpresent,themosteffectivedrugsforthepreventionandtreatmentofdiseasescausedbyStaphylococcusaureusarestillantibiotics.However,duetotheunreasonableuseofantibiotics,moreandmoredrug-resistantbacteriasanddrugresistancegeneshaveemerged,givingclinicaltreatmentbelts.Agreatdealoftroublesandchallengeshaveappeared.InordertounderstandtheepidemiologicalcharacteristicsofStaphylococcusaureusinsomeareasofChinaanditsresistancestatusandthecarryingstatusofdrugresistancegenes,81strainsofstaphylococcusaureuswereisolatedandidentifiedfrommilksampleswhichisolatedfromsomelarge-scaledairyfarmsintheGuangdongandGansuprovinceofChina,andwehavedonethedrugsensitivitytest,drugresistancegeneidentificationandgenotypingtest.serialresultswerecarriedoutinthispaper：ToisolateandidentifiyofStaphylococcusaureus.afterenrichment,purificationandcultureofthebacteriasinthemilksampleswhichseparatedfromsomelarge-scaledairyfarmsinthesGuangdongandGansuprovince,weusethecommon16SrRNAprimersofthebacteriasandthespecificgenesofStaphylococcusaureusheat-resistantnucleasegenenucandVITEK-2-COMPACT15automatedmicrobialidentificationsystemforspeciesidentificationofisolates.Theresultsshowedthat81strainsofStaphylococcusaureuswereisolated,amongwhich57strainswereisolatedfromthesouthand24fromthenorth.Among81strainsofStaphylococcusaureus,MICsusceptibilitytestandsusceptibilitytestrevealedthatMRSAcontained20strains(24.7%)andMSSAcontained61strains(75.3%).Theresistanceratestotheremainingantibioticsfromhightolowwere:florfenicol(80.2%),penicillin(66.7%),ciprofloxacin(33.3%),erythromycin(32.1%),kanamycin(25.9%),ampicillin(25.9%),clindamycin24.7%,ceftiofur(6.2%),oxacillin(4.9%),gentamicin(2.5%),cefazolin(2.5%),vancomycin(0),tetracycline(0),linezolid(0).Andtherewere16strainsresistantto3drugs,5strainsresistantto4drugs,7strainresistantto5drugs,andtherewere6strainsresistantto6drugs,1strainresistantto7drugs,1strainresistantto8drugs,2strainresistantto9drugs,andtherewere2strainsresistantto10drugs.Thedetectionrateofdrugresistancegenesfromhightolowwas:aac(6)/aph(2")(100%),femA(100%),ermB(100%),vanB(100%),tetM(100%)),floR(80.2%),ermC(77.8%),fexA(50.6%),mecA(24.7%),tetA(0),tetC(0),nor(0),vanA(0),vanC(0).Itwasfoundthattheywerealldemonstratedatleast5kindsofdrugresistancegenes,andthepositiverateofdrugresistancegenesishigh.Thedrugsusceptibilitytestanddrugresistancegeneanalysiswereperformedon81strainsofStaphylococcusaureus.AllofStaphylococcusaureuswereclassifiedbyspaandMLSTtypingtechniques.20strainsofMRSAwereclassifiedbySCCmec.Atotalof14STtypes,20spatypesand5SCCmectypeswerefound.Amongthem,4strainsofMRSAstrainswereidentifiedasST9-SCCmecIII IVb-t899strains,whichwererelativelydominanttypes,and9strainsofMRSAstrainswereidentifiedasST398-SCCmecI-t034,ST398-SCCmecIVc-t034,ST398-SCCmecV-t034,respectively.ST1-SCCmecI-t114,ST2632-SCCmecIII-t091,ST398-SCCmecIII-t8617,ST398-SCCmecIII-t034,ST692-SCCmecIII-t2247,ST188-SCCmecIII-t189,and7SCCmectypeIIIMRSAdidnotreceiveMLSTandspapointstypesarepresumedtobenoveltypes,andtheabovetypesaremoredispersed,whichmaybeduetotheincreasingabuseofantibioticsresultinginincreasedresistancetoStaphylococcusaureus.CombinedwiththeaboveMLSTandspaclassificationresults,thedominanttypeofMRSAwasfoundtobeST9-t899,andthedominanttypeofMSSAwasST398-t034;thedominanttypeofGuangdongwasST9-t899,thedominanttypeofGansuwasST398-t034.Atotalof1PVLgene-positivestrainwasdetectedinthisstudy,andthecarrierratewas1.2%.MSSA,MLST,andspatypewereST1289-t16824,whichwereisolatedfromGansu.Anintensiveresearchwasdonefortheepidemiologicalcharacteristics,drugresistance,thestatusofcarryingdrugresistancegenesandgenotypingofStaphylococcusaureus,whichhasanimportantguidingsignificancefortherationaluseofantibioticsinthefuture.Keywords:Staphylococcusaureus,Drugresistance,MLSTtyping,Spatyping,SCCmectypingIV 目录第一章引言.............................................................................................................11.1金黄色葡萄球菌概述.........................................................................................11.1.1金黄色葡萄球菌生物学特征.......................................................................11.1.2金黄色葡萄球菌分离鉴定方法...................................................................11.1.3耐甲氧西林金黄色葡萄球菌.......................................................................21.2金黄色葡萄球菌耐药机制.................................................................................31.2.1金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制...................................31.2.2金黄色葡萄球菌对大环内酯、林可胺类及链霉菌素B类耐药..............41.2.3金黄色葡萄球菌对喹诺酮类抗生素的耐药...............................................41.2.4金黄色葡萄球菌对四环素类耐药...............................................................41.2.5金黄色葡萄球菌对磺胺类药物耐药...........................................................51.2.6金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素的耐药...........................................51.2.7金黄色葡萄球菌对糖肽类抗生素的耐药...................................................51.2.8金黄色葡萄球菌对氯霉素类抗生素的耐药...............................................51.3金黄色葡萄球菌分型研究进展.........................................................................61.3.1多位点序列分型...........................................................................................61.3.2金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型..........................................61.3.3脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）.................................................................61.3.4SCCmec基因分型研究.................................................................................7第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定........................................................................82.1材料.....................................................................................................................82.1.1样品...............................................................................................................82.1.2主要仪器.......................................................................................................82.1.3主要试剂.......................................................................................................82.2方法.....................................................................................................................92.2.1菌株的分离...................................................................................................92.2.2菌株鉴定.......................................................................................................9V 2.3结果...................................................................................................................112.4讨论....................................................................................................................12第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析.............................143.1材料...................................................................................................................143.1.1样品采样.....................................................................................................143.1.2主要仪器.....................................................................................................143.1.3主要试剂......................................................................................................143.2方法....................................................................................................................153.2.1药敏试验.....................................................................................................153.2.2药液配制.....................................................................................................153.2.3菌液的制备.................................................................................................153.2.4最小抑菌浓度（MIC）测定.....................................................................153.2.5药敏纸片法.................................................................................................163.2.6部分耐药基因检测......................................................................................163.3结果...................................................................................................................173.3.1药敏试验结果.............................................................................................173.3.2部分耐药基因检测.....................................................................................183.3.3MRSA耐药性及耐药基因阳性率比较.....................................................183.3.4广东和甘肃地区分离菌株耐药性及耐药基因阳性率比较.....................193.4讨论...................................................................................................................21第四章金黄色葡萄球菌的分子特征......................................................................254.1试验材料...........................................................................................................254.1.1菌株.............................................................................................................254.1.2主要仪器......................................................................................................254.1.3主要试剂......................................................................................................254.2试验方法...........................................................................................................264.2.1基因组提取.................................................................................................264.2.2SCCmec分型..............................................................................................26VI 4.2.3MLST分型..................................................................................................274.2.4spa分型.......................................................................................................304.2.5PVL毒力基因检测.....................................................................................324.3分型结果...........................................................................................................334.3.1SCCmec分型结果.......................................................................................334.3.2MLST分型结果..........................................................................................344.3.3spa分型结果...............................................................................................354.3.4SCCmec、spa及ST型之间的相关性.......................................................364.3.5PVL基因检测结果.....................................................................................374.4讨论...................................................................................................................37第五章全文结论........................................................................................................40参考文献......................................................................................................................41致谢..........................................................................................................................49作者简历......................................................................................................................50VII 表目录表2.1本章实验所需主要仪器设备.............................................................................8表2.2本章实验所需主要试剂.....................................................................................8表2.3鉴定金黄色葡萄球菌PCR引物.....................................................................10表2.425μLPCR反应体系.........................................................................................10表2.5鉴定金黄色葡萄球菌PCR引物.....................................................................10表2.625μLPCR反应体系.........................................................................................11表2.7金黄色葡萄球菌分离率...................................................................................12表3.1本章实验所需主要仪器设备...........................................................................14表3.2本章实验所需主要试剂...................................................................................15表3.3各种耐药基因引物序列...................................................................................16表3.4抗菌药物对81株金黄色葡萄球菌药物敏感性试验结果.............................18表3.5MRSA与MSSA耐药情况比较.......................................................................19表3.6部分耐药基因检测结果表...............................................................................19表3.7不同地区耐药情况比较...................................................................................20表3.8不同地区对应菌株耐药基因阳性率比较.......................................................21表4.1本章实验所需主要仪器设备...........................................................................25表4.2本章实验所需主要试剂...................................................................................25表4.3SCCmec分型引物序列及目的片段大小.........................................................26表4.425μLPCR反应体系.........................................................................................27表4.5spa分型引物序列及目的片段大小.................................................................27表4.625μLPCR反应体系.........................................................................................28表4.7spa分型引物序列及目的片段大小.................................................................31表4.825μLPCR反应体系.........................................................................................31表4.9PVL分型引物序列及目的片段大小...............................................................32表4.1025μL体系组分...............................................................................................32表4.11MRSA的SCCmec类型.................................................................................33VIII 表4.12耐药谱相同金黄色葡萄球菌SCCmec分型情况.......................................33表4.13金黄色葡萄球菌MLST分型........................................................................35表4.14金黄色葡萄球菌spa分型.............................................................................36IX 图目录图2.1部分葡萄球菌16SrRNA的PCR扩增...........................................................12图2.2部分金黄色葡萄球菌特异性基因nuc的PCR扩增.....................................12图4.1管家基因PCR扩增.........................................................................................35图4.2PVL基因PCR扩增..........................................................................................37X 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AMEAminoglycosides-modifyingenzyme产生药物修饰酶ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbnentAssay酶联接免疫吸附LAMPLoop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增MRSAMethicillin-resistantStaphylococcusaureus耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MLSTMuhilocussequencetyping多位点序列分型SAStaphylococcusaureus金黄色葡萄球菌SpaStaphylococcusaureusProteinA金黄色葡萄球菌表面蛋白AVRSAVancomycinresistantStaphylococcusaureus万古霉素高度耐药金黄色葡萄球菌VISAVancomycinintermediateStaphylococcusaureus万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌XI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1金黄色葡萄球菌概述1.1.1金黄色葡萄球菌生物学特征金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一种细胞壁由90%肽聚糖和10%磷壁酸组成的革兰氏阳性菌。进行结晶紫染色时因其具有结构紧密的网状肽聚糖而不易被酒精脱色从而呈现紫色。典型金葡菌呈球型、葡萄串状，无鞭毛和芽胞，大部分无荚膜，直径约0.8μm；具有较广范围的温度耐受性，可于70°C高温条件下存活约1h，亦可在冷冻食品中存活，但37°C为其最适生长温度；具有耐高盐特性，可生存于含10~15%NaCl琼脂板和肉汤；无特定营养要求，可良好生长于普通培养基，菌落圆润较厚且凸起有光泽；血平板上菌落呈金黄色或白色，菌落周围形成透明溶血环；需氧或兼性厌氧型，pH为7.4。1.1.2金黄色葡萄球菌分离鉴定方法金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶、溶血毒素、肠毒素和耐热核酸酶等毒素是引起慢性、急性和亚临床性乳房炎的重要因素；亦可引起化脓性感染等疾病及食物中毒，具有很强的致病性，其危害性和分离率不断上升(高攀，2013；杨岚等，2015；Botaroetal,2015；王明月等，2016；赵吴静等，2017；岑静等，2017)。美国疾控中心研究表明由其引起的感染仅次于大肠杆菌，占第二位(向红等，2015；高朋等，2017)。金葡菌引发的食源性疾病在我国食品安全事件中占的比重相当大，已成为食品安全问题的重要隐患(高涛，2003)。加快金葡菌检测技术研究对于减少由其引发的食源性疾病和各类感染具有重要意义。1.1.2.1传统检测法传统检测方法主要包括显色培养基法、Baird-Parker平板计数法和快速测试片法。其中平板法虽然成本较低，操作简单，但易在操作过程中污染的几率较大且耗时，一般需要4~5天，且该方法灵敏度不高；显色培养基法虽然不需要增菌，但在检测混合感染的微生物时，有报道指出某些非金黄色葡萄球菌也能在某些显色培养基中生长，容易形成假阳性；快速测试片虽然经济，操作简便快捷，但当菌体含量较多时不易计数。因此，可将传统检测方法与其它鉴定方法结合使用以提高准确度。1.1.2.2免疫学检测法免疫学方法指酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay），简称ELISA。传统ELISA检测方法在食品致病微生物检测应用广泛，具有操作快速、简便等特点，但其灵敏度、特异性较差(胡金强等，2014)。杨天骄等(2009)建立了一种ELISA检测方法，其敏感性和特异性方面均优于试管凝集试验。李丹等(2011)利用矩阵法摸索抗原量及其它条件的影响，建立了一种1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言酶联免疫吸附试验(ELISA)方法用于免疫后卵黄抗体水平监测，与试管凝集法敏感性对比显示通过本试验建立方法具有更好敏感性。1.1.2.3聚合酶链式反应（PCR）检测法1985年，Mullis等建立了一种快速扩增目的基因的技术-聚合酶链式反应。体外DNA片段在95°C温度条件下变为单链，60°C左右温度条件下将单链与引物互补配对结合，后约72°C条件下合成互补链，即分为变性(Denature)、退火(Annealing)和延伸(Extension)三个步骤。该技术操作简单、灵敏度高、特异性强。Ahmadi等(2010)用具有金黄色葡萄球菌特异性的基因coa作引物进行PCR扩增，结果表明PCR技术具有特异性高，敏感性好的特点。郑华妮(2009)等通过检测产肠毒素A、E菌株的不同，证明了该检测方法方便快捷、特异性强、敏感性高等优点，可应用于对肠毒素监测及临床诊断。1.1.2.4环介导等温扩增反应环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)反应技术是Notomi等(2000)开发的一种全新核酸扩增方法。该技术根据靶基因不同区域设计引物，恒温下可15-60min扩增109-1010倍。可通过观察是否出现大量白色沉淀（焦磷酸镁）判断是否存在靶基因。该方法的特点除了高度的特异性和灵敏性外，其操作简便快捷，高效(Gotoetal,2007；Wangetal,2009)。Sheet等(2016)采用LAMP技术金鉴定黄色葡萄球菌，结果显示其牛奶中最低检测限为9×102cfu/mL，且操作简单快捷、耗时短、特异性强、检出率高。LI等(2010)针对femA基因设计特异性识别引物鉴定金葡菌，结果表明最低检测限8-9cfu/mL。唐梦君等(2016)以PCR和LAMP方法鉴定金黄色葡萄球菌以比较其灵敏性，结果显示LAMP方法简便、快捷且灵敏度较高。1.1.2.5核酸探针技术核酸探针技术即带有识别标记物的已知核酸片段和能与之进行互补配对的核酸序列进行杂交，可用于待测样品中特定基因序列检测。该技术具有高敏感性和高特异性，但操作相对较复杂、成本略高、耗时略长，多用于实验室深入研究，尚未能在动物检疫工作中推广。陈彬等(2007)深入研究了基因探针方法在检测金葡菌应用中的准确性、特异性和敏感问题，并与传统国标法进行对比。结果显示，二者准确度相同但基因探针方法试验周期大幅缩短且特异性更强。Freney等(1993)对核酸探针技术和传统方法在金葡菌鉴定方面进行了对比，结果表明，核酸探针技术检出率高且特异性强，能鉴定传统方法无法鉴定金黄色葡萄球菌菌株。1.1.3耐甲氧西林金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种临床常见的革兰氏阳性致病菌，能引起蜂窝织炎、伪膜性肠炎、气管炎、伤口化脓及败血症、脓毒血症等全身性感染及食物中毒。金黄色葡萄球菌广泛的存在于自然界，无论水、土壤、空气或是动物的排泄物均可检测到该菌的存在。发明于1928年的青霉素在20世纪40年代初首次应用于临床治疗金黄色葡萄球菌等引起的感染(衷旺，2011)。1944年2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Kirby(1944)首次发现了产青霉素酶的金黄色葡萄球菌,其耐药问题随之出现。1959年，耐青霉素酶半合成青霉素-甲氧西林开始投入使用，其有效降低了耐青霉素金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁(李冬等，2008)。第一例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)于1961年被Jevons发现，至20世纪60年代中期已扩散至加拿大及许多欧洲国家(Deresinski,2005)，而后几年中MRSA检出率在1%左右。MRSA是指携带mecA基因或苯唑西林MIC值>2mg/L的金黄色葡萄球菌。20世纪70年代末后期MRSA感染遍及全球，且其耐药程度日趋严重，在此期间欧洲MRSA约占金黄色葡萄球菌感染的8.5%～20.0%。20世纪80年代后期MRSA成为全球性的病原菌，居医院感染病原菌的首位，占教学医院分离金黄色葡萄球菌的60%～80%(张静，2008)。在美国，MRSA感染与HIV/ADIS、病毒性肝炎和结核对人类健康具有同样严重的危害性，每年可导致约19000人医院内死亡，是导致人类死亡的重要感染性疾病(Boucheretal,2008)。目前，MRSA是超级细菌的重要组成部分(邢浩莉等，2014)。1.2金黄色葡萄球菌耐药机制1.2.1金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有以下两种，A：菌株合成了β-内酰胺酶，降低或消除此类抗生素的活性；B：与药物结合靶位点有所改变或形成了新的PBP结合蛋白(黄支密等，2005)。其中PBP结合蛋白的改变则是金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制(Lindsayetal,2010)。青霉素结合蛋白（PBP）是合成金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖的重要蛋白酶系统，是β-内酰胺类抗生素的作用靶位点。当环境药物浓度达到最低抑菌浓度时，β-内酰胺类抗生素会与PBPs上的靶位点结合，使其乙酰化，致使转肽酶TPase的活性丧失，导致细菌细胞壁无法形成从而杀死敏感菌。金黄色葡萄球菌的mecA基因是通过转座机制得到的外来基因，该基因大量表达可产生一种特别的青霉素结合蛋白PBP2a，该蛋白与β-内酰胺类抗生素亲和力极低甚至不与β-内酰胺类抗生素结合，从而产生耐药性。当有β-内酰胺类抗菌药物存在时，虽然PBP2的活性被β-内酰胺类抗生素所抑制，但PBP2a的存在能使细菌的细胞壁继续合成，从而使细菌表现出耐药性。经研究，在某些金黄色葡萄球菌的mecA基因上游区有一转录方向与mecA相反的调节子mecRⅠ和抑制子mecⅠ(Boyce,1989；Kobayashietal,1996)。mecⅠ能编码产生mecⅠ蛋白；mecRⅠ基因负责编码产生mecRⅠ蛋白。当β-内酰胺类抗生素存在时，mecRⅠ蛋白与诱导剂结合后被活化，活化了的mecRⅠ蛋白能消除抑制子mecⅠ对mecA基因的抑制作用，使得mecA转录表达产生了PBP2a蛋白(杜娜，2007)。完整的mecRⅠ抑制mecA的表达，呈负向调节(Higashietal,1999)。携带mecRⅠ和mecⅠ基因的MRSA具有缓慢诱导的极低水平的苯唑西林耐药性。尽管有此调节因子存在，许多高度耐药菌株仍出现多种基因突变或缺失，从而使mecⅠ基因失活。有些菌株mecⅠ基因甚至完全缺失，直至mecRⅠ的多重基因缺失(Falketal,1999；Krausetal,2001)。在一些MRSA中，即使mecⅠ完整，但也存在mecA操纵子区突变。除了mecA主要结构基因外，金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药水平的高低受到染色体上辅助基因的调控,现已研究的辅助3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言基因femA、B、C、D、E和F及agr、sar等均是与合成细菌细胞壁有关的功能性基因(黄辉等，2009；许顺姬等，2013)。1.2.2金黄色葡萄球菌对大环内酯、林可胺类及链霉菌素B类耐药大环内酯、林可胺类及链霉菌素B（MLSB）是化学结构不同但抗菌和耐药机制却相似的三类抗生素(丁兆凤，2010)。其广泛应用于治疗葡萄球菌引发感染且耐药日趋严重(Linaetal,1999；Drinkovicetal,2001；Limetal,2002)。S.A对该类药物耐药机制主要分两种，A：改变或修饰作用靶位。由erm基因介导甲基化药物作用靶点，降低与核糖体亲和力，导致诱导型(iMLSB)或结构型(cMLSB)耐药(Fiebelkornetal,2003；Fiebelkornetal,2003；O'Sullivanetal,2006)；B：增强外排机制。该机制主要由msr基因介导，当抗生素在外排泵蛋白作用下泵出速度快时，胞内抗生素浓度下降，使抗生素对蛋白合成影响降低，细菌得以存活。对大环内酯和链霉菌素B耐药金葡菌主要含msrA和msrB基因(Leclercq,2002)，使金葡菌对大环内酯类和林可胺类抗生素耐药的甲基化酶主要由ermA和ermC基因编码(Dietal,2002)。在对MLSB耐药的金葡菌中以ermA基因编码为主，其次是ermC(Limetal,2002)。另有研究表明，iMLSB型耐药金葡菌中以ermC基因为主(Spiliopoulouetal,2004)。1.2.3金黄色葡萄球菌对喹诺酮类抗生素的耐药喹诺酮作近年来被广泛应用于临床，其耐药日益严重。喹诺酮类药物阻碍细菌拓扑异构酶IV（grlA和grlB基因编码）和DNA促旋酶(由gyrA和gyrB基因编码)催化，抑制遗传物质复制和转录以杀菌。金葡菌对其耐药机制主要为两种，A：改变耐药决定区（QRDR）作用靶位。DNA促旋酶和拓扑异构酶IV二者均为A2B2四聚体结构(Chengetal,2007)。因靶酶基因位点突变而引起空间结构变异，从而降低菌体和药物的亲和力，最终导致金葡菌产生耐药性(Baetal,2006)；B：主动外排机制。外排机制主要涉及三个基因NorA、NorB和NorC(Kaatzetal,2005)。当NorA过量表达时，药物及其他不相关化合物将被排出胞外。NorA蛋白偏嗜亲水性药物，其对亲水性药物最小抑菌浓度高于疏水性药物(Demarcoetal,2007)。当NorB和NorC过表达时，均可使菌体对喹诺酮类产生耐药(Truong-Bolducetal,2005；Truong-Bolducetal,2006)。1.2.4金黄色葡萄球菌对四环素类耐药四环素类主要通过阻碍菌体蛋白合成起到抗菌作用(陆佳等，2010)。金葡菌对四环素类抗生素耐药主要为两种，A：主动外排机制。外排基因tet(L)和tet(K)合成的蛋白可泵出四环素-阳离子复合物，降低胞内抗生素的浓度但不影响菌体蛋白质合成，最终达到耐药；B：核糖体保护机制。该机制是由位于染色体或转座子上的tet(O)和tet(M)基因编码能与细菌核糖体结合的保护蛋白，从而保护细菌蛋白质合成，使其不受周围药物环境的影响，最终使细菌对四环素类药物产生耐药(Ardicetal,2005)。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2.5金黄色葡萄球菌对磺胺类药物耐药磺胺类抗生素在养殖场中应用广泛导致细菌耐药性日趋严重。细菌不能直接利用环境中叶酸，只能用菌体内二氢叶酸合成酶与环境中对氨苯甲酸和二氢喋啶等合成二氢叶酸，在还原酶作用下合成核酸前体物四氢叶酸(胡青平等，2006)，最终合成核酸。而核酸在细菌繁殖过程中必不可少。磺胺类抗生素与对氨苯甲酸具有相似的化学结构，亦能与二氢叶酸合成酶结合，在同等酶量条件下，其可与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，导致二氢叶酸量减少，进而影响四氢叶酸生成，影响菌体繁殖和再生。推测磺胺类药物只有抑菌作用而无杀菌作用，最后通过机体本身防御系统消灭病原菌。1.2.6金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素的耐药氨基糖苷类抗生素是一类作用于金葡菌和需氧革兰阴性杆菌，可与β-内酰胺类有协同作用得广谱抗生素。金葡菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制分两个方面，A：产生药物修饰酶(aminoglycosides-modifyingenzyme,AME)。该机制为主要耐药机制，即药物修饰酶对进入胞体的抗菌药物进行修饰，从而减弱或丧失药物活性而形成耐药；B：改变药物作用靶位点，使药物与菌体亲和力下降产生耐药。不同的氨基糖苷类药物间有着不完全交叉耐药的现象，即一种或多种药物修饰酶可对同一种氨基糖苷类药物进行修饰，而同一种药物修饰酶也可对多种氨基糖苷类抗生素起钝化作用(Fluitetal,2001)。目前，发现了30多种药物修饰酶,其中ANT(4′)-I酶、APH(3′)-Ⅲ酶和AAC(6′)-APH(2″)双功能酶在金葡菌对氨基糖苷类抗生素的耐药中起着重要作用(茆海丰等，2006)。1.2.7金黄色葡萄球菌对糖肽类抗生素的耐药糖肽类抗生素主要作用于细菌细胞壁，其结合靶位点为细胞壁前体D-丙氨酞-D-丙氨酸。该类抗生素与结合靶位点结合后在细胞表面形成复合物，进而抑制合成肽聚糖的相关酶活性，致使无法合成细菌细胞壁，从而产生杀菌作用。1996年，日本首次出现万古霉素中介金葡菌（VISA）(黄山等，2006)；后于2002和2004年出现万古霉素高度耐药金葡菌（VRSA）(董泽欣等，2012)；此后，耐万古霉素金葡菌耐药株分离率不断升高引起了国际医学界高度重视。金黄色葡萄球菌对万古霉素产生耐药的主要因素是细胞壁增厚(董鹏霞等，2014)。细胞壁增厚使万古霉素无法接触合成肽聚糖的活性部位，使其无法抑制菌体细胞壁合成而无法起杀灭作用。1.2.8金黄色葡萄球菌对氯霉素类抗生素的耐药氯霉素是一种广谱抗生素，其通过与蛋白合成的主要成分50S亚基可逆结合，切断转肽酰酶使新肽链形成受阻，从而抑制蛋白质合成。有研究表明，cmlA和cat1基因与细菌对氯霉素和甲砜霉素的耐药机制有关，而flor基因可能在氟苯尼考、氯霉素的耐药机制中起着一定的作用(羊云飞，2004)。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.3金黄色葡萄球菌分型研究进展金黄色葡萄球菌分型分两大类，A：表型分型。包括血清学分型、抗生素分型、荚膜分型、耐药普分型等，具有操作简单、成本低，但分辨率较低、稳定性较差等特点(倪春霞等，2009)；B：基因分型。基因分型是基于细菌DNA序列结构的分子分型，具有分辨率高和稳定性好的特点，而且能够较好的体现菌株的传播机制和流行特点。随着分子生物学迅速发展，该分型方法得到广大学者的青睐。基因分型主要包括多位点序列分型（muhilocussequencetyping，MLST），金黄色葡萄球菌表面蛋白A（StaphylococcusaureusProteinA，Spa）基因多态性分型和脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）。1.3.1多位点序列分型1998年，Maiden等(1998)首次将MLST（muhilocussequencetyping，MLST）分型法用于脑膜炎奈瑟菌，因其结果精确且重复性好而被广泛应用于对各类致病菌分型的分析。MLST是一种把成熟的群体遗传学与高通量测序技术相结合以对核苷酸序列分析为基础的分型方法，该方法可用于病原菌来源追踪，了解不同地区病原菌亲缘关系，反映病原菌宏观群体进化过程。2000年，Enright等建立了针对金黄色葡萄球菌的7个高度保守的持家基因arc(Carbamatekinase，氨基甲酸激酶)、aro(Shikimatedehydrogenase莽草酸脱氢酶)、glp(Glycerolkinase甘油激酶)、gmk[Guanylatekinase鸟(嘌呤核)苷酸激酶]、pta(Phosphateacetyltransferase转移酶)、tpi(Triosephosphateisomerase磷酸丙糖异构酶)及yqi(AcetylecoenzymeAacetyltransferase乙酰辅酶aacetyl转移酶)进行测序分型(http://saureus.mlst.net/misc/info.asp)的MLST方法，并构建了相应的数据库，用于金黄色葡萄球菌的分型鉴定和流行病学调査。1.3.2金黄色葡萄球菌表面蛋白A基因多态性分型金黄色葡萄球菌表面蛋白A（StaphylococcusaureusProteinA，Spa）基因多态性分型于1987年被Pickenhahn等首次用于金黄色葡萄球菌，是一种对葡萄球菌A蛋白基因的X区重复序列多态性进行分析的一种方法。该方法具有操作简便快捷、高分辨率、易重复但工作量大等特点，被广泛的应用于金黄色葡萄球菌的分型鉴定和流行病学调查研究。1.3.3脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）具有特异性好，分辨率高等优点，被公认为金黄色葡萄球菌分型的“金标准”，被Schwartz和Cantor创立于1984年，用于对菌株全基因组DNA分型(Schwartzetal,1984)。该方法是对金黄色葡萄球菌特别是MRSA暴发流行特点进行监测的极为有效的方法之一，能较好体现受试菌的流行病学相关性，也可用来确定不同致病菌之间的亲缘关系，从而对疾病流行和爆发过程中的追踪溯源提供依据(周臣清，2014)。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.3.4SCCmec基因分型研究MRSA耐药形成的主要机制是通过转座机制得到的外来基因mecA。1998年，Ito等(1998)研究发现mecA位于葡萄球菌染色体基因盒mec（SCC-mec）上。mecA能编码一种特殊的青霉素结合蛋白2a（PBP2a），对大多数β-内酰胺抗生素表现出非常低的亲和力从而产生耐药。SCCmec主要由3个基本元件构成：A：mec基因复合体；B：ccr基因复合体；C：J区。目前，mec基因复合体可被分为A、B、C、D和E五种类型，其中A型和B型最为常见(Katayamaetal,2001)。MRSA产生不同程度的耐药主要是该复合体中存在mecA基因及对该基因起调控作用的mecR和mecI基因。当β-内酰胺类抗生素存在时，mecR蛋白与诱导剂结合后被活化，活化了的mecR蛋白能消除抑制子mecI对mecA基因的抑制作用，使得mecA转录表达产生了PBP2a蛋白，而PBP2a蛋白可代替活性被β-内酰胺类抗生素所抑制的PBP2，继续合成菌体细胞壁，从而使细菌表现出耐药性。ccr基因复合体主要参与SCCmec的移动及往染色体上的整合过程。J区主要含有一些耐药基因。目前，根据mec基因复合体和ccr基因复合体组成的不同，在MRSA中已发现5种SCCmec基因型，常见的是SCCmecI、II、III和IV型。SCCmecⅠ型由B类mec基因复合体和ccr1型基因复合体组成。SCCmecⅡ型由A类mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。SCCmecIII由ccr3型基因复合体和A类mec复合体组成，SCCmecⅣ型由B类mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成，而V型SCCmec包含ccrC和C类mec基因复合体(Itoetal,2001；Itoetal,2004)。MDJansen等(2009)对型别为ST398的一些MRSA进行了SCCmec分型，研究结果显示，在这些型别为ST398的一些MRSA为SCCmecV型，而并非SCCmecIII型。7 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定乳房炎是奶牛养殖中的的高发且易反复病症之一，对奶牛生长发育以及奶制品质量和产量有较大的影响，甚至可能会使奶牛丧失生产性能而造成巨大损失。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是引起乳房炎的主要致病菌之一，其传播快、难预防且易产生耐药性，加大了乳房炎的治疗难度。对病原菌及时快速分离鉴定对于其用药治疗具有重要意义。通过对金黄色葡萄球菌的分离鉴定，可以了解金葡菌的分布情况，为金黄色葡萄球菌流行性病学研究、传播机制分析和疫苗的研制奠定基础。2.1材料2.1.1样品实验所用临床样品来自从广东省某规模化奶牛养殖厂中患病奶牛中采集的300份奶样和甘肃省某规模化奶牛养殖厂的患病奶牛中采集的170份奶样；金黄色葡萄球菌ATCC25923、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300均为实验室保存菌株。2.1.2主要仪器表2.1本章实验所需主要仪器设备Table2.1Allequipmentsandapparatusesusedinthissection仪器名称生产厂家PCR扩增仪AppliedBiosystems公司DYY-8C型高压电泳仪北京六一仪器厂DYCP-31ND型电泳槽北京六一仪器厂超纯水仪AFZ-0502-U重庆阳企业发展有限公司BS-2F数显震荡培养箱金坛市华城开元实验仪器厂VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统生物梅里埃公司高温高压灭菌锅申安医疗器械（上海）GelDocTMXR紫外凝胶成像系统美国Bio-Rad移液器德国Eppendorf公司Gentrifuge5804R台式高速离心机德国Eppendorf公司VORTEX5型漩涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司电热恒温水浴锅常州翔天实验仪器厂2.1.3主要试剂表2.2本章实验所需主要试剂Table2.2Allreagentsandsolutionsusedinthissection试剂名称生产厂家DNALadderMarkerTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司蛋白酶KTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司8 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定表2.2本章实验所需主要试剂（续）Table2.2Allreagentsandsolutionsusedinthissection溶菌酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司PremixEXTaq酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司细菌DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖HBBI公司5×TAE电泳缓冲液生工生物工程（上海）有限公司溴化乙锭生工生物工程（上海）有限公司Mueller-Hinton(MH)肉汤培养OxoidMueller-Hinton(MH)琼脂培养基OxoidLB液体培养基Oxoid2.2方法2.2.1菌株的分离将采集的奶样10000r/min离心5min，去上清液，用无菌生理盐水稀释留于管底的沉淀物，混匀后取200μL该混悬液加入5mL的LB液体培养基，于37℃培养24h；后用一次性接种棒分别沾取培养液均匀涂布于血琼脂平板，37℃过夜培养。挑取大而凸起、表面光滑、呈金黄或白色、周围有透明溶血圈的菌落进行革兰氏染色、镜检，选择球菌进行纯培养。2.2.2菌株鉴定利用细菌16SrRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc及VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统进行种属鉴定。2.2.2.1DNA提取无菌条件下，挑取纯培养单菌落于LB液体培养基中，37℃孵育20-24h。按天根全细菌基因组提取试剂盒的操作提取细菌基因组DNA：取2mL培养液，高速离心后去上清；后向沉淀中加入配置好的溶菌酶对细菌进行破壁处理；然后再加入蛋白酶K出去菌体蛋白将菌体裂解使其DNA表露出来；接着向菌体中加入缓冲液GB使菌体裂解更彻底；随后向菌体中分别加入无水乙醇、缓冲液GD（加有无水乙醇）、漂洗液PW（加有无水乙醇）并高速离心后去上清，对菌体DNA进行抽提、纯化；最后向沉淀中加入缓冲洗脱液TE，离心后将收集液置于离心管中，放冰箱-40℃冷冻保存，备用。2.2.2.216sRNA的鉴定2.2.2.2.116SrRNA及引物序列信息如表1所示：9 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定表2.3鉴定金黄色葡萄球菌PCR引物Table2.3PrimersforPCRidentificationofStaphylococcusaureus引物名称引物序列(5′→3′)F：GGTTACCTTGTTACCACTT16SR：AGAGTTTGATCCTGGCTCA2.2.2.2.2PCR扩增体系为25μL表2.425μLPCR反应体系Table2.425μLReactionsystemofPCRamplificationPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）1μLDNA模版2μL灭菌超纯水8.5μL2.2.2.2.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3058℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。2.2.2.2.4PCR产物序列分析将扩增后PCR产物送华大基因科技有限公司测序，后将测序结果通过NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）中blast软件对序列进行比对，进一步确定菌株种属。2.2.2.3金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc鉴定由金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因（nuc）编码的耐热核酸酶(Thermostablenuclease,Thermonuclease[TNase])，为金黄色葡萄球菌所特有，且在不同菌株之间具有较高的保守性。用nuc特异性引物通过PCR技术是鉴定金黄色葡萄球菌的快速、敏感、特异、可靠的检测手段。2.2.2.3.1金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc引物序列信息如表2所示：表2.5鉴定金黄色葡萄球菌PCR引物Table2.5PrimersforPCRidentificationofStaphylococcusaureus引物名称引物序列(5′→3′)F：CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACnucR：AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT10 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定2.2.2.3.2PCR扩增体系为25μL表2.625μLPCR反应体系Table2.625μLReactionsystemofPCRamplificationPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）1μLDNA模版2μL灭菌超纯水8.5μL2.2.2.3.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3055℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。2.2.2.3.4PCR产物序列分析将扩增后PCR产物送华大基因科技有限公司测序，后将测序结果通过NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）中blast软件对序列进行比对，进一步确定菌株种属。2.2.2.4VITEK-2生化鉴定加3mL无菌盐水（pH=5.0、0.45%浓度）于特制6mL塑料试管中，挑已分离纯化菌种新鲜培养物加入盐水混成菌悬液，将试管放入电子比浊仪测定浓度达到0.5-0.63麦氏单位，根据革兰氏染色镜检的结果，分别对应革兰氏阴性细菌鉴定(GN鉴定卡)卡、革兰氏阳性细菌鉴定卡(GP鉴定卡)、酵母菌鉴定卡(YST鉴定卡)，VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统上机进行菌种鉴定。2.3结果利用血平板对奶牛场分离奶样进行初步筛选，挑取在血平板上呈大而凸起、表面光滑、呈金黄或白色、周围有溶血圈的菌落进行染色镜检。通过细菌16SrRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc进行种属鉴定。PCR扩增结果显示：扩增的16SrRNA基因片段及nuc基因片段与对照菌目的基因扩增长度相符。将预定基因进行测序并用NCBIBlast在线软件比对分析显示，有81株序列被鉴定为金黄色葡萄球菌（图1，2）。同时用VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统对所分离纯化的菌株进行种属鉴定，结果显示有81株为金黄色葡萄球菌，其中广东省分离出57株，分离率为19.1%；甘肃省分离出24株，分离率为14.1%（表2.7）。11 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定表2.7金黄色葡萄球菌分离率Table2.7TherateofStaphylococcusaureus鉴定方法地区奶样数分离率(%)16srRNAnucVitek-2广东省57575730019.1甘肃省24242417014.1图2.1部分葡萄球菌16SrRNA的PCR扩增Fig.2.1Theamplificationof16SrRNAinStaphylococcusbyPCR图2.2部分金黄色葡萄球菌特异性基因nuc的PCR扩增Fig.2.2ThePCRidentificationofspecialnucgeneinS.aureus2.4讨论对分别分离自广东省和甘肃地区部分规模化养殖厂采集的奶样进行分离纯化，并进一步通过细菌16SrRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc及VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统进行种属鉴定，结果发现所采奶样中共鉴定出81株金黄色葡萄球菌，其中57株分离自广东省，分离率为19.1%；另24株分离自甘肃省，分离率为14.1%。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章金黄色葡萄球菌的分离鉴定PCR技术特异性较强、敏感性较高、操作简单快捷，大大缩短了鉴定周期。通过细菌16SrRNA通用引物并结合金黄色葡萄球菌特异性基因-耐热核酸酶基因nuc及VITEK-2-COMPACT15全自动微生物鉴定系统方法对奶样中菌株的种属进行多重方法进行确认，提高了鉴定结果的准确率。13 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析我国是抗生素生产和消费大国，其被广泛用于疾病预防和治疗，但因不合理使用使细菌对敏感性降低，出现了大量耐药细菌，给临床及畜牧业带来了极大的困扰和挑战。金葡菌作为食源性致病菌可传播耐药基因给动物和人类，药敏检测和耐药基因检测不仅可呈现金葡菌耐药现状及携带耐药基因情况，同时也为兽医工作者选择适宜的治疗药物提供了依据(Hoganetal,2003；Coelhoetal,2009)。本章对从牛乳房炎奶样中分离鉴定所得的81株金黄色葡萄球通过药物敏感性试验，结合相关耐药基因检测分析其相关性，并对MRSA和MSSA之间的耐药关系及不同地区分离菌株耐药情况的进行比较，以期为奶牛乳房炎临床治疗及药物筛选提供理论依据(王博等，2016)。3.1材料3.1.1样品采样分离自规模化奶牛养殖场的81株金黄色葡萄球菌，其中57株来自广东省，另24株分离自甘肃省；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ATCC43300）均为实验室保存菌株。3.1.2主要仪器表3.1本章实验所需主要仪器设备Table3.1Allequipmentsandapparatusesusedinthissection仪器名称生产厂家PCR扩增仪AppliedBiosystems公司DYY-8C型高压电泳仪北京六一仪器厂DYCP-31ND型电泳槽北京六一仪器厂超纯水仪AFZ-0502-U重庆阳企业发展有限公司BS-2F数显震荡培养箱金坛市华城开元实验仪器厂高温高压灭菌锅申安医疗器械（上海）GelDocTMXR紫外凝胶成像系统美国Bio-Rad移液器德国Eppendorf公司Gentrifuge5804R台式高速离心机德国Eppendorf公司VORTEX5型漩涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司电热恒温水浴锅常州翔天实验仪器厂3.1.3主要试剂14 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析表3.2本章实验所需主要试剂Table3.2Allreagentsandsolutionsusedinthissection试剂名称生产厂家DNALadderMarkerTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司蛋白酶KTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司溶菌酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司PremixEXTaq酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司细菌DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖HBBI公司药敏纸片Oxoid抗生素索莱宝生物科技有限公司5×TAE电泳缓冲液生工生物工程（上海）有限公司溴化乙锭生工生物工程（上海）有限公司Mueller-Hinton(MH)肉汤培养OxoidMueller-Hinton(MH)琼脂培养基OxoidLB液体培养基Oxoid3.2方法3.2.1药敏试验药敏实验采用微量肉汤稀释法。每种药物共分10个梯度进行倍比稀释。测定卡那霉素、红霉素、苯唑西林、万古霉素、氟苯尼考、头孢噻呋、四环素、环丙沙星、利奈唑胺、青霉素、利奈唑胺、头孢唑林、庆大霉素、氨苄西林等14种抗生素对分离金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，分析其耐药性。质控菌株为金葡菌（ATCC25923）。3.2.2药液配制每种药物储备液配制浓度为10240μg/mL，利用细菌过滤器将药物储备液过滤，分装到5mL无菌离心管中，置于-20℃冷冻保存，备用。3.2.3菌液的制备将冷冻保存的金黄色葡萄球菌接种于MH琼脂培养基上，37℃培养12-18h，后挑取单一菌落于MH肉汤中，37℃培养12-18h；然后用无菌生理盐水将菌液稀释到0.5麦氏比浊度，备用。3.2.4最小抑菌浓度（MIC）测定A、于96孔板从第1列孔中加入180μL的MH液体培养基，后用排枪从第二个孔往后每孔加入100μL的MH液体培养基；B、向第一列孔中加入稀释好的抗菌药，吹打均匀后吸出100μL加入第2列孔中吹打3次后再吸出100μL加入第3列孔中…依次类推至第11列孔，吸出100μL液体后打掉枪头；15 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析C、向每孔内将带检测的已稀释好的菌液从药品稀释的浓度梯度从低到高依次加入，每孔100μL，每个菌株做3个平行，在第12列孔分别加入100μL稀释菌液作阳性对照、100μLMH液体培养基作阴性对照；D、将加好药液、菌液的96微孔板盖好，做好标记，37℃培养18-24h后，观察结果，依据CLSI标准进行判定。3.2.5药敏纸片法采用CLSI推荐纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B）。A、将冷冻保存金葡菌接种于MH琼脂培养基，37℃条件下培养12-18h；挑取单一菌落于MH肉汤中，37℃条件下培养12-18h；无菌生理盐水稀释菌液到0.5麦氏比浊度，备用；B、用无菌棉签蘸取稀释菌液均匀涂于MH固体培养基，反复3次；C、打开平板盖，用无菌镊子夹取抗生素纸片贴于平板表面；D、37℃条件下培养16-18h后取出观察结果。游标卡尺测量抑菌圈直径，实验应重复3次，依据CLSI标准进行判定。3.2.6部分耐药基因检测以上文所提细菌基因组DNA为模版，进行14种耐药基因检测。相关引物序列见表3.3。表3.3各种耐药基因引物序列Table3.3Antibioticsresistancegeneprimersequence耐药基因基因序列F:GTGAAGATATACCAAGTGATTmecAR:ATGCGCTATAGATTGAAAGGATF:AGAAGCGGTAAACCCCTCTGAGAermAR:CTTTTCGCAAATCCCTTCTCAACGAF:AAAACTTACCCGCCATACCAermBR:TTTGGCGTGTTTCATTGCTTermCF:GAAATCGGCTCAGGAAAAGGR:TAGCAAACCCGTATTCCACGtetAF:GCGCGATCTGGTTCACTCGR:AGTCGACAGTGGCGCCGGCtetBF:AAAACTTATTATATTATAGTGR:TGGAGTATCAATAATATTCACtetMF:ACAGAAAGCTTATTATATAACR:TGGCGTGTCTATGATGTTCAC16 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析表3.3各种耐药基因引物序列（续）Table3.3AntibioticsresistancegeneprimersequenceF:TGCTGGTAATGATTGGTTfemAR:ATCTCGCTTGTTATGTGCF:CCAAGAGCAATAAGGGCATAaac(6)/aph(2″)R:CACTATCATAACCACTACCGF:CGGTCGGTATTGTCTTCACGfloRR:TCACGGGCCACGCTGTGTF:TATCGGTTTAGTATTACCAGTCnorR:AACTTCTGCCATAAACCACF:GAAAGACAACAGGAAGAAAGCvanCR:ATCGCATCACAAGCACCAATCF:CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATAvanAR:CCCCTTTAACGCTAATACGATCAAF:GTGACAAACCGGAGGCGAGGAvanBR:CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA3.3结果3.3.1药敏试验结果利用微量肉汤稀释法，测定9种抗生素对81株金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，参照CLSI指定标准进行耐药性分析。结果显示：菌株对抗菌药物呈多重耐药，其中对3种药物具有耐药性的菌株共有16株、对4种药物具有耐药性的菌株共有5株、对5种药物具有耐药性的菌株共有7株、对6种药物具有耐药性的菌株共有6株、对7种药物具有耐药性的菌株共有1株、对8种药物具有耐药性的菌株共有1株、对9种药物具有耐药性的菌株共有2株、对10种药物具有耐药性的菌株共有2株。81株菌对环丙沙星、红霉素、氟苯尼考、青霉素等4种抗菌药物的耐药率大于30%，其中氟苯尼考的耐药率高达80%以上，其次是青霉素为66.7%，需引起临床用药高度重视，选择敏感性药物代替。卡那霉素和氨苄西林耐药率分别为25.9%，克林霉素耐药率为24.7%，虽然不如上述3种药物耐药率高，但临床用药时仍需注意。虽然头孢噻呋和庆大霉素耐药率分别仅为6.2％和2.5%，但其中度耐药率分别达到34.6％和18.5%，应引起重视。苯唑西林耐药率较低，为4%。四环素、万古霉素和利奈唑胺的耐药率为0，且其敏感率均大于92%，证明两种药物仍有较高有效作用性。抗菌药物对81株金黄色葡萄球菌药物敏感性试验结果见表3.4。17 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析表3.4抗菌药物对81株金黄色葡萄球菌药物敏感性试验结果Table3.4DrugsensitivitytestresultsallStaphylococcusaureusisolates药物名称耐药株数耐药率％中介株数中介率％敏感株数敏感率％卡那霉素2125.944.95669.1四环素0067.47592.6红霉素2632.1005567.9环丙沙星2733.367.44859.2头孢噻呋56.22834.64859.2利奈唑胺000081100万古霉素0044.97795.1苯唑西林44.9007795.1氟苯尼考6580.2001619.8氨苄西林2125.956.25567.9克林霉素2024.722.55972.8头孢唑林22.556.27491.4庆大霉素22.51518.56479青霉素5466.7002733.33.3.2部分耐药基因检测对分离鉴定所得81株金黄色葡萄球菌进行部分耐药基因检测，由表3.7可知，ermB、tetM、aac(6)/aph(2″)、femA和vanB五种耐药基因检测率为100%；floR、ermC和fexA三种耐药基因检出率也较高，分别为80.2％、77.8%和50.6％，而vanA、vanC、nor、tetA和tetB五种耐药基因检测率为0；。结合药敏实验结果，floR基因与氟苯尼考、tetA和tetB基因与四环素耐药菌株表型呈正相关，这一结果与杜向党(杜向党等，2007)等报道的floR基因与氟苯尼考耐药情况相似；剩余耐药基因其耐药基因阳性率远高于耐药表型，这一结果有待于进一步探讨。3.3.3MRSA耐药性及耐药基因阳性率比较携带mecA的金黄色葡萄球菌可以有多个表型，使用PCR检测mecA基因可以有效避免受菌株表型判断的影响，因此，最常用的是通过检测mecA基因是否存在于细菌的基因组中来确定MRSA，此方法目前是鉴定MRSA的“金标准”(Chambers,1997；陈庆增等，2009)。对81株金黄色葡萄球菌扩增mecA基因，结果显示，20株金黄色葡萄球菌含有mecA基因，证明初筛的20株金黄色葡萄球菌均为MRSA。81株金黄色葡萄球菌中，MRSA包含20株菌株（24.7%），MSSA包含61株菌株（75.3%）。MRSA与MSSA对氟苯尼考耐药率均大于75%。14种药中MRSA对红霉素、头孢唑林、环丙沙星、庆大霉素、头孢噻呋、克林霉素、青霉素、氨苄西林、苯唑西林和氟苯尼考等10种抗菌药物耐药率均高于MSSA，而MRSA和MSSA对四环素、利奈唑胺和万古霉素耐药率均为0，结果见表3.5。18 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析表3.5MRSA与MSSA耐药情况比较Table3.5MRSAandMSSAresistancecompared抗生素MRSA菌株数MRSA耐药率（%）MSSA菌株数MSSA耐药率（%）卡那霉素5251626.2四环素0000红霉素945154.3环丙沙星7352032.8头孢噻呋31523.3利奈唑胺0000万古霉素0000苯唑西林42000氟苯尼考15754076.1头孢唑林21000庆大霉素1511.6克林霉素5251012.3青霉素201003455.7氨苄西林2010011.6表3.6部分耐药基因检测结果表Table3.6Partialresistancegenetestresults总耐药菌总阳性MRSAMRSAMSSAMSSA耐药基因株数率％阳性菌株数阳性率%阳性菌株数阳性率%floR6580.219954675.4aac(6)/aph811002010061100(2")femA811002010061100ermA30378402236.7ermB811002010061100ermC6377.817854675.4tetA000000tetB000000tetM811002010061100nor000000vanA000000vanB811002010061100vanC000000fexA4150.611553049.2mecA2024.72010000对20株MRSA以及61株MSSA耐药基因进行检测，发现无论是MRSA还是MSSA均携带了5种以上的耐药基因，且耐药基因阳性率均比较高，除tetA、tetB、nor、vanC和vanA五种耐药基因的携带率为0外，其余耐药基因阳性率范围在24.7%～100%之间，说明单个菌株同时携带19 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析了多个耐药基因，这也是菌株呈多重耐药的重要原因之一，但MRSA与MSSA携带耐药基因的情况并无明显差异（见表3.6）。3.3.4广东和甘肃地区分离菌株耐药性及耐药基因阳性率比较由于不同地区各奶牛场的地理位置、养殖条件的差异及用药种类、用药方式和用药量的不同，因此分离自不同地区的金黄色葡萄球菌的耐药性及耐药基因的携带情况会有所不同（表3.7）。表3.7不同地区耐药情况比较Table3.7Comparisonofdrugresistanceindifferentregions抗生素广东耐药菌株数广东菌株耐药率（％）甘肃耐药菌株数甘肃菌株耐药率（％）卡那霉素1017.51145.8四环素0000红霉素1322.81354.2环丙沙星1628.11145.8头孢噻呋47.114.2利奈唑胺0000万古霉素0000苯唑西林47.100氟苯尼考5291.21354.2头孢唑林235.100克林霉素712.3833.3青霉素3866.71666.7庆大霉素11.814.2氨苄西林2035.114.281株金黄色葡萄球菌中有57株分离自广东省奶牛场，另24株分离自甘肃部分地区奶牛场。药敏试验结果发现甘肃部分地区分离菌株对卡那霉素、红霉素、环丙沙星、庆大霉素和克林霉素的耐药率均高于分离自广东省的菌株；而分离自广东省的菌株对头孢噻呋、苯唑西林、氟苯尼考、头孢唑林和氨苄西林的耐药率均高于甘肃地区的分离株，推测可能跟奶牛场用药种类、方式及药物用量不同有关（表3.7）。两个地区耐药基因阳性率比较发现，甘肃和广东省的分离株均携带多种耐药基因，推测可能是菌株具有多重耐药性的主要原因。20 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析表3.8不同地区对应菌株耐药基因阳性率比较Table3.8Positiveratesofantibioticsresistancegenesindifferentregions广东耐广东耐药基甘肃耐药基甘肃耐药耐药基因药基因数因阳性率%因数基因阳性率％floR4578.92083.3aac(6)/aph(2")5710024100femA5710024100ermA1321.31365ermB5710024100ermC53931041.7tetA0000tetB0000tetM5710024100fexA2340.41875vanA0000vanB5710024100vanC0000nor00003.4讨论近年来，由于抗菌药物不合理利用，金黄色葡萄球菌的多重耐药性已经引起国内外学者的广泛关注，尤其是MRSA。本实验检测了81株金黄色葡萄球菌对14种药物的敏感性，结果显示其中对3种药物具有耐药性的菌株共有16株、对4种药物具有耐药性的菌株共有5株、对5种药物具有耐药性的菌株共有7株、对6种药物具有耐药性的菌株共有6株、对7种药物具有耐药性的菌株共有1株、对8种药物具有耐药性的菌株共有1株、对9种药物具有耐药性的菌株共有2株、对10种药物具有耐药性的菌株共有2株。且有4种抗菌药物的耐药率大于30%，其中青霉素和氟苯尼考的耐药率高达60%以上，说明分离株存在较严重的多重耐药性。四环素耐药率与丁兆凤和张忠厚等报道的四环素耐药情况对比有较大差异(张忠厚，2005；丁兆凤等，2010)，这可能与地区用药种类，用药方法和用量及菌株生长环境不同有关。实验对分离鉴定所得81株金黄色葡萄球菌进行部分耐药基因检测，结果显示所测耐药基因具有较高的检出率。除tetA、tetB、nor、vanA和vanC外，其余耐药基因阳性率范围在20.0%～100%之间。其中氟苯尼考的耐药基因与耐药表型的符合率为100%，可推测耐药基因floR可能是介导氟苯尼考的主要耐药基因。分离菌株中四环素耐药基因tetA、tetB和万古霉素耐药基因vanA、vanC均未检出，四环素耐药基因tetM检出率为100%，万古霉素耐药基因vanB检出率为100%，但药敏结果显示四环素和万古霉素均未检出到耐药菌株，这一现象有待进一步分析验证。81株金黄色葡萄球菌中共筛出20株MRSA，MRSA分离率为24.7%，较文献报道的34.2％～60.3%较低(陈云钰等，2012；王海等，2013)。对比MRSA与MSSA的药敏试验结果发现MRSA对常用抗菌药物耐药率明显高于MSSA，该结果与刘静等(2015)人研究结果一致，这可能与抗菌药物使用不合理及MRSA多重复杂的耐药机制有关。另外，本研究检测出含有mecA基因的菌株21 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析（MRSA）20株，但在药敏试验中测得金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药菌株为4株，推测部分菌株存在隐藏性耐药情况，为OS-MRSA（含有mecA基因，药敏试验中OS-MRSA对苯唑西林敏感，但用β-内酰胺类抗生素治疗时无效）菌株，该结果与HiralM(2016)等人研究结果相似。有研究表明葡萄球菌中与细胞壁肽聚糖合成有关的辅助基因femA与金葡菌对苯唑西林耐药有关，熊亚莉等(2007)研究发现femA是MRSA高水平表达的必需因子，其过表达可导致金葡菌对苯唑西林高水平耐药，当femA低水平表达时金葡菌对苯唑西林呈低水平耐药。本研究中检测femA基因的阳性率高达97.5%，而81株金黄色葡萄球菌药敏试验显示只有4株（含femA基因）对苯唑西林高水平耐药，推测除了四株耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌中femA高水平表达外，其余的金黄色葡萄球菌中femA基因均呈现低水平表达现象。由于金黄色葡萄球菌的耐药表型与耐药基因密切相关(金文杰等，2007)，本研究对部分耐药基因进行了检测，发现无论是MRSA还是MSSA均携带了7种以上的耐药基因，且耐药基因阳性率均比较高，由此也再次验证了金黄色葡萄球菌的多重耐药性，同时也表明检测耐药基因对进一步分析耐药菌株具有一定的参考价值。本研究中81株金黄色葡萄球菌对不同β-内酰胺类抗生素耐药情况不尽相同，如氨苄西林的耐药率为25.9%，与β-内酰胺类的耐药基因mecA（24.7%）检出率相符，推测金黄色葡萄球菌对氨苄西林的耐药性可能与mecA基因有关，但这与李光超等(2016)研究中33株mecA阴性的金黄色葡萄球菌对氨苄西林的耐药率高达72.73%的实验结果不符。这种差异可能是由于菌株的不同来源造成的，也体现了金黄色葡萄球菌耐药的地域性差异。而β-内酰胺类抗生素青霉素、头孢唑林及头孢噻呋的耐药率分别为66.7%、2.5%及6.2%，这与β-酰胺类相关耐药基因mecA（24.7%）与femA（97.5%）的检出率均不符，推测青霉素、头孢唑林及头孢噻呋三种抗生素的耐药机制与mecA和femA两种耐药基因的相关性不大，可能存在其他的耐药机制，比如细菌的主动外排机制。本研究耐药结果显示，耐大环内酯类抗生素红霉素的金黄色葡萄球菌共26株（32.1%），耐克林霉素的金黄色葡萄球菌共21株（25.9%），其中既耐红霉素又耐克林霉素的菌株有21株；而对红霉素耐药、克林霉素敏感的金黄色葡萄球菌共5株。进一步通过耐药基因检测发现，ermA检出率为37%，与红霉素和克林霉素的耐药率相近，而基因ermB检出率为100%，ermC检出率为77.8%与菌株耐药率相差较大，推测金黄色葡萄球菌耐红霉素和克林霉素耐药机制与ermB相关性不大，而主要是由ermA介导，其次是ermC，本试验中可能部分菌株的ermC基因未能表达或低水平表达从而未能使菌株产生耐药的作用。此结果与Gerard等(1999)研究报道中金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药主要由ermA占主导地位，其次为ermC的结果相似。与李光超等(2016)研究显示其实验中对大环内酯类起耐药的主导基因是ermB和ermC，实验中并未检测到ermA基因实验结果相差较大，推测由于实验菌株的地域性条件、生长环境及来源不同导致。金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类的的耐药机制主要是通过菌体中的氨基糖苷类修饰酶表达产物使氨基糖苷类药物产生钝化从而导致药物失活，最终细菌产生耐药性。基因aac(6’)/aph(2’’)负责编码一种双功能酶从而使金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类抗生素产生抗性。本研究中金黄色葡萄球菌对庆大霉素和卡那霉素的耐药率分别为2.5%和25.9%，而基因aac(6’)/aph(2’’)的检出率为100%，两者之间并没有对应关系。这与刘庆中等(2008)研究显示的金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类的耐药表型和基因型基本一致的结果并不相同，但与李光超的耐药研究结果中金黄色葡萄球菌对22 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析氨基糖苷类的额耐药率虽为48.48%，而其耐药基因aac(6’)/aph(2’’)的检出率则为0的结果相似，推测可能是其他的耐药基因主导金黄色葡萄球菌对氨基糖苷类耐药，有待进一步验证。金黄色葡萄球菌对四环素的耐药机制主要是核糖体保护机制，即细菌核糖体保护蛋白与细菌核糖体结合，使细菌的蛋白质合成不受周围药物环境的影响,从而使细菌对四环素类药物产生耐药作用，其主要是受基因tetM的介导。杜伟伟等(2015)研究中分离自河北地区的金黄色葡萄球菌对四环素的耐药率为86.24%，其中检出常见于革兰氏阴性菌的tetA（41.28%）和tetB（18.35％）基因，说明耐药基因可以在不同型细菌间进行交换和传播；而编码核糖体起保护机制的tetM检出率只有10.09%，其原因可能与地域不同有关，说明核糖体保护基因tetM不是河北地区乳源金黄色葡萄球菌耐药的主导基因。本研究中金黄色葡萄球菌对四环素均敏感，无耐药株；进一步对四环素耐药基因tetA、tetB及tetM进行检测，其检出率分别为0、0和100%，即四环素表型与tetA和tetB基因型一致，推测tetM不是主要介导受试菌株对四环素耐药的主要原因。李光超研究中金黄色葡萄球菌对四环素的表型与基因型也不一致，其金黄色葡萄球菌对四环素的耐药率为57.58%，但受试菌中并没有tetM基因的存在。推测可能是因为该菌株含有未检测的其他耐药基因或存在其他耐药机制或者携带耐药基因的菌株可以在一定的抗生素压力下存活而不表现耐药表型,该发现对临床用药有一定的指导意义。金黄色葡萄球菌对喹诺酮类的耐药主要是药物靶位的改变和主动外排机制，其中药物靶位的改变主要耐药基因为gyrA和grlA，而主动外排机制主要由nor基因介导。本研究中81株金黄色葡萄球菌对环丙沙星耐药率为33.3%，而喹诺酮类耐药基因nor的检出率为0，推测本研究中金黄色葡萄球菌环丙沙星耐药不是通过主动外排产生的，可能是通过药物靶位点改变而导致的，有待进一步研究。Goswitz等(1992)研究中28株耐环丙沙星的金黄色葡萄球菌中有16株携带有gyrA和grlA基因，且该基因序列发生双突变，使菌株对环丙沙星耐药严重，且表示发生双突变时将导致菌株高水平耐药。金黄色葡萄球菌对糖肽类的耐药机制主要是通过细胞壁增厚，增厚的细胞壁起到了隔离屏障作用，阻碍万古霉素接近作用靶位点，从而形成耐药。本研究中81株金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药率为0，中介菌株为4，敏感菌株77株，进一步对糖肽类耐药基因进行检测发现vanA和vanC检出率为0，vanB检出率为100％。金黄色葡萄球菌的耐药表型和耐药基因vanB携带率并不相符，而与vanA和vanC携带率一致。金黄色葡萄球菌虽本身不存在vanA、vanB和vanC，但可从耐万古的肠球菌中获得三种耐药基因从而产生耐药性，由此推测该受试菌株分离区万古霉素的使用较合理，从而使该区没有出现耐万古霉素的金黄色葡萄球菌菌株，但值得注意的是有4株为中介菌株，这些菌株很有可能在适当的情况下转化为耐药株，给临床的治疗带来困扰和挑战，因此，仍应加强对药物使用的管理，合理和正确的使用抗生素，控制并减少耐药菌的产生。金黄色葡萄球菌对氯霉素类的耐药现象一直存在，有研究显示floR可能与氯霉素和氟苯尼考的耐药有关，有助于对两种抗生素耐药性研究。本研究对氯霉素类相关耐药基因进行检测，发现floR检出率为80.2%、fexA检出率为50.6%而81株金黄色葡萄球菌对氟苯尼考的耐药率为80.2%，这和floR的检出率相符，与fexA基因检出率并不相符，表明本研究中floR为介导氟苯尼考耐药的主要机制。KehrenbergC等(2006)研究中302株氯霉素耐药的金黄色葡萄球菌中fexA的检出率为4.0%，与本研究实验结果相似，推测fexA并不是主要介导氯霉素类抗生素耐药的基因。杨鑫23 中国农业科学院硕士学位论文第三章金黄色葡萄球菌药物敏感性实验及耐药基因的分析(2009)等对规模化养殖场氯霉素类耐药基因floR的检出率为37.2%；羊云飞(2004)对养殖场中floR基因的检出率为15.5%。本试验中floR检出率与这两者比较有明显升高，说明目前养殖场细菌对氯霉素类药物耐药情况更加严重，可能由于临床上使用氯霉素类药物治疗细菌病增多有关。因此，合理使用药物，加强临床用药规范管理，并实施对氯霉素类药物耐药基因流行的监控至关重要。本试验中81株金黄色葡萄球菌中有57株分离自广东省奶牛场，另24株分离自甘肃部分地区奶牛场。药敏试验结果发现甘肃部分地区分离菌株对卡那霉素、红霉素、环丙沙星、庆大霉素和克林霉素的耐药率均高于分离自广东省的菌株；而分离自广东省的菌株对头孢噻呋、苯唑西林、氟苯尼考、头孢唑林和氨苄西林的耐药率均高于甘肃地区的分离株，推测可能跟不同地区不同奶牛场用药种类、方式及药物用量不同有关。本研究从实验室分离的81株金黄色葡萄球菌对常见药物的敏感性试验中发现分离株对氟苯尼考的耐药率高达80.2%，同时发现其存在多重耐药性，提示临床上用药要规范化、合理化，并做好病原微生物及耐药基因的检测，结合实际情况合理适度用药，防止细菌耐药性的进一步加重。24 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究第四章金黄色葡萄球菌的分子特征4.1试验材料4.1.1菌株金黄色葡萄球菌81个株，其中57株分离自广东省奶牛养殖场和24株分离自甘肃省奶牛养殖场。4.1.2主要仪器表4.1本章实验所需主要仪器设备Table4.1Allequipmentsandapparatusesusedinthissection仪器名称生产厂家PCR扩增仪AppliedBiosystems公司DYY-8C型高压电泳仪北京六一仪器厂DYCP-31ND型电泳槽北京六一仪器厂超纯水仪AFZ-0502-U重庆阳企业发展有限公司BS-2F数显震荡培养箱金坛市华城开元实验仪器厂GelDocTMXR紫外凝胶成像系统美国Bio-Rad移液器德国Eppendorf公司Gentrifuge5804R台式高速离心机德国Eppendorf公司VORTEX5型漩涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司电热恒温水浴锅常州翔天实验仪器厂4.1.3主要试剂表4.2本章实验所需主要试剂Table4.2Allreagentsandsolutionsusedinthissection试剂名称生产厂家DNALadderMarkerTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司蛋白酶KTaKaRa宝生物工程(大连)有限公司溶菌酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司PremixEXTaq酶TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司细菌DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖HBBI公司5×TAE电泳缓冲液生工生物工程（上海）有限公司溴化乙锭生工生物工程（上海）有限公司Mueller-Hinton(MH)肉汤培养OxoidMueller-Hinton(MH)琼脂培养基OxoidLB液体培养基Oxoid25 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究4.2试验方法4.2.1基因组提取在无菌条件下，挑取纯培养单菌落于LB液体培养基中，37℃孵育20-24h。按天根全细菌基因组提取试剂盒的操作提取细菌基因组DNA：取1-5mL细菌培养液，高速离心后去上清液；后向沉淀中加入配置好的溶菌酶对细菌进行破壁处理；然后再加入蛋白酶K出去菌体蛋白将菌体裂解使其DNA表露出来；接着向菌体中加入缓冲液GB使菌体裂解更彻底；随后向菌体中分别加入无水乙醇、缓冲液GD（加有无水乙醇）、漂洗液PW（加有无水乙醇）并高速离心后去上清，对菌体DNA进行抽提、纯化；最后向沉淀中加入缓冲洗脱液TE，离心后将收集液置于离心管中，放冰箱-40℃冷冻保存，备用。4.2.2SCCmec分型4.2.2.1引物序列参照文献中SCCmec分型引物序列并由华大有限公司合成。引物序列及靶基因大小见表4.3表4.3SCCmec分型引物序列及目的片段大小Table4.3PrimersequencesofSCCmecmultiplexPCR引物名称引物序列(5′→3′)产物长度（bp）F:GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG613SCCmecIR:GTTCTCTCATAGTATGACGTCCF:CGTTGAAGATGATGAAGCG398SCCmecIIR:CGAAATCAATGGTTAATGGACCF:CCATATTGTGTACGATGCG280SCCmecIIIR:CCTTAGTTGTCGTAACAGATCGF:GCCTTATTCGAAGAAACCG776SCCmecIVaR:CTACTCTTCTGAAAAGCGTCGF:TCTGGAATTACTTCAGCTGC493SCCmecIVbR:AAACAATATTGCTCTCCCTCF:ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC200SCCmecIVcR:TTGGTATGAGGTATTGCTGGF:CTCAAAATACGGACCCCAATACA881SCCmecIVdR:TGCTCCAGTAATTGCTAAAGF:GAACATTGTTACTTAAATGAGCG325SCCmecVR:TGAAAGTTGTACCCTTGACACCF:GTGAAGATATACCAAGTGATT147mecA147R:ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT26 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究4.2.2.2PCR扩增体系PCR扩增体系为25μL表4.425μLPCR反应体系Table4.425μLReactionsystemofPCRamplificationPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）4.95μLDNA模版5μL灭菌超纯水2.55μL4.2.2.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3056℃退火30s25个循环72℃延伸1min94℃变性3052℃退火30s25个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。4.2.3MLST分型多位点序列分型(multilocussequencetyping,MLST)是根据基本能覆盖整个染色体且相对保守又会发生局部点突变的7个管家基因为基础的分析方法。管家基因分别是arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil，这7个基因发生的局部点突变有累积效应，可对菌株间遗传关系及其宏观进化进行长期追踪。4.2.3.1引物合成表4.5spa分型引物序列及目的片段大小Table4.5PrimersequencesofspamultiplexPCR引物名称引物序列(5′→3′)产物长度（bp）F:TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC456arcCR:AGGTATCTGCTTCAATCAGCGF:ATCGGAAATCCTATTTCACATTC456aroER:GGTGTTGTATTAATAACGATATC27 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究表4.5spa分型引物序列及目的片段大小（续）Table4.5PrimersequencesofspamultiplexPCRF:CTAGGAACTGCAATCTTAATCC465glpFR:TGGTAAAATCGCATGTCCAATTCF:ATCGTTTTATCGGGACCATC429gmkR:TCATTAACTACAACGTAATCGTAF:GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG474ptaR:GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAAF:TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA402tpiR:TTTGCACCTTCTAACAATTGTACF:CAGCATACAGGACACCTATTGGC516yqiLR:CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC4.2.3.2PCR扩增体系PCR扩增体系为25μL表4.625μLPCR反应体系Table4.625μLReactionsystemofPCRamplificationPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）1μLDNA模版2μL灭菌超纯水8.5μL4.2.3.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3055℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。4.2.3.4测序结果分析1、观察测序结果峰图，确认测得序列质量28 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究2、登陆官方网站http://saureus.mlst.net；于“DownloadAlleles”中分别下载7个管家基因的标准序列，如下：arcC（456bp）TTATTAATCCAACAAGCTAAATCGAACAGTGACACAACGCCGGCAATGCCATTGGATACTTGTGGTGCAATGTCACAGGGTATGATAGGCTATTGGTTGGAAACTGAAATCAATCGCATTTTAACTGAAATGAATAGTGATAGAACTGTAGGCACAATCGTTACACGTGTGGAAGTAGATAAAGATGATCCACGATTCAATAACCCAACCAAACCAATTGGTCCTTTTTATACGAAAGAAGAAGTTGAAGAATTACAAAAAGAACAGCCAGACTCAGTCTTTAAAGAAGATGCAGGACGTGGTTATAGAAAAGTAGTTGCGTCACCACTACCTCAATCTATACTAGAACACCAGTTAATTCGAACTTTAGCAGACGGTAAAAATATTGTCATTGCATGCGGTGGTGGCGGTATTCCAGTTATAAAAAAAGAAAATACCTATGAAGGTGTTGAAGCGaroE（456bp）:AATTTTAATTCTTTAGGATTAGATGATACTTATGAAGCTTTAAATATTCCAATTGAAGATTTTCATTTAATTAAAGAAATTATTTCGAAAAAAGAATTAGATGGCTTTAATATCACAATTCCTCATAAAGAACGTATCATACCGTATTTAGATCATGTTGATGAACAAGCGATTAATGCAGGTGCAGTTAACACTGTTTTGATAAAAGATGACAAGTGGATAGGGTATAATACAGATGGTATTGGTTATGTTAAAGGATTGCACAGCGTTTATCCAGATTTAGAAAATGCATACATTTTAATTTTGGGCGCAGGTGGTGCAAGTAAAGGTATTGCTTATGAATTAGCAAAATTTGTAAAGCCCAAATTAACTGTTGCGAATAGAACGATGGCTCGTTTTGAATCTTGGAATTTAAATATAAACCAAATTTCATTAGCAGATGCTGAAAAGTATTTAglpF（465bp）:GGTGCTGATTGGATTGTCATCACAGCTGGATGGGGATTAGCGGTTACAATGGGTGTGTTTGCTGTCGGTCAATTCTCAGGTGCACATTTAAACCCAGCGGTGTCTTTAGCTCTTGCATTAGACGGAAGTTTTGATTGGTCATTAGTTCCTGGTTATATTGTTGCTCAAATGTTAGGTGCAATTGTCGGAGCAACAATTGTATGGTTAATGTACTTGCCACATTGGAAAGCGACAGAAGAAGCTGGCGCGAAATTAGGTGTTTTCTCTACAGCACCGGCTATTAAGAATTACTTTGCCAACTTTTTAAGTGAGATTATCGGAACAATGGCATTAACTTTAGGTATTTTATTTATCGGTGTAAACAAAATTGCCGATGGTTTAAATCCTTTAATTGTCGGAGCATTAATTGTTGCAATCGGATTAAGTTTAGGCGGTGCTACTGGTTATGCAATCAACCCAGCACGTgmk（417bp）:CGAATATTTGAAGATCCAAGTACATCATATAAGTATTCTATTTCAATGACAACACGTCAAATGCGTGAAGGTGAAGTTGATGGCGTAGATTACTTTTTTAAAACTAGGGATGCGTTTGAAGCTTTAATCAAAGATGACCAATTTATAGAATATGCTGAATATGTAGGCAACTATTATGGTACACCAGTTCAATATGTTAAAGATACAATGGACGAAGGTCATGATGTATTTTTAGAAATTGAAGTAGAAGGTGCAAAGCAAGTTAGAAAGAAATTTCCAGATGCGCTATTTATTTTCTTAGCACCTCCAAGTTTAGAACACTTGAGAGAGCGATTAGTAGGTAGAGGAACAGAATCTGATGAGAAAATACAAAGTCGTATTAACGAAGCGCGTAAAGAAGTTGAAATGATGAATTTA29 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究pta（474bp）:GCAACACAATTACAAGCAACAGATTATGTTACACCAATCGTGTTAGGTGATGAGACTAAGGTTCAATCTTTAGCGCAAAAACTTGATCTTGATATTTCTAATATTGAATTAATTAATCCTGCGACAAGTGAATTGAAAGCTGAATTAGTTCAATCATTTGTTGAACGACGTAAAGGTAAAGCGACTGAAGAACAAGCACAAGAATTATTAAACAATGTGAACTACTTCGGTACAATGCTTGTTTATGCTGGTAAAGCAGATGGTTTAGTTAGTGGTGCAGCACATTCAACAGGAGACACTGTGCGTCCAGCTTTACAAATCATCAAAACGAAACCAGGTGTATCAAGAACATCAGGTATCTTCTTTATGATTAAAGGTGATGTACAATACATCTTTGGTGATTGTGCAATCAATCCAGAACTTGATTCACAAGGACTTGCAGAAATTGCAGTAGAAAGTGCAAAATCAGCATTAtpi（402bp）:CACGAAACAGATGAAGAAATTAACAAAAAAGCGCACGCTATTTTCAAACATGGAATGACTCCAATTATTTGTGTTGGTGAAACAGACGAAGAGCGTGAAAGTGGTAAAGCTAACGATGTTGTAGGTGAGCAAGTTAAGAAAGCTGTTGCAGGTTTATCTGAAGATCAACTTAAATCAGTTGTAATTGCTTATGAGCCAATCTGGGCAATCGGAACTGGTAAATCATCAACATCTGAAGATGCAAATGAAATGTGTGCATTTGTACGTCAAACTATTGCTGACTTATCAAGCAAAGAAGTATCAGAAGCAACTCGTATTCAATATGGTGGTAGTGTTAAACCTAACAACATTAAAGAATACATGGCACAAACTGATATTGATGGGGCATTAGTAGGTGGCGCAYqil（516bp）:GCGTTTAAAGACGTGCCAGCCTATGATTTAGGTGCGACTTTAATAGAACATATTATTAAAGAGACGGGTTTGAATCCAAGTGAGATTGATGAAGTTATCATCGGTAACGTACTACAAGCAGGACAAGGACAAAATCCAGCACGAATTGCTGCTATGAAAGGTGGCTTGCCAGAAACAGTACCTGCATTTACAGTGAATAAAGTATGTGGTTCTGGGTTAAAGTCGATTCAATTAGCATATCAATCTATTGTGACTGGTGAAAATGACATCGTGCTAGCTGGCGGTATGGAGAATATGTCTCAGTCACCAATGCTTGTCAACAACAGTCGCTTCGGTTTTAAAATGGGACATCAATCAATGGTTGATAGCATGGTATATGATGGTTTAACAGATGTATTTAATCAATATCATATGGGTATTACTGCTGAAAATTTAGTGGAGCAATATGGTATTTCAAGAGAAGAACAAGATACATTTGCTGTAAACTCACAACAAAAAGCAGTACGTGCACAGCAA3、将对应的测序结果截取对应的标准长度，再于相应的标准序列进行比对；4、如若任意一个管家基因为新的等位基因型，则菌株的序列型为新型，应提交至MLST官方数据库后方可获得新的ST型别。4.2.4spa分型spa是基于其X区呈多态性，两端相对保守从而建立的分型方法。4.2.4.1引物序列根据文献可获得分型引物并由华大公司合成，序列如下30 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究表4.7spa分型引物序列及目的片段大小Table4.7PrimersequencesofspamultiplexPCR引物名称引物序列(5′→3′)产物长度（bp）F：TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC433spaR：CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT4.2.4.2PCR扩增体系PCR扩增体系为25μL。表4.825μLPCR反应体系Table4.825μLReactionsystemofPCRamplificationPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）1μLDNA模版2μL灭菌超纯水8.5μL4.2.4.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3055℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。4.2.4.4测序结果分析1、spa重复序列基本在24bp左右，且其重复序列两端保守，重复序列起始基本为RCAMCAAAA—，末端基本为—TAYATGTCGT，具体参照spa官方网站http://www.ridom.de/spaserver的repeats部分；2、于测序结果中找到重复序列后粘贴复制于官方网站中“Searchforaspatypeorrepeat”即可得到重复序列的编号；3、将每个重复单元的编号按5’一3’的顺序依次排列组合后输入到“Searchforaspatypeorrepeat”中即可得到spa基因型；4、若有spa新型需spa提交官方网站数据库方可得到新型spa型别。31 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究4.2.5PVL毒力基因检测PVL是金黄色葡萄球菌产生的外毒素，可以增强病菌对宿主吞噬细胞的抵抗力和对宿主细胞的侵袭力，因此检测菌株是否含有PVL毒力因子对患者的治疗和预后有重要的意义，同时也能为临床合理的使用抗生素及控制感染提供理论依据。4.2.5.1引物序列根据文献可获得分型引物并由华大公司合成，序列如下表4.9PVL分型引物序列及目的片段大小Table4.9PrimersequencesofPVLmultiplexPCR引物名称引物序列(5′→3′)产物长度（bp）luk-F:ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCAPVL433luk-R:GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC4.2.5.2PCR扩增体系PCR扩增体系为25μL。表4.1025μL体系组分Table4.1025μLsystemcomponentsPremixEXTaq酶12.5μL引物（RP和FP）1μLDNA模版2μL灭菌超纯水8.5μL4.2.5.3PCR扩增条件94℃预变性5min94℃变性3055℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min4℃保存最后，取6μL的PCR扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压设置为120V，跑30分钟后于紫外凝胶成像仪观察结果。32 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究4.3分型结果4.3.1SCCmec分型结果SCCmec分型结果显示，20株MRSA被分为5个型别，其中SCCmecIII型12株（60.0％），SCCmecIVb型4株（20.0%），SCCmecI型2株（10.0%），SCCmecIVc型和SCCmecV型各1株（5.0%）；其中分离自广东省养殖场的菌株共16株，其分型结果比较集中，分为两个型，SCCmecIII型12株（75%）为主要优势型，其次为SCCmecIVb型4株（25%），与国内其他地区动物源性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec分型主要流行型结果相似；而分离自甘肃省各养殖场的菌株分型结果比较散，4株被分为3个SCCmec型，其中SCCmecI型2株为相对优势株，SCCmecIVc和SCCmecV型各1株。具体见下表：表4.11MRSA的SCCmec类型Table4.11TheSCCmectypesofMRSA地区分型广东省甘肃省SCCmecI02SCCmecIII120SCCmecIVb40SCCmecIVc01SCCmecV01SCCmec分型相同的金黄色葡萄球菌，分析其耐药谱是否具有相关性，12株SCCmecIII型菌株共表现出5种耐药谱，4株SCCmecIVb型菌株共表现出3种耐药谱，2株SCCmecI型菌株共表现出2种耐药谱，显示菌株的耐药谱可能与SCCmec分型有着一定的关系，且并没有直接相对应的关系，也说明不能单根据SCCmec分型来判定MRSA菌株的耐药情况，可能存在其他的耐药机制。表4.12耐药谱相同金黄色葡萄球菌SCCmec分型情况Table4.12SCCmectypingforS.aureuswiththesamedrugresistancespectrum菌株编号耐药谱SCCmec型MRSA21FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA25FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA64FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA71FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA94FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA106FFC、PEN、AMPSCCmecIIIMRSA72FFC、PEN、AMP、ERYSCCmecIII33 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究表4.12耐药谱相同金黄色葡萄球菌SCCmec分型情况（续）Table4.12SCCmectypingforS.aureuswiththesamedrugresistancespectrumMRSA26FFC、PEN、AMP、KANSCCmecIIIMRSA29FFC、PEN、AMP、KANSCCmecIIIMRSA124FFC、PEN、AMP、ERY、CIPSCCmecIIIMRSA132FFC、PEN、AMP、ERY、CIPSCCmecIIIMRSA142FFC、PEN、AMP、CIPSCCmecIIIMRSA27OXA、ERY、CLI、KAN、AMP、PEN、CIP、FFC、CNSCCmecIVbMRSA37OXA、ERY、CLI、KAN、AMP、PEN、CIP、FFC、KZSCCmecIVbMRSA49OXA、ERY、CLI、KAN、AMP、PEN、CIP、FFC、KZSCCmecIVbMRSA127OXA、ERY、CLI、KAN、AMP、PEN、CIP、FFCSCCmecIVbMRSA154CIP、KAN、FFC、PEN、ERY、CLISCCmecIVcMRSA157ERY、CIP、PENSCCmecVMRSA160ERY、CIP、PEN、FFC、KANSCCmecIMRSA162ERY、CIP、FFC、SCCmecISCCmec分型不同，携带的耐药基因也不尽相同，从而与菌株的耐药情况有着密不可分的关系，因此对分离自不同地区，不同来源及不同生长环境的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行SCCmec分型，对了解MRSA主要流行类别与耐药情况具有重要意义，同时也为临床有效控制和治疗MRSA感染提供有效的理论依据。另外，控制不同地区，不同来源的MRSA相互传播，对临床有效控制菌株耐药情况的加剧具有重要意义。4.3.2MLST分型结果MLST分型结果显示，81株金黄色葡萄球菌共分为14个STs型，其中ST398（等位基因3-35-19-2-20-26-39）型19株（29.2%），ST5型（等位基因1-4-1-4-12-1-1）10株（15.4%），ST1（等位基因1-1-1-1-1-1-1）和ST9（等位基因3-3-1-1-1-1-10）各5株（7.7%），ST898型（等位基因13-13-1-1-12-117-13）3株（4.6%），ST188型（等位基因3-1-1-8-1-1-1）、ST15型（等位基因13-13-1-1-12-11-13）、ST950型（等位基因1-4-1-4-12-121-10）和ST641（等位基因1-31-1-4-12-1-10）型各2株（3.1%），ST2632型（等位基因5-31-1-4-4-6-3）、ST692型（等位基因12-89-1-1-4-5-90）、ST1920型（等位基因1-1-1-157-1-1-1）、ST1916型（等位基因1-1-1-1-1-217-1）和ST1289型（等位基因22-1-14-109-12-4-31）各1株（1.5%）。本研究中发现10株新型MLST，已上传至MLST数据库，另有16株未能分型。由结果可知分离自广东省的金黄色葡萄球菌菌株更具菌株的多样性，14种STs型中有12种STs均在该地区发现，而分离自甘肃省的动物源性金黄色葡萄球菌的菌株只发现5种STs型，型别较广东省略单一（见表4.13）。34 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究图4.1管家基因PCR扩增Fig4.1:TheamplificationofhousekeepergenesM:1000bpDNAMarker;1-7:arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi及yqil基因目的条带M:1000bpDNAMarker;1-7:TheamplificationofarcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqil表4.13金黄色葡萄球菌MLST分型Table4.13MolecularcharacteristicsofmainclonesamongS.aureusstrains等位基因地区ST菌株数（MRSA数）arcCaroEglpFgmkptatpiyqil广东省甘肃省ST8983131311121171330ST95(4)3311111050ST263215311446310ST1882311811120ST15(1)111111114ST15213131112111320ST51014141211073ST95021414121211020ST6921128911459010ST1920111115711110ST39819335192202639613ST1916111111217101ST6412131141211020ST128912211410912431014.3.3spa分型结果81株金黄色葡萄球菌中的69株共被分为20种spa型，其中检测到最多的spa型为t034共13株（18.8%），其次为t803型6株（8.7%），t899和t114各5株（7.2%），t688和t002各4株（5.8%），t189、t8617和t010各3株（4.3%），t11641型2株（2.9%），t386、t091、t187、t1062、t2247、t286、t1255、t1490、t16824和t502各1株（1.5%），本研究中发现11株测序结果在官方网站http://www.ridom.de/spaserver中未找到对应型别的金黄色葡萄球菌，推测为新spa型，已上传至RIDOMspa数据库，另有12株菌株未能分型。对spa分型结果分析发现spa优势型别为t034，其次是t803、t899及t114，进一步分析发现MRSA和MSSA中均出现t899型和t034，35 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究但其中MRSA菌株以t899型为优势株，MSSA菌株则以t034型为优势株。由结果发现分离自广东省的金黄色葡萄球菌菌株更具菌株的多样性，20种spa型中单广东省就发现了14种型别，而分离自甘肃省金黄色葡萄球菌的菌株所分型别相对广东省比较集中，只发现6种spa型（见表4.14）。表4.14金黄色葡萄球菌spa分型Table4.14ThespaofmainclonesamongS.aureusstrains重复基因菌株数（MRSA比例地区序号重复编码特征数型数）（％）广东省甘肃省126-23-17-34-17-166t68845.840207-23-02-12-235t80368.760307-23-133t38611.510407-16-23-02-345t8995（4）7.250507-23-21-17-34-12-23-02-12-2310t0911（1）1.510607－23-12-21-17－346t1893（1）4.330708-16-02-25-02-25-02-25-34-24-24-2512t86173（2）4.3308186-371-12-25-255t1164122.920926-17-34-17-02-17-12-17-169t1871（1）1.5101026-23-17-34-17-20-17-12-17-1610t00245.8401108-16-02-25-02-25-34-24-259t03413（4）18.82111226-23-17-34-17-02-17-12-17-1610t106211.5101326-25-173t22471（1）1.5101407－23-13-34-16-34-33-138t28611.5101508-16-34-24-255t125511.5011607-16-34-33-135t1145（1）7.2051708-21-17-34-34-34-34-33-349t149011.5011807-13-34-34-34-33-137t1682411.5011926-17-34-17-20-17-12-17-169t01034.3032026-12－17-164t50211.5014.3.4SCCmec、spa及ST型之间的相关性本研究中有4株MRSA菌株被鉴定为ST9-SCCmecIVb-t899型为相对优势型别，有9株MRSA菌株分别被鉴定为ST398-SCCmecI-t034、ST398-SCCmecIVc-t034、ST398-SCCmecV-t034、ST1-SCCmecI-t114、ST2632-SCCmecIII-t091、ST398-SCCmecIII-t8617、ST398-SCCmecIII-t034、ST692-SCCmecIII-t2247、ST188-SCCmecIII-t189型，另有7株SCCmecIII型MRSA未获得MLST及spa分型，推测可能为新型型别，上述分型较分散，这可能是由于抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌的耐药性不断增加所致。结合上述MLST及spa分型结果发现MRSA的优势型别为ST9-t899，在MSSA的优势型别为ST398-t034，与国内其他地区及周边国家对MRSA进行MLST及spa分型的研究结果基本一致。樊润等(2014)对河南猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行MLST和spa分型，结果显示该地区MRSA的优势型别为ST9-t899；CuiS等(2009)对四川、河北及陕36 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究西等地区的猪源金黄色葡萄球菌进行分型结果显示该研究地区的主要优势型别为ST9-t899；王雪敏等(2013)对上海市猪源MRSA进行分型结果显示，该地区的主要流行型别亦为ST9-t899。4.3.5PVL基因检测结果81株金黄色葡萄球菌共检出PVL基因阳性菌株1株，携带率为1.2%，为MSSA，MLST及spa分型为ST1289-t16824，分离自甘肃地区。图4.2PVL基因PCR扩增Fig4.2:TheamplificationofPVLgenesM:500bpDNAMarker;1-16:部分金黄色葡萄球菌；5:PVL阳性菌株M:500bpDNAMarker;1-16:ThepartofS.aureusstrains；5:PVLpositivestrain4.4讨论本研究中MRSA的SCCmec分型的优势型别为SCCmecIII型，其次为SCCmecIVb型，这与国内其他研究报道结果相似，CuiS等(2009)对河北地区、湖北地区、四川地区及陕西地区的MRSA进行SCCmec分型菌株的优势型别为SCCmecIII，王雪敏等(2013)对上海地区猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分型其主要流行型别为SCCmecIVb，而人源菌株主要流行型为SCCmecII，目前尚未发现人源与猪源菌株之间相互传播的迹象。颜文光等(2015)的研究中发现人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行株以SCCmecIII型为主，猪源菌株主要以SCCmecIVb型为主。王登峰等(2016)对分离自新疆、北京、山东、浙江、内蒙及山西六个地区的金黄色葡萄球菌进行分型发现该地区MRSA的流行克隆株为SCCmecIV。闫红等(2016)对河南地区临床分离的MRSA进行SCCmec分型，发现其主要的流行克隆型以SCCmecIII为主，其次为SCCmecII型，并有少量SCCmecV型出现；王新等(2010)对陕西地区猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分型发现分离自该地区MRSA主要流行克隆株均为SCCmecIVb型；徐银海等(2016)的研究中MRSA分离株以SCCmecIII型为主，SCCmecII型次之；赵彩云等(2011)的研究显示临床MRSA的主要流行克隆株以SCCmecIII型为主，SCCmecII型次之，有少量的SCCmecIV型；吴宇(2016)研究显示其临床分离的MRSA主要流行株以SCCmecIII型为主，SCCmecII型次之，另有少量的SCCmecIV型和SCCmecV，MRSA序列型呈多样性，尤其是本试验中发现的SCCmecIVc和SCCmecV，表明在某一区域，动物源37 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究MRSA流行依赖于MSSA菌株获得SCC而不是特定MRSA菌株的长距离地理扩散。大量研究表明国内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec主要流行克隆株以SCCmecIII型为，与本研究结果一致。本研究发现SCCmec元件的菌株均存在多重耐药现象，且具有相同的耐药谱的菌株其SCCmec型别一致，但相同的SCCmec型别可有不同的耐药谱。对比发现SCCmecIV型的多重耐药现象比其他SCCmec型别更为明显更为严重，其中SCCmecIVb型多重耐药情况最为严重。这与王新等(2010)研究发现的猪源MRSA中SCCmecIVb型MRSA具有多重耐药的结论相似，但与余方友等(2006)人研究的人源MRSA的SCCmecIV型菌株对药物耐药性具有较大的差异，其原因需进一步探讨。本研究对分别分离自南方和北方各规模性养殖场的动物源性金黄色葡萄球菌分离株进行MLST分型研究，81株金黄色葡萄球菌中，19株为ST398型，比例为29.2%，为优势株，其次为ST5型10株（15.4%），再次之为ST1和ST9各5株（7.7%），进一步分析发现MRSA和MSSA中均出现ST9型和ST398，但其中MRSA菌株以ST9型为优势株，MSSA菌株则以ST398型为优势株，与刘洋等(2012)的研究结果一致。周臣清等(2014)研究中金黄色葡萄球菌以ST7型为主，ST9型次之；李自然等(2012)报道生鲜肉分离的金黄色葡萄球菌中最主要的优势型别为ST-7,其次为ST-188,另外ST-2094、ST-5等也比较常见;而在生牛乳中分离的金黄色葡萄球菌中,最主要的优势型别为ST-188,其次为ST-2094,另外ST-97、ST-965、ST-9等也比较常见；颜文光等(2015)研究结果显示猪源金黄色葡萄球菌菌株MLST分型检测到的优势ST型为ST9，牛源金黄色葡萄球菌菌株检测到的优势ST型为ST1920和ST630，羊源、鸭源菌株ST型检测到的优势ST型为ST5型。王登峰等(2016)对81株分离自不同地区的金黄色葡萄球菌进行MLST分型结果显示其分离株的优势型别为ST97，其次为ST398。寇芮等(2011)对南京猪源MRSA进行MLST型，结果显示优势菌株型别为ST9；樊润等(2014)对河南猪源MRSA进行耐药性及分子分型研究，MLST分型结果显示ST9为优势型别；WagenaarJA等(2009)报道的四川省猪源性MRSA主要以ST9型为主，王雪敏等(2013)对上海地区猪源MRSA进行MLST分型结果显示优势型别为ST9型；CUIS等(2009)对河北、陕西、四川及湖北等地的猪源MRSA优势型别为ST9型；SmithTC等(2009)对300多株分离自美国IowaandIllinois两个洲的猪源和人源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行MLST分型，只得到了ST398型。随着大量研究发现，不同地域的食源性动物流行的MRSA具有不同的分子型，但总的来说欧美地区食源性动物主要流行MRSA为ST398型，而亚洲包括中国在内的食源性动物主要流行MRSA为ST9型(庞璐等，2012)。据有关文献报道(李春辉等，2009)，我国大部分地区分离出的人源MRSA优势型别为ST239，ST5型次之；王雪敏等(2013)的研究中人源MRSA分离株的优势型别为ST5型，并没有发现ST239型别菌株。赵春江等(2011)对社区获得性耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Community-associatedmethicillin-resistantStaphylococcusaureus,CA-MRSA)与MSSA进行MLST分型结果显示MSSA中主要的克隆是ST398、ST188、ST1和ST7；而在CA-MRSA中主要的克隆是ST8、ST59、ST239。熊祝嘉等(2012)对中国7所教学医院耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的进行MLST分型显示114株MRSA中共发现8种MLST分子克隆型,其中ST239和ST5是主要的型别。这一结果从另一角度38 中国农业科学院硕士学位论文第四章金黄色葡萄球菌的分型研究发现人源MRSA和动物源性MRSA的主要流行克隆型并不一致，说明在我国，MRSA并没有广泛的从动物传播给人类以及动物源食品。对不同来源的动物源性金黄色葡萄球菌进行分析，发现分离广东省的金黄色葡萄球菌菌株更具菌株的多样性，14种STs型中有12种STs均在该地区发现，而分离自甘肃省的金黄色葡萄球菌的菌株只发现5种STs型，这可能与广东省菌株流动性较大且环境复杂性有较大的关系。对81株金黄色葡萄球菌进行spa分型结果分析发现spa优势型别为t034，其次是t803、t899及t114，进一步分析发现MRSA和MSSA中均出现t899型和t034，但其中MRSA菌株以t899型为优势株，MSSA菌株则以t034型为优势株。并对不同来源的动物源性金黄色葡萄球菌进行分析，发现分离自广东省的金黄色葡萄球菌菌株更具菌株的多样性，20种spa型中单广东省就发现了14种型别，而分离自甘肃省金黄色葡萄球菌的菌株所分型别相对广东省比较集中，只发现6种spa型，这可能由于spa分型不同与地理位置差异有关，且广东省菌株流动性大且环境较复杂。根据于贺文强等(2013)对2010-2011年我国十个城市葡萄球菌流行病学调查的研究结果有所不同，其研究结果显示MRSA的spa优势株为t-030、t-037、t-002、t-570、t-437及t-311，而MSSA的常见的型别为t-701、t-189、t-796、t-091、t-571；且其研究也指出spa分型不同与地理位置有关，如北京、重庆、武汉、西安、天津的主要型别为t-030，杭州、广州及沈阳地区主要型别分别为t-311、t-037及t-570，而上海主要是t-037和t-002。王敏等对分离自苏州的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行spa分型，结果显示spa-t037型在该研究地区流行程度高于spa-t030型,同时也提示国内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在不同医院、不同地区之间的流行具有地域差异性。杨毓环等(2017)对分离自福建的金黄色葡萄球菌进行spa分型，结果显示该地区的优势型别为t-091。沈林海等(2015)对杭州临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行spa分型得到的优势型别为t-311，其次为t-002和t-030。颜文光等(2015)对分离自江苏省的不同来源的金黄色葡萄球菌进行spa分型，结果显示人源金黄色葡萄球菌的优势型别为t-037、t-030、t-4549、t-189、t-034；猪源金黄色葡萄球菌的优势型别为t-899；牛源金黄色葡萄球菌的优势型别为t-286和t-2906；羊源、鸭源金黄色葡萄球菌的优势型别为t-002；食源性金黄色葡萄球菌的优势型别为t-377和t-127。有上述可得，金黄色葡萄球菌等spa分型结果不仅与地理位置有关，也与菌株的来源及生长环境有着密不可分的关系，但各型在各地区及环境中流行仍需引起足够重视，有必要进行深入研究来探索该流行型是否会通过环境或者动物性食品消费链传播给人。据报道PVL基因高水平表达可导致单核细胞坏死，随后释放炎性介质从而损害宿主细胞组织，PVL基因低水平表达则可导致单核细胞调亡(Duquenneetal,2010)。不同地区的金黄色葡萄球菌毒力基因PVL的携带率不同，徐海银等(2016)研究徐州地区临床分离的106株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力基因PVL的携带率为3.8%；代鹏飞等(2016)报道的金黄色葡萄球菌PVL的携带率为0；张征等(2010)研究报道的金葡菌的PVL携带率高达27%；陶晓亚等(2013)对陕西关中地区猪肉金黄色葡萄球菌的PVL携带率为34.95%；Udo等研究金黄色葡萄球菌的PVL携带率小于4.5%；Gillet等(2002)报道的人分离株的PVL检出率小于9%。据研究表明携带PVL的金黄色葡萄球菌具有强致病性的特点，其给临床感染性疾病的防控带来潜在的威胁，应当引起重视，虽然本研究中金黄色葡萄球菌携带率较低，但仍应进一步研究携带PVL基因金黄色葡萄球菌的耐药性及临床分布特点，为临床正确使用抗菌药物、积极采取预防措施控制感染提供准确依据。39 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论本文对分离自广东和甘肃省的81株金黄色葡萄球菌进行了耐药性、携带耐药基因情况及分子特征研究，结果如下：1.对81株金黄色葡萄球菌进行了14种药物药敏试验及14种耐药基因携带情况分析，所有菌株均呈多重耐药现象，其中氟苯尼考的耐药率高达80%以上；所有菌株携带至少5种以上的耐药基因，其中ermB、tetM、aac(6)/aph(2″)、femA和vanB五种耐药基因检测率为100%；floR、ermC和fexA三种耐药基因检出率也较高，分别为80.2％、77.8%和50.6％，而vanA、vanC、nor、tetA和tetB五种耐药基因检测率为0。2.对81株金黄色葡萄球菌进行了分子特征研究，其中MRSA菌株的优势型别为ST9-SCCmecIVb-t899型；MSSA的优势型别为ST398-t034；广东省主要优势型别为ST9-t899，甘肃省主要优势型别为ST398-t034。3.本研究中共检出PVL基因阳性菌株1株，携带率为1.2%，为MSSA，MLST及spa分型为ST1289-t16824，分离自甘肃地区。40 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢值此论文完成之际，特向尊敬的导师蒲万霞研究员表示真挚的谢意！本论文是在蒲万霞研究员的精心指导下完成的，从论文的选题、设计、实施至论文的撰写等每个阶段，都倾注了导师大量的心血，凝聚着导师的智慧！导师包容、宽厚的人品，严谨的治学态度，渊博的知识，对科学研究的执着精神，勤奋刻苦的工作作风等等都影响和激励我，成为我终身受用的宝贵财富，在此谨向尊敬的导师蒲万霞研究员致以崇高的敬意和由衷的感谢！衷心感谢课题组武中庸同学、侯晓师妹和徐结师弟。感谢他们与我一起讨论学术问题，一起解决实验问题，一起维护实验室的正常运行。感谢衣云鹏师兄、朱阵师兄对我实验的指导和帮助。最终感谢我的家人一直以来对我的支持和理解，你们是我努力奋斗的动力，是我前进的力量！再次感谢所有关心我帮助我的人，向你们致以我最真挚的敬意！49 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历赵吴静，女，汉族，1989年出生于河南省巩义市。2015年毕业于河南科技学院，同年考入中国农农业科学院研究生院基础兽医专业，研究方向是兽医微生物方面。目前，本人已掌握了微生物学、分子生物学等方面的知识和实验技能。在研究生期间，发表论文2篇，授权实用新型专利一项，一篇在投。论文发表情况：1.赵吴静,徐进强,武中庸.苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌研究进展[J].中国畜牧兽医,2017,44(8):2458-2464.2.赵吴静,倪春霞,武中庸等。乳源金黄色葡萄球菌耐药性分析及分型[J].中国草食动物科学.2018(02):48-52.3.实用专利：赵吴静,蒲万霞,徐进强.试管架专利号：ZL201621136618.14.实用专利：赵吴静,蒲万霞,徐进强.锥形瓶架专利号：ZL201621136367.750