市售肉菜产ESBLs和碳青霉烯酶肠杆菌的分子流行病学研究

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学校代码：10564学号：2014307340分类号：S859.79＋6密级：硕士学位论文市售肉菜产ESBLs和碳青霉烯酶肠杆菌的分子流行病学研究姚旭第一指导教师：刘健华教授第二指导教师：学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：无答辩委员会主席：丁焕中教授中国·广州2016年6月 摘要随着抗生素的广泛使用，肠杆菌耐药成为全球面临的突出问题。细菌耐药性的产生使耐药肠杆菌对目前临床上使用的抗生素不再敏感，包括第三、四代头孢菌素、碳青霉烯类药物等，产ESBLs（Extended-spectrumβ-lactamases）和碳青霉烯酶是细菌对上述药物产生耐药性的主要机制之一，也是目前耐药性研究的热点之一。对不同来源的抗生素耐药菌研究中，食品源研究尚不多见，本文对蔬菜源及鸡肉源大肠杆菌耐药性及其ESBLs和碳青霉烯酶基因的分子流行病学进行初步研究，以了解蔬菜及动物食品中耐药肠杆菌的流行情况，为防止耐药基因的传播提供依据。2014~2015年，从广州各大市场以及超市随机采集了395份蔬菜样品和200份鸡肉样品，分离得到60株大肠杆菌（蔬菜）和134株大肠杆菌（鸡肉）。另外，从395份蔬菜样品中用选择性平板筛选出33株产ESBLs肠杆菌，包括12株大肠杆菌、19株肺炎克雷伯菌、1株阴沟肠杆菌和1株弗氏柠檬酸杆菌。用琼脂稀释法对随机分离得到的大肠杆菌进行药物敏感性检测，结果显示肉源大肠杆菌对各种药物的耐药情况比蔬菜源更严重。33株蔬菜源产ESBLs肠杆菌对氨苄西林和头孢噻肟全部耐药，对头孢喹肟、四环素、磷霉素、多西环素、喹乙醇、复方新诺明的耐药率均超过50%，对亚胺培南全部敏感。33株蔬菜源产ESBLs肠杆菌共检测到7种不同亚型的CTX-M基因，分别是blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-14、blaCTX-M-24、blaCTX-M-38和blaCTX-M-65，检出率最高的是blaCTX-M-15(n=10)，其次是blaCTX-M-55（n=7）。不同蔬菜中blaCTX-M基因的检出率分别为黄瓜10.4%（12/115）、番茄3.3%（3/90）、生菜13.0%（13/100）和胡萝卜5.7%（5/90）。从生菜样品中检测到一株产KPC-2的大肠杆菌TS79，多序列位点分型结果为ST877型。该基因位于一个大小约54kb的质粒上，复制子分型未成功。药物敏感性结果显示TS79对黏菌素和替加环素敏感，对其他药物全部耐药。另外从超市生鲜鸡肉中分离到的一株亚胺培南耐药大肠杆菌THSJ02，多序列位点分型结果为ST167型，除对多西环素和替加环素敏感以外，对其余药物全部耐药，PCR结果显示该菌携带mcr-1、blaNDM-9、floR、fosA3、rmtB和blaCTX-M-65基因。经接合试验、S1-PFGE和southern杂交证实mcr-1基因位于IncI2型质粒上，rmtB，blaCTX-M-65和fosA3基因位于F33:A–:B–质粒上，而blaNDM-9和另一个fosA3基因位于一个约100kb的未知质粒上。I 本研究结果表明蔬菜和动物性食品中存在耐药肠杆菌，蔬菜源产ESBLs肠杆菌中以产CTX-M-15和CTX-M-55居多，且存在多重耐药现象。这是首次在蔬菜中检出对大部分抗生素耐药的产KPC酶的大肠杆菌及在鸡肉中检出同时携带blaNDM-9和mcr-1基因的大肠杆菌。因此，我们应当重视食品安全隐患，避免其成为耐药基因传播的途径，以保障人类健康。关键词：食品源；肠杆菌；ESBLs；碳青霉烯酶；blaCTX-M；II MolecularEpidemiologyofESBLs-andCarbapenemases-producingEnterobacteriaceaefromRetailMeatandVegetablesYaoXu(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract:Withthewideuseofantimicrobialagents,antimicrobialresistanceamongEnterobacteriaceaehasbecomeaseriousproblemintheworld.Theincreasingantimicrobialresistancemakestheinfectioustreatmentnolongereffective,includingthethirdandforthgenerationcephalosporinsaswellascarbapenems,producingESBLsandcarbapenemasesarethemajormechanismsforEnterobacteriaceaetoexhibitresistancetoabove-mentionedantimicrobialagents.PreviousstudiesaboutESBLsandcarbapenemasesmainlyfocusonEnterobacteriaceaefromhumanclinicsandanimals,however,studiesaboutEnterobacteriaceaefromfoodarestillrareandneededtobeinvestigated.TheaimofthisstudywastoinvestigateantibioticsresistanceandthedisseminationofESBLs-andcarbapenemases-producinggenesamongEnterobacteriaceaeisolatesfromvegetablesandretailmeat,toprovideabasisfortherationaluseofantimicrobialagentsandtopreventfurtherspreadofdrugresistance.395vegetablesand200rawchikensampleswererandomlycollectedfromdifferentmarketsandsupermarketsinGuangzhoubetween2014and2015,60and134E.coliwererecoveredfromvegetableandmeatsamples,respectively.33ESBLs-producingEnterobacteriaceaeisolateswereobtainedfrom395vegetablesamplesselectedbyCHROMagarplates,including12E.coliisolates,19Klebsiellapneumoniaeisolates,1Enterobactercloacaeisolates,and1Citrobacterfreundiiisolates.AntimicrobialsusceptibilitytestoftheE.colifromvegetablesandmeatwereperformedbytheagardilutionmethod.Escherichiacolifromrawchickenshowedhigherresistanceratescomparedtothosefromvegetables.All33ESBLs-producingEnterobacteriaceaeisolatesshowedresistancetoampicillinandcefotaxime,morethan50%ofthe33isolateswereresistanttocefquinome,tetracycline,penicillin,doxycycline,olaquindox,andcotrimoxazole.Allofthe33ESBLs-producingEnterobacteriaceaeisolatesweresusceptibletoimipenem.SeventypesofCTX-Mgenesweredetectedfrom33ESBLs-producingEnterobacteriaceae,includingblaCTX-M-3,blaCTX-M-III 15,blaCTX-M-55,blaCTX-M-14,blaCTX-M-24,blaCTX-M-38andblaCTX-M-65,amongwhichblaCTX-M-55(n=7),blaCTX-M-15(n=10)beingmostdominanttypes.ThedetectionratesofCTX-Mgenesfromdifferentvegetabletypeswere:cucumbers,10.4%(12/115);tomatoes,3.3%(3/90);lettuces,13%(13/100);carrots,5.6%(5/90).IsolateTS79harbouringblaKPC-2belongedtosequencetypeST877bymultilocussequencetypingwasrecoverdfromlettuces,exhibitingresistancetoalltestedantimicrobialagentsexceptcolistinandtigecycline.blaKPC-2waslocatedonanon-typableplasmidofroughly54-kb.THSJ02recoveredfromachickenwingsampleinthesupermarketwasresistanttoalltestedantimicrobialdrugsexceptdoxycyclineandtigecycline.THSJ02belongedtosequencetypeST167bymultilocussequencetyping.PCRandSangersequencingconfirmedthatthisstraincarriedblaNDM-9,mcr-1,fosA3,rmtB,blaCTX-M-65andfloR.Conjugation,S1-pulse-fieldgelelectrophoresis,andsouthernhybridizationresultsshowedthatmcr-1waslocatedonanIncI2plasmid,blaNDM-9andfosA3werecarriedbyanon-typableplasmidofroughly100-kb,whereasrmtB,blaCTX-M-65,andasecondcopyoffosA3werelocatedonaF33:A-:B-plasmid.TheresultsdemonstratedthatthepotentialthreatsfromresistantEnterobacteriaceaeinvegetablesandanimalfoodscouldnotbeneglected.CTX-MenzymesdistributedinEnterobacteriaceaewithCTX-M-55andCTX-M-15beingdominantandtheCTX-M-producingEnterobacteriaceaeweremultidrugresistant.ItwasthefirstdetectionofKPC-producingEscherichiacoliinvegetables,thisEscherichiacolistrainshowedresistancetomostantibioticexceptcolistinandtigecycline.OneEscherichiacoliisolaterecoveredfromchickenmeatcarryingblaNDM-9andmcr-1wasresistanttocarbapenemandcolistin.Thus,weshouldpaymoreattentiontotheantibioticsresistanceoffoodborneEnterobacteriaceae,topreventitfrombecomingonemainroutetospreadantimicrobialresistancegenesthroughouttheworldforthesakeofpublichealth.Keywords：Foodborne;Enterobacteriaceae;ESBLs;carbapenemases;blaCTX-MIV 英文缩写对照表CTXCefotaxime头孢噻肟FOXCefoxitin头孢西丁AMIAmikacin阿米卡星STRStrepomycin链霉素CLColistin黏菌素FLRFlorfenicol氟苯尼考IPMImipenem亚胺培南FOSFosfomycin磷霉素KPCKlebsiellapneumoniaecarbapenemase肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶NDMNewDelhimetallo-β-lactamase新德里金属β-内酰胺酶CRECarbapenem-resistantEnterobacteriaceae碳青霉烯类抗生素耐药MICMinimumInhibitoryConcentration最小抑菌浓度ODOpticaldensity光密度CFUColocy-FormingUnit菌落形成单位PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应dNTPsDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbromide溴化乙锭ESBLsExtended-Spectum-beta-Lactamases超广谱β-内酰胺酶MDRMultidrugresistant多重耐药ISInsertionSequence插入序列PFGEPlusFieldGelElectrophoresis脉冲场凝胶电泳MLSTMultilocusSequenceTyping多位点序列分型ATCCAmericantypeculturecollection美国模式培养物集存库EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸SDSSodiumDodecylSulphate十二烷基硫酸钠DMFDimethylformamideN,N-二甲基甲酰胺CLSItheClinicalandLaboratoryStandardInstitute美国临床实验室标准化委员会NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国家生物技术中心V 目录1前言.....................................................................................................................................12材料与方法.........................................................................................................................62.1材料..................................................................................................................................62.1.1样品来源..................................................................................................................................62.1.2菌株及载体.............................................................................................................................62.1.3抗菌药物及药敏纸片............................................................................................................62.1.4培养基及其配制.....................................................................................................................72.1.5试剂..........................................................................................................................................82.1.6主要仪器设备.........................................................................................................................82.1.7主要试剂的配制.....................................................................................................................92.2方法............................................................................................................................................112.2.1细菌的分离鉴定与保存......................................................................................................112.2.2耐药基因的PCR检测及其他相关基因检测.................................................................132.2.3琼脂稀释法敏感性试验......................................................................................................162.2.4大肠杆菌MLST分析.........................................................................................................172.2.5接合试验及阳性接合子复制子分型................................................................................193结果与分析.......................................................................................................................283.1肠杆菌的分离与鉴定....................................................................................................283.1.1大肠杆菌的分离...................................................................................................................283.1.2产CTX-M肠杆菌分离鉴定..............................................................................................283.2药物敏感性试验............................................................................................................313.2.1随机分离大肠杆菌药敏试验.............................................................................................313.2.2肠杆菌药敏试验...................................................................................................................313.3肉菜产KPC、NDM酶大肠杆菌的分子特性.............................................................334讨论...................................................................................................................................374.1鸡肉和蔬菜源大肠杆菌药物敏感性比较....................................................................374.2蔬菜源产ESBL肠杆菌流行情况................................................................................374.3产碳青霉烯酶大肠杆菌分子特性................................................................................38VI 5结论...................................................................................................................................41致谢......................................................................................................................................42参考文献..............................................................................................................................43附录......................................................................................................................................50VII 1前言自1928年发现青霉素以来，各种类型抗生素相继被开发并应用于人医和兽医临床。抗生素和相关药物的广泛使用让人类得以远离许多疾病，但是近几十年来，抗菌药在临床的不合理使用，促使耐药菌迅速产生，大大增加了某些感染性疾病的治疗难度，给临床医生和科研人员带来了极大的挑战。现如今，细菌耐药性已经成为全球公共健康的一个巨大威胁，影响当前人类乃至后代的健康，也成为了21世纪主要的公共卫生安全的研究热点之一。细菌产生耐药性的机理有以下几种：产生灭活酶使药物失活、改变膜的通透性、作用靶位结构的改变、主动排外作用以及改变代谢途径。青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类药物均属于β-内酰胺类抗生素，主要通过改变靶位点-青霉素结合蛋白（PBPs），或者产β-内酰胺酶等反应使自身对β-内酰胺类药物产生耐受性，其中产β-内酰胺酶水解抗生素是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制（Bushetal.,2010）。当然，一些多重耐药的菌株耐药性的产生并非仅由其中一种机制引起，而是多种耐药机制共同作用下造成的，这也会使得这些菌株的耐药情况尤为严重（Wozniaketal.,2012）。编码β-内酰胺酶的基因可以通过质粒的接合、转化、转导等形式进行水平转移，这使得产β-内酰胺酶引起的耐药现象成为当前人医及兽医研究的热门话题之一。超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）主要可分为四大类群：CTX-M型、OXA型、TEM型和SHV型（Philipponetal.,1989）。1989年，在德国慕尼黑首次发现一株对头孢噻肟具有很高的水解活性的大肠杆菌，并将其命名为CTX-M-1（Bauernfeindetal.,1990）。此后，CTX-M型酶被相继发现，且种类迅速增加，到目前为止，已经发现了超过170多种CTX-M酶（http://www.lahey.org/studies），成为了ESBLs的主要流行型，并对临床治疗造成不可忽视的影响（Bonnet,2004；Naseeretal.,2011）。根据CTX-M酶氨基酸序列的差异（大于94%的相同序列认为是一个群，小于90%的相同序列认为是不同的群）分为6个群：CTX-M-1，CTX-M-2，CTX-M-8，CTX-M-9，CTX-M-25和KLUC群（D'Andreaetal.,2013）。目前发现的blaCTX-M主要位于质粒上，一些研究认为质粒介导的CTX-M酶起源于克雷吕沃尔菌属染色体编码的固有头孢菌素酶（Decousseretal.,2001）。大部分CTX-M酶对头孢噻肟具有水解活性，对头孢他啶敏感，而某些1 CTX-M酶，例如CTX-M-15、-55、-64、-93、-123和-132等，对头孢他啶表现有很高的水解能力。可接合性质粒和一些转座子为耐药基因的传播提供了良好的载体，加之人类在全球范围内的活动，给CTX-M的大范围流行提供了机会（vonWintersdorffetal.,2014；Woodfordetal.,2011）。大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等肠杆菌作为自然界广泛存在的条件致病菌，常被作为产CTX-M酶的研究对象。国内外学者对CTX-M的流行情况展开一系列的调查，搜集大量的耐药数据，不同的国家和地区CTX-M流行广泛并略有差异，在全球范围内，在人源、动物源以及环境源大肠杆菌中CTX-M-14和CTX-M-15是最流行的CTX-M型（Cantónetal.,2012；Livermoreetal.,2006；DAndreaetal.,2013），在我国，动物源大肠杆菌中CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-65是最主要的流行型（Zhengetal.,2012；Raoetal.,2014；Sunetal.,2010；Yangetal.,2015）。胡付品等2014年检出的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株中，大肠杆菌占55.8%，克雷伯菌属占29.9%，且菌株耐药性呈增长趋势（胡付品等，2015）。中国学者对河北、重庆和海南等医院分离的126株ESBLs阳性菌中CTX-M占96.9%，其中CTX-M-1群和CTX-M-9群分别占66.9%和54.6%，CTX-M-9群中主要是CTX-M-65和CTX-M-14，CTX-M-1群中主要是CTX-M-3和CTX-M-15（Shietal.,2015）。对分离自社区和医院的1,168株产ESBLs的肠杆菌调查发现96.2%为CTX-M阳性，其中，blaCTX-M-14、blaCTX-M-55和blaCTX-M-15的检出率分别为46.8%、24.8%和18.2%（Xiaetal.,2014）。Potz等对英国16家医院分离的19,252株细菌调查发现，产CTX-M的菌株检出率（1.7%）高于其他产ESBLs型的菌株（0.6%），其中大肠杆菌和沙门氏菌中产CTX-M菌株占的比例分别为50.9%和81.9%（Potzetal.,2006）。加拿大Peirano对某一医疗中心分离的171株产CTX-M的大肠杆菌调查中，CTX-M-15（86.5%）和CTX-M-14（9.9%）是最主要的流行型，其次是CTX-M-3型（2.9%）（Peiranoetal.,2010）。Agyekum等在加纳医院病人中获得的101株ESBLs分离株中，63株检测到CTX-M型，其中62株是CTX-M-15的阳性株（Agyekumetal.,2016）。动物源相关报道也比较多，欧洲国家动物源大肠杆菌主要流行CTX-M-14/-15/-1/-3等亚型（Madecetal.,2012；Bardonetal.,2012；Dolejskaetal.,2011），法国境内动物源大肠杆菌主要流行CTX-M-1、CTX-M-15和CTX-M-14等（Hartmannetal.,2012；Madecetal.,2008；Madecetal.,2012）。亚洲，日本动物源大肠杆菌主要流行CTX-M-2型（Hiroietal.,2012；Asaietal.,2011），韩国主要流行CTX-M-14型（Limetal.,2 2009），我国主要有CTX-M-14、-55、-65和-27等（Raoetal.,2014；Maetal.,2012；Zhengetal.,2012）。动物源食品作为食物链中的一环，加大了人类与动物的联系，成为产ESBL肠杆菌的传播媒介，严重威胁人与动物的健康（Carattolietal.,2008）。目前已经有越来越多报道表明，ESBL基因、质粒及菌株可通过食物链传播（Leverstein-vanetal.,2011；deBeenetal.,2014；Kluytmansetal.,2013），这也让更多研究人员重视与食物链相关的食品和食品动物对人类健康的影响。相对于人源和动物源细菌中CTX-M的研究，食品源细菌中CTX-M的报道比较少。土耳其的研究人员从生鸡肉、生牛奶等样品中分离到了各类产ESBLs肠杆菌，检测出的CTX-M基因中，97.2%是blaCTX-M-1，剩余则是blaCTX-M-8（Tekineretal.,2016）。越南有关动物食品的报道称，鸡肉、猪肉和鱼肉样品中，鸡肉的产ESBLs/pAmpC大肠杆菌分离率最高，ESBLs/pAmpC阳性基因中，CTX-M-9和CTX-M-1群分别占31.2%和29.8%（Nguyenetal.,2016）。国内来自陕西的报道与上述的结果基本相符，从陕西省采集的零售食品中分离的产ESBLs肠杆菌中，以CTX-M-9和CTX-M-1群居多（Xietal.,2015）。此外，耐药基因在农业上的传播也逐渐引起关注。Ruimy等人发现，蔬菜也容易受到耐药基因的污染（Ruimyetal.,2010）。研究人员认为，生长在土壤中或土壤表面的水果蔬菜可能会受到土壤中的微生物的污染，表面附着含耐药基因的菌株，而食用时的清洗不当等因素，会让蔬菜水果中的耐药基因进入人体而影响健康（Ruimyetal.,2010）。某些国家或地区在蔬菜生长期没有严格的灌溉标准，直接采用未处理的有机肥或水源，导致土壤受耐药菌污染，然后通过食物链进入人体（Maraetal.,2010）。从2000年以前的相关报道看来，蔬菜中耐药肠杆菌的检出率不高，且耐药水平较低（Osterbladetal.,1999）。2011年，产志贺毒素大肠杆菌在德国大面积爆发，病原来自芽菜中的产ESBLs的大肠杆菌（Buchholzetal.,2011）。近年来，对蔬菜的研究也逐渐增多，耐药菌的检出率呈上升趋势，且CTX-M基因的阳性率也在增高。韩国的一篇报道中对189份即食蔬菜进行了研究，分离得到了产ESBLs的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，分离率为10.1%，CTX-M阳性菌株属于CTX-M-1或-9群，主要亚型是CTX-M-15、-14和-55（Kimetal.,2015）。位于荷兰的阿姆斯特丹的学者在15种蔬菜，119个样品中检出了三株含blaCTX-M-15的肠杆菌,一株blaCTX-M-1，两株CTX-M-9群的菌株（Reulandetal.,2014）。蔬菜的进出口对耐药基因的传播也有一定作用，瑞士研究人员发现，来源于印度蔬菜中的大肠杆菌主要携3 带blaCTX-M-15，来源于泰国的蔬菜CTX-M-55的量超过CTX-M-14，这与之前在印度和泰国的临床分离株中的检测结果相似（Zurfluhetal.,2015）。国外在蔬菜中检出CTX-M基因型主要是CTX-M-15型，这与其他来源的亚型相符（Zurfluhetal.,2015）。国内对蔬菜的研究还鲜有报道，因此本文对蔬菜源大肠杆菌的ESBL基因型进行了初步研究。除产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌外，近年来，对产碳青霉烯酶肠杆菌（CarbapenemaseproducingEnterobacteriaceae，CPE）的关注也越来越多。CPE是一种能够对碳青霉烯类抗生素产生耐药的细菌，而碳青霉烯类药物是治疗众多严重感染的少数有效药物之一（El-Gamaletal.,2010）。鉴于它的强效抗菌能力、低毒性以及稳定性，碳青霉烯类药物不仅是治疗超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶的多重耐药肠杆菌引起感染的最有效抗菌药物（Woodfordetal.,2004；Poireletal.,2011），甚至被称为治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线（Kaczmareketal.,2006）。在2000年以前，耐碳青霉烯肠杆菌还未构成一定威胁，但由于对该类药物的频繁使用，国内外对CRE的报道日益增多（Gonzalez-Torralbaetal.,2016；Skurniketal.,2016；Braunetal.,2016；Sawetal.,2016）。肠杆菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制是由于碳青霉烯酶的产生，其中又以KPC（Klebsiellapneumoniaecarbapenemase）型和NDM型碳青霉烯酶最为常见。KPC型酶于1996年首次从肺炎克雷伯菌中分离得到（Yigitetal.,2001），能够水解青霉素、头孢类和碳青霉烯类药物。1997年，携带KPC-2型基因的肺炎克雷伯菌在纽约的医院中被发现（Bradfordetal.,2004），随后几年，KPC基因的传播更加广泛（Bratuetal.,2005；Schwaberetal.,2011;Partridgeetal.,2015），目前KPC的亚型已有24种(http://www.lahey.org/Studies）。KPC基因多发现于肺炎克雷伯菌属，后逐渐扩张到其他肠杆菌科细菌，其中包括沙门氏菌（Miriagouetal.,2003）、阴沟肠杆菌（Dortetetal.,2008）以及大肠杆菌（Deshpandeetal.,2006）等。最早报道产KPC酶大肠杆菌的国家是美国，2006年，美国Deshpande等人发现了3株产KPC-2型碳青霉烯酶的大肠杆菌（Deshpandeetal.,2006），同年，以色列学者也发现了几株产KPC-2型酶的大肠杆菌，且这几株大肠与美国发现的大肠埃希菌存在同源性，这也证实了产碳青霉烯酶大肠杆菌全球性传播的可能性（Navon-Veneziaetal.,2006）。根据目前的文献报道，在许多国家和地区如中国、美国、意大利、以色列、澳大利亚等，均发现了产KPC-2/3型酶的ST131菌株，这类大肠埃希菌已经成为全球主要的4 流行型（Peiranoetal.,2014；Accoglietal.,2014；Adleretal.,2015；Caietal.,2014；Partridgeetal.,2015）。NDM属于B类碳青霉烯酶，可以水解青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类药物，与KPC不同的是，NDM不能水解氨曲南。2009年，Yong等（2009）人发现了一株产新型金属β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌和一株产同样酶的大肠杆菌，这两株菌都源于印度新德里，于是将该新型酶命名为NDM-1（NewDelhimetallo-β-lactamase1），而后，Castanheira等（2011）发现，早在2006年，产NDM-1肠杆菌就已经在印度医院出现。随后，超过20个国家报道了NDM-1耐药菌引起的感染病例，遍布北美洲、亚洲、大洋洲、欧洲等多个国家和地区（Nordmannetal.,2011）。目前，共有13种NDM-1的突变体（从NDM-2、NDM-3到NDM-14）（http://www.lahey.org/Studies），主要出现在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中。大肠杆菌中最流行的还是NDM-1型酶，散在检出NDM-4、NDM-5、NDM-6和NDM-9等不同突变型。（Nordmannetal.,2012；Hornseyetal.,2011;Williamsonetal.,2012;Yaoetal.,2016）blaNDM基因多位于质粒上，且携带该基因的耐药菌常含有多个质粒，质粒上耐药基因的协同作用也使blaNDM阳性菌株具有超强的耐药性（Walshetal.,2011）。携带blaNDM基因的质粒型主要是IncA/C、IncF、IncL/M或未知型质粒（Poireletal.,2011；Kumarasamyetal.,2010；Nordmannetal.,2011）。相比人医临床的产碳青霉烯酶大肠杆菌的研究，动物源或动物食品源的相关报道并不多。此前，Fischer等（2013）在农场中发现了产碳青霉烯酶的沙门氏菌，后来Shaheen等（2013）在伴侣动物身上分离得到了产blaNDM-1基因的大肠杆菌。Abdallah等（2015）在106份零售鸡肉样品中分离得到了12株产NDM酶的肠杆菌，但未检出大肠杆菌。目前能有效治疗耐碳青霉烯类肠杆菌引起的感染的方案是使用替加环素或黏菌素，或者是这两种药物与其他抗生素联合使用（Halabyetal.,2013；Falagasetal.,2011）。产碳青霉烯酶肠杆菌的流行趋势致使黏菌素的使用更加频繁，许多国家将其用于农业生产养殖（Kovalchuketal.,2013），最终导致了黏菌素抗性基因mcr-1的出现（Liuetal.,2016）。最近，中国学者Du等（Duetal.,2016）从病人体内分离得到同时携带blaNDM-5和mcr-1的肺炎克雷伯菌，两个基因位于不同质粒上，该菌几乎对所有的试验药物都不敏感。5 近年来，食品动物源产ESBLs肠杆菌引发了许多公共健康问题，而根据产碳青霉烯酶基因的传播现状，我们可以预计未来碳青霉烯类耐药肠杆菌菌在医院、社区及环境中的危害之严重（Grundmannetal.,2010；Pateletal.,2013）。由于国际贸易使得食品和蔬菜在不同的国家之间流通，携带耐药菌的食品和蔬菜给耐药性的传播提供一个媒介，使得耐药性传播更为迅速。另外食品能够直接与人类接触，对人类的危害巨大，所以食品源耐药菌应该引起我们足够的重视。因此，有必要对食品源肠杆菌的ESBLs和碳青霉烯酶基因进行分子流行病学调查。本文对分离自广州的蔬菜和零售肉食品的肠杆菌的CTX-M、NDM和KPC进行调查研究，为控制食品源耐药基因的流行提供科学依据。2材料与方法2.1材料2.1.1样品来源2014年至2015年采集广州天河区、越秀区、海珠区、白云区、荔湾区等农贸市场和超市的黄瓜、番茄、生菜、胡萝卜和零售生鸡肉。2.1.2菌株及载体标准菌：大肠杆菌ATCC®25922为本实验室保存。工程菌：大肠杆菌C600、DH5α为本实验室保存。2.1.3抗菌药物及药敏纸片氨苄西林（Ampicilin）中国药品生物制品检定所纯度86.0%头孢他啶（Ceftazidime）中国药品生物制品检定所纯度84.2%头孢噻肟（Cefotaxime）中国药品生物制品检定所纯度89.3%头孢喹肟（Cefquinome）中国药品生物制品检定所纯度81.5%头孢曲松（Ceftriaxone）广州白云山制药厂纯度85.0%头孢唑啉（Cefazolin）中国药品生物制品检定所纯度99.3%头孢西丁（Cefoxitin）海口市制药厂有限公司纯度89.0%庆大霉素（Gentamicin）中国药品生物制品检定所效价633U/mg阿米卡星（Amikacin）中国药品生物制品检定所效价655U/mg6 链霉素（Strepomycin）山东鲁抗医药有限公司效价720U/mg安普霉素（Apramycin）濮阳泓天威药业有限公司效价599U/mg环丙沙星（Ciprofloxacin）中国药品生物制品检定所纯度84.9%新霉素（Neomycin）中国兽医药品监察所纯度70.3%黏菌素（Colistin）山东鲁抗医药股份有限公司纯度90.0%氯霉素（Chloramphenicol）中国药品生物制品检定所纯度99.5%氟苯尼考（Florfenicol）浙江海翔药业纯度99.5%磺胺甲噁（SµLfadimidine）中国药品生物制品检定所纯度90.0%甲氧苄啶（Trimethoprim）中国药品生物制品检定所纯度90.0%盐酸四环素（Tetracycline）宁夏启元药业有限公司纯度95.0%磷霉素（Fosfomycin）东北制药总厂纯度95%以上多西环素（Doxycycline）中国药品生物制品检定所纯度94%亚胺培南（Imipenem）杭州默沙东制药有限公司纯度50%喹乙醇（Olaquindox）中国药品生物制品检定所纯度98%美罗培南（Meropenem）中国药品生物制品检定所纯度98%2.1.4培养基及其配制麦康凯琼脂（MacConkeyAgar），伊红美兰琼脂（EMBAgar），LB琼脂（LBAgar），LB肉汤（LBBroth），水解酪蛋白琼脂（MHAgar），水解酪蛋白肉汤（MHBroth）含头孢噻肟（4µg/mL）的LB固体培养基：将高压灭菌后的LB琼脂培养基降至50～60℃，加入浓度为5120µg/mL的头孢噻肟，使其终浓度为4µg/mL，分装入灭菌平皿，凝固后4℃保存。含头孢噻肟（2µg/mL）的LB液体培养基：在已灭菌的LB液体培养基中加入头孢噻肟至终浓度为2µg/mL，4℃保存。含亚胺培南（2µg/mL）的LB固体培养基：将高压灭菌后的LB琼脂培养基降至50～60℃，加入亚胺培南使其终浓度为2µg/mL，分装入灭菌平皿，凝固后4℃保存。7 含链霉素（3000µg/mL）亚胺培南（2µg/mL）双药的LB液体培养基：在已灭菌的LB液体培养基中加入磷霉素至终浓度为3000µg/mL，4℃保存。30%甘油肉汤：2.5gLB肉汤粉溶解于100mL30%甘油中，高压灭菌待用。2.1.5试剂TMTaqDNA聚合酶：TaKaRaTaq（5U/μL）购自宝生物工程有限公司。dNTPMixture（2.5mmol/L）：购自宝生物工程（大连）有限公司。琼脂糖（Biowestagarose，regµLar）、溴化乙锭（EB）购自基因公司。低熔点琼脂糖（MegaBase琼脂糖）、PFGE级琼脂糖购自BIO-RAD公司S1核酸酶、S1-Buffer、XbaI内切酶、10×Mbuffer、0.1%BSA，购自宝生物工程（大连）有限公司。蛋白酶K购自美国Sigma公司。DNA分子量标准：DL2000（50ng/μL）、DL5000（50ng/μL）、λ-HindⅢdigest（50ng/μL）购自宝生物工程（大连）有限公司。DNA纯化试剂盒E.Z.N.A.TMGelExtractionKit，质粒快速提取试剂盒E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKit为Omega公司产品。地高辛DNA标记和检测试剂盒（DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI），Whatman3MM滤纸，带正电荷尼龙膜购自瑞士罗氏（Roche）公司。十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris碱、硼酸（AR）、冰醋酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、马来酸、浓盐酸、无水乙醇、冰醋酸、吐温20等购自广州化学试剂厂。2.1.6主要仪器设备THZ恒温震荡箱广州神华生物技术有限公司电子分析天平AE150瑞士METTLER公司微量移液器德国Eppendorf公司8 电动移液枪德国Eppendorf公司超净工作台苏州净化设备有限公司显微镜奥林巴斯公司HHVE-50高压灭菌锅日本HIRAYMA公司DNP-9272电热恒温培养箱上海申贤恒温设备厂台式高速离心机德国eppendorf公司电泳凝胶成像系统美国BIO-RAD公司EppendorfMastercycler扩增仪德国eppendorf公司超声仪奥林巴斯公司DNP-9272电热恒温培养箱上海申贤恒温设备厂pH计Delta320，MettlerToledo恒温水浴箱上海恒温仪器设备厂产品高速冷冻离心机Beckman公司脱色摇床江苏海门市麒麟医用仪器厂Elix100纯净水装置Millipore公司酶标仪Beckman公司ChefMapperXA脉冲场电泳仪美国BIO-RAD公司分子杂交炉上海新芝生物技术研究所；紫外交联仪新芝生物科技股份有限公司。2.1.7主要试剂的配制（1）脉冲场凝胶电泳用试剂①1MTris-HCl，pH8.0121.1gTris，溶解，加浓盐酸调pH至8.0，定容至1L，高压灭菌，降温后再调pH至8.0。②0.5MEDTA，PH8.0称取186.1gNa2EDTA·2H2O，充分搅拌，缓慢加NaOH调pH至8.0，定容至1L，高压灭菌，降温后再调pH至8.0。③0.5×TBE9 16.2gTris，8.25g硼酸，1.116gNa2EDTA·2H2O，加去离子水至3L。④20%十二烷基磺酸钠（SDS）溶液20gSDS，加入双蒸水，68℃水浴助溶，用浓盐酸调pH值至7.2，加入双蒸水定容至100mL，室温保存。⑤1×TEbuffer：10mMTris:1mMEDTA，pH8.0取10mL1MTris-HCl（pH8.0）与2mL0.5MEDTA（pH8.0）稀释到1000mL，高压灭菌待用。⑥细胞悬浮液（CSBbuffer）：100mMTris:100mMEDTA，pH8.0100mL1MTris-HCl（pH8.0）与200mL0.5MEDTA（pH8.0），稀释到1000mL，高压灭菌待用。⑦细胞裂解液（CLBbuffer）：（50mMTris:50mMEDTA，pH8.0，1%N-十二烷基肌氨酸钠）50mL1MTris-HCl（pH8.0）与100mL0.5MEDTA（pH8.0），10gN-十二烷基肌氨酸钠，稀释到1000mL，高压灭菌待用。⑧蛋白酶K的配制：用2mL灭菌的ddH2O配制成浓度为20μg/mL溶液。（2）Southern杂交用溶液①0.4M氢氧化钠溶液称取8gNaOH颗粒，溶于500mLddH2O中。②20×SSC3MNaCl，0.3M柠檬酸钠,pH=7.0，1LNaCl:3mol/L1L柠檬酸钠:0.3mol/L1L加盐酸调pH至7.0，可不高压。③低严谨性缓冲液洗液I（2×WashSolution）2×SSC+0.1%SDS200mL20ml20×SSC，1mL20%SDS，溶于179mL灭菌ddH2O中。临用前配制。10 ④高严谨性缓冲液洗液II（0.1×WashSolution）0.5×SSC+0.1%SDS5mL20×SSC,1mL20%SDS，溶于194mL灭菌ddH2O中。临用前配制。⑤马来酸缓冲液：0.1M马来酸，0.15MNaCl，pH=7.5，200mL马来酸：0.1mol/L0.2LNaCl：0.15mol/L0.2L用NaOH调pH=7.5，灭菌高压备用⑥洗涤缓冲液：0.1M马来酸，0.15MNaCl，0.3％（V/V）Tween20pH=7.5，1L1L马来酸缓冲液，高压冷却至室温后，加入3mL0.3％（V/V）Tween20。⑦检测缓冲液0.1MTris-HCl，0.1MNaCl，PH=9.5，500mLTrisbase：0.1mol/L0.5L×NaCl：0.1mol/L0.5L用NaOH固体调节pH至9.5，高压灭菌备用。⑧0.2N氢氧化钠溶液+0.1%SDS称取1.6gNaOH溶于ddH2O中，加入2mL20%SDS，定容至200mL（3）50×TAE242gTris，13.75mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加去离子水至1000mL。2.2方法2.2.1细菌的分离鉴定与保存（1）样品处理①首先，将采集的样品置于无菌的LB肉汤或营养肉汤37℃培养16～18h。11 ②用接种环挑取菌液在麦康凯琼脂平板上划线，37℃培养16～18h。③挑取麦康凯琼脂培养基上红色不透明菌落在选择培养基上划线，37℃培养16~18h。（2）生化鉴定①取上述分离的单菌落，接种于LB或MH肉汤，37°C培养16～18h；②取用生理盐水稀释到105CFU的菌液5～10μL，接种于肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管中，氨基酸和氨基酸对照滴加石蜡1～2滴，37°C培养24h；③对菌株的生化结果进行判断并编码，按编码值检索肠杆菌科细菌生化编码表进行判断，对不确定菌株进行16SrDNA基因PCR扩增测序鉴定。（3）产ESBLs肠杆菌分离①首先，将采集的样品置于无菌的LB肉汤或营养肉汤37℃培养16～18h。②用接种环挑取菌液在法国科马嘉ESBLs显色培养基配制的平板上划线，37℃培养16～18h。③取上述分离的单菌落，接种于LB或MH肉汤，37°C培养16～18h；④细菌鉴定见方法（2）（4）16SrDNA鉴定菌种①基因组DNA模板的制备挑取单个菌落涂布于LB琼脂板上培养16至18个小时，刮取适量菌液用500µL灭菌1×TE悬浮菌体，100℃水浴15min，冰浴10min，13,200rpm离心5min，上清转置于新的灭菌离心管中，4℃保存备用。②16SrDNA引物的合成参考Weisburg等（Weisburgetal.,1991）报道的细菌通用引物，由华大基因有限公司合成如下引物序列：F（Forwardprimer）:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'R（Reverseprimer）:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'12 ③16SrDNA目的基因的扩增根据一般的PCR反应程序进行，设空白对照和阳性对照，进行目的基因的扩增。50μL反应体系如表1。混匀后，在PCR仪执行如下反应程序：94℃5min，1个循环；94℃45s，55.5℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。取5μLPCR产物经1.0%琼脂糖凝胶（含5μL/100mLSYBRGreen）电泳，以DL2000Marker做参照，6v/cm电压下电泳15~30min，电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。PCR产物送深圳六合华大公司测序，将测序结果提交NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对以鉴定菌种。表1PCR反应体系体系组分用量（μL）模板DNA2.0上游引物（10μmol/mL）1.0下游引物（10μmol/mL）1.02+10×rTaqBuffer（MgPlus）5.0dNTPMixture（各2.5mmol/L）4.0rTaq（5U/μL）0.25灭菌双蒸水加至50.0（5）细菌的保存对经分离鉴定纯化培养的细菌，挑取单菌落于LB肉汤或MH肉汤，37℃培养16～18h后，在4℃静置一晚，吸取试管底部菌体较多的菌液0.5mL加入1.5mLEP管中，加入甘油至终浓度为20.0%～30.0%，混匀。也可直接挑取单菌落涂于LB琼脂板上，37℃培养16～18h后，刮取菌苔于装有20.0%～30.0%甘油肉汤中，-20℃或-70℃冰箱保存备用。2.2.2耐药基因的PCR检测及其他相关基因检测（1）blaCTX-M基因PCR检测①基因组DNA模板的制备，同2.2.1（3）①。13 ②据文献报道的引物序列设计基因，并由华大基因有限公司合成表2引物，表中F代表上游引物；R代表下游引物。③根据表1的PCR反应体系和表3的反应条件进行目的基因的扩增。④PCR产物的电泳分析：取7μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶（含5μL/100mLSYBRGreen）电泳，以DL5000及DL2000Marker做参照，6v/cm电压下电泳15~30min，电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。⑤PCR产物的序列测定：将阳性PCR产物送华大基因公司进行测序并将测序结果提交NCBI进行序列比对。表2blaCTX-M基因及其上下游环境引物引物名称引物序列（5’-3’）大小(bp)来源F:CTTCCAGAATAAGGAATCCCblaCTX-M-1G949（Liuetal.,2007）R:CGTCTAAGGCGATAAACAAAR:ATGATGACTCAGAGCATTCGblaCTX-M-9G902（Liuetal.,2007）F:TGACCGTATTGGGAGTTTGF:AACTTTCACAGGTGTGCTGGGTISEcp1Variable（Sunetal.,2010）R:CCGTACGCATACTGGCTTTGCF:CTATCCGTACAAGGGAGTGTorf477Variable（Sunetal.,2010）R:CAGCGGAAGGAGAACCAG表3PCR反应条件目的基因运行参数blaCTX-M-1G(94℃,5m)+{(94℃,45s)+(52℃,45s)+(72℃,60s)}×30+(72℃,10min)blaCTX-M-9G(94℃,5m)+{(94℃,45s)+(60℃,45s)+(72℃,45s)}×30+(72℃,10min)ISEcp1(94℃,5m)+{(94℃,45s)+(54.7℃,45s)+(72℃,45s)}×30+(72℃,10min)orf477(94℃,5m)+{(94℃,45s)+(56.1℃,45s)+(72℃,45s)}×30+(72℃,10min)14 （2）其他基因的检测①基因组DNA模板的制备，同2.2.1（3）①②据文献报道的引物序列设计基因，并由华大基因有限公司合成引物，引物序列如表4：③根据表1的PCR反应体系和表5的反应条件进行目的基因的扩增④PCR产物的电泳分析：取7μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶（含5μL/100mLSYBRGreen）电泳，以DL5000及DL2000Marker做参照，6v/cm电压下电泳15~30min，电泳结束后用凝胶成像系统观察拍照分析。⑤PCR产物的序列测定：将阳性PCR产物送华大基因公司进行测序并将测序结果提交NCBI进行序列比对。表4其他基因引物大小引物名称引物序列（5’-3’）来源（bp）F:GCGTCAAGCCTGGCATTTfosA3282R:GCCGTCAGGGTCGAGAAAF:TTTGGWCCGCTMTCRGACfloR480R:SGAGAARAAGACGAAGAAGF:ACATCAACGATGCCCTCACrmtB724R:AAGTTCTGTTCCGATGGTCF:GGTTTGGCGATCTGGTTTTCblaNDM621R:CGGAATGGCTCATCACGATCF:CGTCTAGTTCTGCTGTCTTGblaKPC798R:CTTGTCATCCTTGTTAGGCGF:CGGTCAGTCCGTTTGTTCmcr-1309(Liuetal.,2016)R:CTTGGTCGGTCTGTAGGG15 表5PCR反应条件目的基因运行参数fosA3(94℃,5min)+{(94℃,30s)+(57.5℃,30s)+(72℃,30s)}×30+(72℃,5min)floR(94℃,5min)+{(94℃,45s)+(50℃,45s)+(72℃,1min)}×30+(72℃,10min)rmtB(94℃,5min)+{(94℃,30s)+(55℃,30s)+(72℃,30s)}×30+(72℃,5min)blaNDM(94℃,10min)+{(94℃,30s)+(52℃,40s)+(72℃,50s)}×30+(72℃,5min)blaKPC(94℃,10min)+{(94℃,30s)+(52℃,40s)+(72℃,50s)}30+(72℃,5min)mcr-1(94℃,5min)+{(94℃,30s)+(52.5℃,30s)+(72℃,30s)}×30+(72℃,5min)2.2.3琼脂稀释法敏感性试验（1）药物的配制将待测药物按照CLSI的指导原则选取溶剂进行配制和稀释。用灭菌去离子水配成所需浓度，用0.22μm滤头进行过滤，滤液分装置于-20℃或-70℃冷冻保存备用。使用前采用微量稀释法对配好的药物进行质控实验，以确定所制备的药物有效。过程如下：①根据设计的试验浓度，除第一列外，在96孔板每个孔加入空白MH肉汤100μL，在每块96微孔板上的第一列据所需药物浓度按比例加入空白MH肉汤和药液，充分混匀后吸100μL至第二孔，依次倍比稀释，稀释至最后一孔后弃去100μL。®②将保存的大肠杆菌ATCC25922经复苏后，挑选单菌落分别接种于MH肉汤，37℃、200rpm摇床上孵育直至浊度到达或超过0.5麦氏单位，用灭菌MH肉汤稀释，并往已稀释好药物的96孔板中每孔加100μL稀释好的菌液，使每孔最终菌液浓度为5×105CFU/mL。稀释菌液于15min内接种完毕，37℃孵育16-20h，每种药做3个重复，分别设置阳性对照组（只含肉汤和菌液），以及阴性对照组（只含肉汤）。（2）最小抑菌浓度（MIC）的测定16 采用琼脂稀释法（按CLSI的标准）测定受试药物对临床分离的肠杆菌的MIC值，对每株试验菌进行3次重复。过程如下：①琼脂稀释平皿制备在平皿底部写上各药物名称及各自梯度，将药物储存液在平皿中依次进行倍比稀释，往平皿中加入45℃至50℃MH琼脂，立即将琼脂和药物溶液混匀，制成琼脂和药物的体积比为19:1的药板。②接种物制备将-80℃保存菌种复壮后，用接种环从生长良好的肠杆菌琼脂平皿上蘸取单菌落接种至2mLMH试管肉汤中，至37℃、200rpm摇床上孵育至浊度达到或超过0.5麦氏单位；以96孔板作为接种槽，用灭菌生理盐水稀释菌液，最终使接种于琼脂上的细菌含量为104CFU/点。③接种琼脂稀释平皿在琼脂平皿上注明接种的方向；采用多点接种装置接种每一份接种物至琼脂表面，首先接种无抗菌药物的生长对照平皿，然后从最低药物浓度到高药物浓度开始接种，最后接种第二个生长对照平皿以保证在接种过程中无污染且无明显的抗菌药物携带。④孵育琼脂稀释平皿置接种于平皿于室温直至接种点的水分被琼脂完全吸收，但不要超过半个小时，将平皿倒置于37℃恒温培养箱孵育培养16-20h。（3）结果判读结果判断根据CLSI标准进行。将平皿置深色不反光的表面来测定其终点，当阳性对照组细菌明显生长，阴性对照组无细菌生长时，以抗菌药物完全抑制细菌生长的最低浓度为MIC值，单一菌落或由接种造成的微弱的薄雾状生长应视为阴性。当出现单一的跳孔时，记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如多次出现跳孔现象，则不记录结果，重新试验。2.2.4大肠杆菌MLST分析（1）基因组DNA模板的制备同2.2.1（3）①17 （2）根据参考文献报道的引物序列，由华大基因科技有限公司合成引物，大肠杆菌MLST引物序列见表6，系统发育群分析引物见表7：（3）根据表1的PCR反应体系和表8的反应条件进行目的基因的扩增：（4）PCR产物的电泳分析同2.2.2（1）④（5）PCR产物的序列测定将阳性PCR产物送华大基因公司进行测序，并将测序结果提交MLST数据库（http://mLst.warwick.ac.uk/mLst/dbs/Ecoli）进行比对以得到菌株的ST（SequeceTyping，ST）型。表6大肠杆菌MLST引物引物名称引物序列（5’-3’）大小（bp）adkF:ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG583R:CCGTCAACTTTCGCGTATTTfumCF:TCACAGGTCGCCAGCGCTTC806R:GTACGCAGCGAAAAAGATTCgyrBF:TCGGCGACACGGATGACGGC911R:ATCAGGCCTTCACGCGCATCicdF:ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA878R:GGACGCAGCAGGATCTGTTmdhF:ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG932R:TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTTpurAF:CGCGCTGATGAAAGAGATGA816R:CATACGGTAAGCCACGCAGArecAF:CGCATTCGCTTTACCCTGACC780R:TCGTCGAAATCTACGGACCGGA18 表7PCR反应条件目的基因运行参数adk,fumC,icd,（95℃,5min）+{（95℃,1min）+（54℃,1min）+purA（72℃,2min）}×30+（72℃,5min）（95℃,5min）+{（95℃,1min）+（60℃,1min）+gyrB,mdh（72℃,2min）}×30+（72℃,5min）（95℃,5min）+{（95℃,1min）+（58℃,1min）+recA（72℃,2min）}×30+（72℃,5min）2.2.5接合试验及阳性接合子复制子分型（1）接合试验①第一天：分别制备含有2μg/mLIPM单药的麦康凯培养基、含有4μg/mLCL单药的麦康凯培养基、含3000μg/mLSTR单药的麦康凯培养基、含有2μg/mLIPM和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基及含有4μg/mLCL和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基；并以blaNDM及mcr-1阳性菌作为供体菌，C600作为受体菌分别接种到2μg/mLIPM单药的麦康凯培养基、含有4μg/mLCL单药的麦康凯培养基、含3000μg/mLSTR单药的麦康凯培养基、含有2μg/mLIPM和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基及含有4μg/mLCL和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基上，37℃，过夜培养，看生长情况。②第二天：分别将供受体菌接种到2mLLB肉汤中，37℃，过夜培养。③第三天：分别吸取100µL过夜培养好的供受体菌接种到2mLLB肉汤中，37℃，200rpm，4h，使菌液的浓度达到OD600达0.5左右；分别吸取200µL培养了4h的供受体菌分别置于2mL及4mLLB肉汤中，37℃，200rpm，4h，使菌液的浓度达到OD600达0.5左右；吸取1mL供体菌接种到4mL受体菌中，37℃，静置培养过夜，此过程中不要摇动试管。④第四天：将过夜培养好的混合菌液收集，4000rpm，5min，离心，将上清弃去，加入200µL灭菌生理盐水，重新混匀菌液，适当稀释，涂于含有2μg/mLIPM和19 3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基及含有4μg/mLCL和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基上，37℃，过夜培养。⑤第五天：分别挑取挑取2μg/mLIPM和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基及含有4μg/mLCL和3000μg/mLSTR双药的麦康凯培养基上无色菌落分别接种于含有1μg/mLIPM单药的LB肉汤中、含有2μg/mLCL单药的LB肉汤中，37℃，200rpm，4h，使菌液的浓度达到OD600达0.5左右，做菌液PCR，检测是否含有blaNDM及mcr-1基因，对于PCR结果阳性细菌做药物敏感性试验及提质粒，并将含有单质粒的接合子保存于30%的甘油肉汤中，置于-80℃和-20℃冰箱保存备用。⑥其余耐药基因的接合试验同理。（2）试剂盒小提质粒①将接合子涂于含药平板中，37℃，过夜培养，刮取菌苔至含有1mL1×TE的1.5mL的EP管中，吹打混匀，4000rpm，5min，离心，弃上清；②加入250mLSolutionI（含酶），充分混匀；再加入250µLSolutionII，轻柔的上下翻转混匀5-6次，是菌充分裂解成透明溶液；加入350µLSolutionIII，轻轻上下翻转混匀5-6次，直至形成紧实的凝集块，12,000rpm，离心10min;③取上清过HiBindDNAMCI（收集柱），置于2mL收集管中，12,000rpm,1min离心，弃滤液；④加入500µLBufferHB冲洗收集柱，12,000rpm,1min离心，弃滤液；⑤加入700µLDNAWashBuffer（确保已加入无水乙醇）冲洗收集柱，12,000rpm,1min离心，弃滤液；⑥重复⑤；⑦将收集柱，12,000rpm,1min空管离心（此步骤是为了挥发乙醇不可省）；⑧将收集柱置于新的1.5mL的EP管中，在收集柱中央加入30-50µL已预热到55℃的超纯水，室温静置1min将质粒溶解，12,000rpm，1min，所得即为质粒，取所得的质粒DNA进行电泳和含量测定。(3)阳性接合子复制子分型20 ①基因组DNA模板的制备：同2.2.1(3)①②根据参考文献（Carattolietal.,2005）报道的引物序列，由华大基因科技有限公司合成质粒复制子分型的引物，引物序列见表8：③根据表1的PCR反应体系和表9的反应条件进行目的基因的扩增：④PCR产物的电泳分析：同2.2.3(1)④PCR产物的序列测定：将阳性PCR产物送华大基因公司进行测序，并将测序结果提交PubMLST数据库或NCBI进行BLAST比对分析，确定复制子类型。表8复制子分型引物序列引物名称核苷酸序列（5'-3'）靶位基因大小（bp）HI1FWGGAGCGATGGATTACTTCAGTACparA-parB471HI1RVTGCCGTTTCACCTCGTGAGTAHI2FWTTTCTCCTGAGTCACCTGTTAACACIterons644HI2RVGGCTCACTACCGTTGTCATCCTI1FWCGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI139I1RVTCGTCGTTCCGCCAAGTTCGTXFWAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATOrir376XRVTGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGCL/MFWGGATGAAAACTATCAGCATCTGAAGrepA,B,C785L/MRVCTGCAGGGGCGATTCTTTAGGNFWGTCTAACGAGCTTACCGAAGrepA559NRVGTTTCAACTCTGCCAAGTTCFIAFWCCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTGIterons462FIARVGTATATCCTTACTGGCTTCCGCAGFIBFWGGAGTTCTGACACACGATTTTCTGrepA702FIBRVCTCCCGTCGCTTCAGGGCATTWFWCCTAAGAACAACAAAGCCCCCGrepA242WRVGGTGCGCGGCATAGAACCGTYFWAATTCAAACAACACTGTGCAGCCTGrepA765YRVGCGAGAATGGACGATTACAAAACTTT21 PFWCTATGGCCCTGCAAACGCGCCAGAAAIterons534PRVTCACGCGCCAGGGCGCAGCCFICFWGTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA2262FICRVTTCTCCTCGTCGCCAAACTAGATA/CFWGAGAACCAAAGACAAAGACCTGGArepA465A/CRVACGACAAACCTGAATTGCCTCCTTTFWTTGGCCTGTTTGTGCCTAAACCATrepA750TRVCGTTGATTACACTTAGCTTTGGACFIISFWCTGTCGTAAGCTGATGGCrepA270FIISRVCTCTGCCACAAACTTCAGCFrepBFWTGATCGTTTAAGGAATTTTGRNAI/repA270FrepBRVGAAGATCAGTCACACCATCCK/BFWGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAACRNAI160KRVTCTTTCACGAGCCCGCCAAAK/BFWGCGGTCCGGAAAGCCAGAAAACRNAI159B/ORVTCTGCGTTCCGCCAAGTTCGA表9PCR反应条件目的基因运行参数FrepBFW/FrepBV(94℃,5min)＋30×｛(94℃，1min)＋(52℃,30s)+(72℃,1min)｝+(72℃,5min)其他17对基因(94℃,5min)＋30×｛(94℃，1min)＋(60℃,30s)+(72℃,1min)｝+(72℃,5min)2.2.6大肠杆菌接合子S1-PFGE分析(1)大肠杆菌接合子S1-PFGE1)小胶块的制备①挑取单菌落涂LB琼脂板，37℃过夜培养，刮取菌苔于含有1mL细胞悬浮液（CSB）的1.5mL的EP管中，吹打混匀，4000rpm,离心5min，弃上清，再加入1mLCSB，吹打混匀，用CSB调整细菌浓度至OD600在1.8-2.0之间，将调整好OD22 值的菌液置于4℃冰箱或冰上。②制备1%低熔点胶（SKG胶）：称取0.05g低熔点胶于10mLEP管中，加入5mL1×TE，以封口胶密封，混匀，置于煮沸的水中，加热30S后取出上下颠倒混匀，10S后继续加热，依此重复，直至胶变透明无沉淀物，置于56℃水浴锅中水浴待用。③取200µL菌液置于1.5mLEP管中，加入10µL蛋白酶K，混匀，再加入10µL20%SDS，迅速加入200µL配置好的1.0%低熔点胶，轻轻混匀，不要产生气泡，迅速转入到已封好口的制胶模具中，将胶置于4℃冰箱中放置10-15分钟，使胶凝固。2）小胶块内细胞的裂解①制备细胞裂解液：取已高压灭菌的50mL离心管，加入4.75mLCSB，25µL蛋白酶K，混匀，现配现用（当有相同的胶时可以在同一个离心管中裂解，裂解液和蛋白酶K加倍）。②将胶适当修剪，转移至细胞裂解液中（确保胶在液面以下），将离心管置于54℃摇床中，150-170rpm，裂解2h，同时将灭菌ddH2O和1×TE置于54℃烘箱中预热。3）洗胶块①将离心管中的细胞裂解液倒出，加入10-15mL预热的灭菌ddH2O，54℃摇床，150-170rpm，10-15min；②重复①；③将水倒出，加入10-15mL预热的1×TE，54℃摇床，150-170rpm，10-15min；④重复③的步骤3次；⑤待离心管中的1×TE冷却至室温，将胶块置于含有1×TE的2mLEP管中，可于4℃冰箱中保存待用，或者立即用来酶切。4)胶块内DNA的酶切①切取1/3～1/2胶块，用限制性内切酶XbaI，根据表10酶切体系对沙门氏菌H9812（Marker）进行酶切，37℃水浴孵育4h。用S1Nuclease对受试菌株胶块进行酶切，S1Nuclease的酶切体系如表11，37℃水浴孵育25min。23 表10沙门氏菌H9812（marker）酶切体系试剂含量/µL灭菌ddH2O280µL10×Mbuffer50µLBSAbuffer50µLXbaⅠ内切酶6.7µL总共386.7µL表11S1Nuclease的酶切体系试剂含量/µL灭菌ddH2O180µL10×S1buffer20µLS1酶10U总共200µL5)制备大胶及电泳①将胶槽安装好，酶切好的Marker及样品置于梳子上，吸干净液体使样品紧贴齿梳上；②称取1.4g低熔点胶溶于140mL0.5×TBE中，于微波炉中加热至胶溶解透明，将胶置于56℃水浴锅中至少15min；③将冷却至不烫手的胶缓慢倒入胶槽中，室温冷却30min，小心拔出齿梳，用剩余的低熔点胶将齿孔封住，4℃冷凝；④往电泳槽中加入3L左右的0.5×TBE，打开主机、泵及冷凝机的开关，将0.5×TBE预冷到14℃；⑤将大胶取出，除去边缘碎胶，小心置于电泳槽中，卡紧；24 ⑥设置电泳参数：AutoAlgorithm30kb-lowMW，700kb-highMWVoltage:6V/cmTime：19hInitialswitchtime=2.16s;Finalswitchtime=63.8s⑦电泳结束，关机顺序为：冷凝机－泵－主机。6)染色及凝胶成像将胶置于含有EB染料中染色20-30min，然后到出染料加入灭菌ddH2O，脱色15-20min，用凝胶成像系统观察拍照分析。2.2.7Southern杂交按照美国Roche公司DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI试剂盒使用说明书进行操作，步骤如下：1)探针的制备根据目的基因引物序列进行PCR扩增，切胶回收，测浓度；分别取大于16μLPCR回收产物煮沸10min至DNA变性，迅速冰浴10min，使双链完成分开；混匀DIG-HighPrime（管1），加4μL至变性的DNA中，简单混匀，37℃诱导过夜；加入2μL0.2MEDTA（pH8.0），加热至65℃10min，终止反应。2)检测结合效率稀释程序见表12，用DNADilutionBuffer（管3）稀释至第9管；除特殊说明，振荡诱导均为室温下50rpm；25 表12探针标记效率检测的稀释梯度表管号DNA（μL）取液管DNA稀释管（μL）稀释比例终浓度1-原始浓度--1ng/μL2211981：10010pg/μL3152351：3.33pg/μL452451：101pg/μL553451：100.3pg/μL654451：100.1pg/μL755451：100.03pg/μL856451：100.01pg/μL90-50-0①从2-9号管中和标记的质控DAN（管2）各取1μL点到尼龙膜上；②将膜放入紫外交联仪交联5分钟；③将膜转移到一个盛有20mL马来酸缓冲液的塑料容器内，15-25℃下振荡诱导2min，弃去液体；④在15mL阻断液中100rpm诱导30min，弃去液体；⑤在15mL抗体液中100rpm诱导30min，弃去液体；⑥用15mL洗涤缓冲液漂洗15min，2次，弃去液体；⑦在15mL检测缓冲液中平衡5min，弃去液体；⑧将膜放人另一个盛有2mL新鲜配置的底物显色液的容器内，置于暗处，勿摇动，几分钟内即会显色，初始可在光下观察显色情况；⑨当点或条带出现后，用50mL无菌双蒸水或TE-buffer洗膜5min终止反应；⑩当第6管（0.1pg）的点仍可见的时候，证明初始标记DIG探针浓度足以进行以下的实验。3）DNA的转移与固定①凝胶变性:在凝胶右下角切一缺口以做标记，将凝胶背面朝上放人50mL脱26 嘌呤液中50rpm，15min，弃去液体，加入灭菌ddH2O，50rpm，5min，重复一次；放入50mL变性液50rpm，30min，弃去液体，加入灭菌ddH2O，50rpm，5min，重复一次；放人50mL中和缓冲液50rpm，15min，2次，弃去液体，加入灭菌ddH2O，50rpm，5min，重复一次；加入20×SSC平衡至少10,min；②转移：将胶面反转置于滤纸桥上，贴上尼龙膜、两层用20×SSC浸润过的同等大小的滤纸、若干吸水纸，保证所有层与层间均无气泡，压上重物，转移过夜，中间需更换吸水纸；③转移结束后，2×SSC浸泡膜5min，洗去凝胶碎片；④固定：将尼龙膜紧贴用6×SSC浸润的滤纸，放入紫外交联仪中交联5min；⑤若不继续进行则置于4℃保存。4）杂交2①在杂交管中预热DIGEasy杂交工作液（10mL/100cm）至杂交温度42℃，将膜卷起贴壁放入杂交管中，勿留有气泡，转移有DNA面朝向管内与杂交液直接接触，预杂交2h；②变性DIG标记探针：68℃10min至DNA变性，迅速冰浴10min；2③加入5μL变性探针到预热的杂交液中（3.5mL/100cm膜），迅速混匀避免产生气泡；④倒出预杂交液，并把探针/杂交液倒入杂交管中，杂交过夜；⑤用充足的洗液I室温下振荡洗涤5min，2次；⑥用洗涤II（预热）在杂交仪中68℃振荡洗涤15min，2次。5）免疫检测①用25mL洗涤缓冲液洗涤膜5min，弃去液体；②在25mL阻断液中100rpm诱导30min，弃去液体；③在25mL抗体液中100rpm诱导30min，弃去液体；④用25mL洗涤缓冲液漂洗15min，2次，弃去液体；27 ⑤在25mL检测缓冲液中平衡5min，弃去液体；⑥将膜放人另一个盛有10mL新鲜配置的底物显色液的容器内，置于暗处，勿摇动，几分钟内即会显色，初始可在光下观察显色情况；⑦当点或条带出现后，用50mL无菌双蒸水洗膜5min终止反应；⑧将膜拍照记录；⑨保持膜的湿润，用预热至55℃的DMF洗膜，直至膜上颜色褪去；⑩然后用灭菌ddH2O将膜漂洗干净；再用0.2N的氢氧化钠及0.1%SDS漂洗膜两次，每次20min；用2×SSC平衡膜5min后可再次杂交。3结果与分析3.1肠杆菌的分离与鉴定3.1.1大肠杆菌的分离经细菌菌落形态、生化鉴定，从395份蔬菜样品中,利用不含药培养基分离60（15.2%）株大肠。其中，黄瓜中分离大肠杆菌15株，番茄5株，生菜26株，胡萝卜14株，分离率分别为13.0%、5.6%、26%和15.6%。从市售200份生鸡肉样品中利用不含药培养基分离得到134株大肠杆菌，分离率为67%。3.1.2产CTX-M肠杆菌分离鉴定（1）肠杆菌分离鉴定显色培养基初步分离产ESBLs的肠杆菌，挑取120株在培养基上生长的单菌落，对这些肠杆菌进行blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G、blaKPC和blaNDM基因的PCR检测，共得到33株blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G阳性菌株（结果见图1、图2），对这33株菌进行菌种鉴定得到大肠杆菌12（36.4%）株，不同蔬菜样品中产ESBLs大肠杆菌比例分别为生菜6%（6/100），黄瓜3.5%（4/115），胡萝卜2.2%（2/90），番茄0（0/90）。肺炎克雷伯菌19（57.6%）株，其中黄瓜分离率有6.1%（7/115），生菜6%(6/100)，胡萝卜3.3%(3/90)，番茄3.3%(3/90)，另外，还有1株（3%）弗氏柠檬酸杆菌以及1株（3%）阴沟肠杆菌，分别来自黄瓜和生菜。不同蔬菜来源的菌种分布见表13。另外，从显色培养基挑取的120株菌中检测到一株携带blaKPC-2的大肠杆菌TS79。28 （2）耐药基因检测33株blaCTX-M-1G、blaCCTX-M-9G阳性菌株中，23株（69.7%）检测到blaCTX-M-1G基因，10株（30.3%）检测到blaCTX-M-9G基因，共有7种不同的亚型，分别是blaCTX-M-3(n=6)、blaCTX-M-15(n=10)、blaCTX-M-55(n=7)、blaCTX-M-14(n=4)、blaCTX-M-24(n=3)、blaCTX-M-38(n=1)和blaCTX-M-65(1)，检出率最高的是blaCTX-M-15，其次是blaCTX-M-55和blaCTX-M-3。在33株阳性菌中，分别有4、3、3、1和1株大肠杆菌携带blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-14、blaCTX-M-24和blaCTX-M-65；有6、6、3、1、2、1株肺炎克雷伯菌分别携带blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-14、blaCTX-M-24和blaCTX-M-38基因。另外，1株弗氏柠檬酸杆菌携带blaCTX-M-55，1株阴沟肠杆菌产blaCTX-M-24。各菌种基因分布见表14。不同蔬菜中blaCTX-M基因的检出率分别为：黄瓜10.4%（12/115），番茄3.3%（3/90），生菜13%（13/100），胡萝卜5.7%（5/90）。从黄瓜分离的12个blaCTX-M阳性肠杆菌携带的基因亚型为blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-24和blaCTX-M-65，数量分别为2、5、3、1和1；番茄中耐blaCTX-M阳性肠杆菌的亚型为2株blaCTX-M-3和1株blaCTX-M-55；生菜的检出率最高，其亚型为blaCTX-M-3、blaCTX-M-15、blaCTX-M-55、blaCTX-M-14、blaCTX-M-24和blaCTX-M-38，1、3、3、3、2和1株。各基因分布见表15和表16。图1blaCTX-M-1GPCR扩增图M：MarkerDL2000；1-8blaCTX-M-1G基因阳性菌株29 图2blaCTX-M-9GPCR扩增图M：MarkerDL2000；1-6blaCTX-M-9G阳性菌株表13不同蔬菜来源产ESBL菌种分布黄瓜番茄生菜胡萝卜（n=115）（n=90）（n=100）（n=90）大肠杆菌4062肺炎克雷伯菌7363阴沟肠杆菌0010弗氏柠檬酸菌1000总计123135表14不同菌种基因分布CTX-M型总数肺炎克雷伯菌大肠杆菌弗氏柠檬酸菌阴沟肠杆菌CTX-M-366000CTX-M-15106400CTX-M-5573310CTX-M-1441300CTX-M-2442101CTX-M-3811000CTX-M-6510100总数3319(57.6%)12(36.4%)1(3%)1(3%)30 表15不同蔬菜来源产ESBL肠杆菌的CTX-M基因型分布CTX-M黄瓜番茄生菜胡萝卜（n=115）（n=90）（n=100）（n=90）123135CTX-M（10.4%）（3.3%）（13%）（5.6%）CTX-M-1G10373CTX-M-9G2062表16CTX-M亚型分布总数黄瓜番茄生菜胡萝卜CTX-M型（株）（n=115）（n=90）（n=100）（n=90）CTX-M-362211CTX-M-15105032CTX-M-5573130CTX-M-1440031CTX-M-2441021CTX-M-3810010CTX-M-6511000总数331231353.2药物敏感性试验3.2.1随机分离大肠杆菌药敏试验用琼脂稀释法对随机分离得到的60株蔬菜源大肠杆菌进行药物敏感性检测，结果如表16所示。60株大肠杆菌对头孢类药物头孢他啶、头孢噻肟、头孢喹肟、头孢西丁耐药率在5%—15%之间，氨苄西林、盐酸四环素、多西环素、复方新诺明的耐药率超过50%，对阿米卡星、庆大霉素、链霉素、安普霉素、环丙沙星、新霉素、黏菌素、氟苯尼考、磷霉素、喹乙醇的耐药率在1.7%-45%之间。鸡肉中分离的134株大肠杆菌结果如表17所示。头孢他啶、头孢噻肟、头孢喹肟、头孢西丁耐药率在11%—49.3%之间。氨苄西林、链霉素、多西环素、四环素、氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明、喹乙醇的耐药率超过50%，阿米卡星、磷霉素、31 黏菌素分别是12.7%、34.3%、32.1%，检出一株亚胺培南耐药菌,存在明显的多重耐药现象。除头孢西丁外，鸡肉源大肠杆菌对所有药物的耐药率均高于蔬菜源。3.2.2肠杆菌药敏试验携带CTX-M基因的33株肠杆菌对氨苄西林、头孢噻肟全部耐药，头孢喹肟、四环素、磷霉素、多西环素、喹乙醇、复方新诺明耐药率均超过50%，庆大霉素、链霉素、环丙沙星、氟苯尼考、新霉素、头孢西丁的耐药率在30.3%-50%间，头孢他啶、安普霉素、黏菌素、阿米卡星的耐药率低于10%，对亚胺培南全部敏感。表17肠杆菌的药物敏感性蔬菜源大肠鸡肉源大肠蔬菜源产药物杆菌杆菌CTX-M基因(n=60)（n=134）肠杆菌(n=33)氨苄西林53.3%80.6%100%头孢他啶5.0%11.2%24.2%头孢噻肟20.0%49.3%100%头孢喹肟11.7%43.3%54.6%头孢西丁15.0%11.2%30.3%庆大霉素8.3%47.0%42.4%阿米卡星1.7%12.7%3.0%链霉素25.0%61.9%48.5%安普霉素5.0%21.6%6.1%环丙沙星10.0%47.0%42.4%新霉素5.0%39.6%36.4%黏菌素3.3%32.1%9.1%氯霉素15.0%67.2%42.4%氟苯尼考18.3%50.7%48.5%四环素50.0%84.3%81.8%磷霉素31.7%34.3%57.6%多西环素61.7%68.7%60.6%32 亚胺培南00.7%0喹乙醇36.7%56.7%60.6%复方新诺明65.0%83.6%90.9%3.3肉菜产KPC、NDM酶大肠杆菌的分子特性在生鸡肉样品中，发现一株耐亚胺培南大肠杆菌THSJ02，是2014年7月从广州某大型超市的生鸡肉中分离得到，除对多西环素和替加环素敏感以外，对其余药物全部耐药（见表17）。该菌的多序列位点分型结果为ST167，PCR结果显示该菌携带mcr-1、blaNDM-9、floR、fosA3、rmtB和blaCTX-M-65基因（见图3-7），因此对黏菌素、碳青霉烯类药物、氟喹诺酮、磷霉素、阿米卡星、头孢类药物均存在耐药现象。通过质粒接合实验获得不同药物条件筛选的接合子，通过提取质粒和S1-PFGE的方法确定接合子为单质粒。根据接合、S1-PFGE和杂交实验证实，mcr-1基因位于IncI2型质粒上，blaNDM-9和fosA3位于一个约100kb的未知型质粒，而rmtB，blaCTX-M-65和另一拷贝的fosA3基因位于F33:A–:B–质粒（见表19）。不同药物筛选出的接合子的耐药情况存在很大不同，也验证了不同基因位于不同质粒上。从2015年11月采集的生菜样品中检测到一株产KPC-2的大肠杆菌TS79（见图7），多序列位点分型结果为ST877型。该基因位于一个大小约54kb的质粒上，复制子分型未成功。TS79对黏菌素和替加环素敏感，对其余几种药物均存在耐药现象，用亚胺培南药板筛选出的接合子对亚胺培南和头孢类药物不敏感（见表18）。33 图3blaNDM-9PCR扩增图M：MarkerDL2000；1-5和6-8blaNDM-9基因阳性菌株6:空白对照图4mcr-1PCR扩增图M：MarkerDL2000；1-11mcr-1基因阳性菌株12:阳性对照图5fosA3PCR扩增图M：MarkerDL2000；1、3、5、7、9fosA3基因阳性菌株2、4、6、8阴性对照34 图6rmtBPCR扩增图M：MarkerDL2000；1-10rmtB基因阳性菌株图7blaKPC-2PCR扩增图M：MarkerDL2000；1-6,8-10blaKPC-2基因阳性菌株7:阴性对照表18THSJ02原菌及接合子药敏试验结果TS79接THSJ02接合子合子C600大TS79THSJ02亚胺培黏菌亚胺培阿米卡肠杆菌南筛选素南筛选星筛选头孢噻肟>1284>1280.5>128160.125头孢他啶>1284>1280.125320.50.06头孢喹肟>1280.06>1280.060.060.030.06头孢西丁>1288>1284>1284435 亚胺培南>128480.12540.1250.125美罗培南>1281160.0380.0150.03黏菌素0.1250.125880.250.258磷霉素>12816>2562256>2562阿米卡星>1284>12844>1284庆大霉素>1284>1280.50.5>1280.5安普霉素646464166488新霉素6416>1288884链霉素32>256>256>256>256>256>256四环素>1280.5640.50.50.250.25多西环素64140.50.50.50.5替加环素0.50.250.50.250.250.50.25氟苯尼考324>1288484复方新诺明>1280.25>640.25>640.250.25环丙沙星>1280.008320.0040.0080.0080.004表19THSJ02原菌及接合子的分子特性接合子THSJ02黏菌素亚胺培南阿米卡星筛筛选筛选选mcr-1，floRblaNDM-9，blaNDM-9，fosA3，rmtB，耐药基因mcr-1fosA3，rmtB，fosA3blaCTX-M-65blaCTX-M-65，复制子型IncI2Non-typableF33:A-:B-质粒大小~65kb~100kb~75kb36 4讨论4.1鸡肉和蔬菜源大肠杆菌药物敏感性比较现如今，消费者对饮食的新鲜和营养的要求越来越高，新鲜果蔬成为更多人的选择，而很多消费者生吃蔬菜的习惯可能会导致蔬菜上残留的肠道微生物危害人体健康（Heatonetal.,2008；Franzetal.,2008）。鸡肉在屠宰、运输或者销售过程中容易受到污染，暴露于空气中的肉品可能由于接触，或空气中微生物散落在表面而附着了耐药菌。很多食源性疾病都是由于食用了生鲜农产品导致的（Lynchetal.,2009），生肉和蔬菜也成为耐药细菌传播的媒介之一（Schwaigeretal.,2011；Kimetal.,2015；Kawamuraetal.,2014）。通过比较蔬菜源和鸡肉源随机分离的大肠杆菌的药物敏感性可以看出，鸡肉源大肠杆菌的耐药情况比蔬菜源严重很多。蔬菜源大肠杆菌对头孢类药物的耐药率在5%—15%之间，而鸡肉源大肠杆菌在11%—49.3%之间。鸡肉源大肠杆菌对阿米卡星、磷霉素、黏菌素、氟苯尼考的耐药率分别是12.7%、34.3%、32.1%、50.7%，而蔬菜源为1.7%、31.7%、3.3%、18.3%，蔬菜源大肠杆菌仅头孢西丁的耐药率超过了鸡肉源。从过去对蔬菜源以及生肉源大肠杆菌的分离情况来看，蔬菜中的大肠分离率以及耐药率并不高（Osterbladetal.,1999，Kimetal.,2015），鸡肉中的大肠杆菌分离情况以及耐药情况则比蔬菜严重很多。越南有关动物食品的报道称，鸡肉、猪肉和鱼肉样品中，鸡肉的产ESBLs/pAmpC大肠杆菌分离率最高（76/82,92.7%），这些鸡肉中的大肠杆菌对磷霉素、四环素的耐药率达50.8%和80.5%（Nguyenetal.,2016）。尽管蔬菜中的大肠杆菌耐药程度比鸡肉源的耐药程度低，这其中潜在的危险仍不容小视。4.2蔬菜源产ESBL肠杆菌流行情况本研究中从395份蔬菜样品中分离得到12株产CTX-M大肠杆菌，检出率为3%，产CTX-M肺炎克雷伯菌19株（4.8%），远低于Zurfluh从进口蔬菜中的检出率（21.2%）（Zurfluhetal.,2015），该研究中的蔬菜来自印度、越南等发展中国家，当地的蔬菜种植条件以及方法，可能是造成其高检出率的原因。不同国家对蔬菜种植的要求和规范有所不同，使蔬菜受到耐药菌的污染程度不同，耐药情况也各不相同,而蔬菜的进出口贸易也会是耐药基因传播的一种途径。本研究中番茄源产ESBL分37 离株对多种药物都表现耐药，对庆大霉素、环丙沙星、氟苯尼考、复方新诺明耐药率达到100%，可能是由于番茄蒂部不容易清洗，有机肥料中的细菌容易保留。生菜和黄瓜的耐药菌检出也比较高，产KPC的耐药大肠杆菌就是从生菜中分离得到的，这可能与生菜生长在土壤中受土壤微生物污染有关。胡萝卜中分离的大肠杆菌耐药性相对其他蔬菜较低。作为即食蔬菜，如果清洗不当，病原菌就可以直接经消化道进入人体，从而增大耐药基因传递给人类的机会。CTX-M酶中，最流行的是CTX-M-1群与CTX-M-9群（Rochaetal.,2015；Zhouetal.,2015），因此本研究主要对这两个群的基因进行了检测，获得33株CTX-M阳性分离株，属于7种不同的亚型，检出率最高的是blaCTX-M-15(30.3%)，其次为blaCTX-M-55(21.2%)和blaCTX-M-3（18.2%），blaCTX-M-14共获得4株阳性，占12.1%。与Zurfluh的报道相比，检出的亚型种类一致，其结果中也以blaCTX-M-15（50%）检出率最高，其次为blaCTX-M-14（11.5%）和blaCTX-M-3（3.8%），但该研究没有检测到blaCTX-M-55（Zurfluhetal.,2015）。而韩国学者的研究中则以blaCTX-M-14（64.3%）居多，其次为blaCTX-M-15（21%）（Kimetal.,2015）。CTX-M-14和CTX-M-15是全球主要流行的亚型，在亚洲以CTX-M-14最为流行（Ewersetal.,2012）。Zurfluh和Kim研究结果显示蔬菜中分离株也是以blaCTX-M-15和blaCTX-M-14为主要的流行型，与本研究结果略有不同，blaCTX-M-55的检出率要高于blaCTX-M-14。该实验结果与我国动物源大肠杆菌中CTX-M亚型分布差异比较大，我国动物源大肠杆菌主要是以CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-65为最主要流行型（Maetal.,2012；Yangetal.,2014；Zhengetal.,2012）。但是本研究CTX-M-1群的亚型分布与人源大肠杆菌中的分布相似（Zhangetal.,2014；Xiaetal.,2014），与我国动物源大肠杆菌差异很大。一般认为，动物、人类的排泄物以及未经处理的污水是导致蔬菜源细菌携带耐药基因的主要原因（Hartmannetal.,2012），这有可能是CTX-M-1与人源大肠杆菌亚型分布相似的原因。这也提醒我们应该重视这个容易被忽略的耐药基因储存库，它们涉及的食品安全问题同样会牵连消费者们的健康。4.3产碳青霉烯酶大肠杆菌分子特性由于细菌耐药水平不断提高，对强效抗生素的使用也更加频繁，作为治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线，碳青霉烯类药物在临床的应用也更加常见，同时也导致了CPE的检出率增加。耐碳青霉烯类肠杆菌耐药机制之一是产生水解酶，KPC38 酶和NDM酶是目前流行较广的两种碳青霉烯酶。产KPC酶和NDM酶肠杆菌在人医临床中一直都是研究重点，但关于动物源和食品源大肠杆菌的相关报道并不多。本研究中蔬菜中分离的携带blaKPC-2基因大肠杆菌对各类的抗生素都存在耐药现象，仅对黏菌素和替加环素敏感，这两种药物也是治疗碳青霉烯类抗生素耐药菌的主要药物。本文检测到的产KPC-2型酶大肠杆菌为ST877，目前全球范围流行人源产KPC-2/3型酶的大肠杆菌，多属于ST131型（Piazzaetal.,2016；Xuetal.,2015）。blaKPC基因可通过质粒水平传播，本研究成功获得了含blaKPC-2基因的接合子，其对亚胺培南等药物不敏感。以往报道，blaKPC-2经常位于IncX3和IncFII型质粒上（Buenoetal.,2016；Piazzaetal.,2016），本质粒复制子分型失败，现正测定其质粒序列。目前，很少有报道蔬菜源肠杆菌中KPC的检出情况，但是随着碳青霉烯类药物的广泛使用，产KPC酶耐药基因会越来越多，增加了污染蔬菜的机会，从蔬菜源微生物中检测出KPC基因应该引起重视。自NDM酶受到全球的关注后，产NDM酶肠杆菌已经在全世界范围内流行（Walshetal.,2011），尤其是人医临床，截止到2012年底，全世界共有136例感染NDM阳性菌病例报道，报道中携带blaNDM基因的多为肺炎克雷伯菌和大肠杆菌（Berrazegetal.,2014）。本研究中从市场零售鸡肉中分离得到的一株携带blaNDM-9基因的ST167型大肠杆菌。blaNDM-9质粒可通过接合水平传播，但是质粒分型未成功。大肠杆菌中最流行的是NDM-1型酶，其他突变型都呈散在分布。Zhang等2016年在上海某医院病人种分离到一株携带blaNDM-5基因的ST167型大肠杆菌（Zhangetal.,2016）。Li等2016年，在浙江也检测到一株ST167型携带NDM-5的大肠杆菌。Yousfi等在阿尔及利亚的伴侣动物中分离到一株blaNDM-5基因的大肠杆菌，MLST分型后为ST167型（Yousfietal.,2016）。由此，ST167可能与NDM的传播有一定的联系。本研究在超市零售鸡肉中检测到携带NDM的大肠杆菌有可能是在鸡肉屠宰、运输或者销售过程中受到的污染。blaNDM基因多位于质粒上，且携带该基因的耐药菌常含有多个质粒，质粒上耐药基因的协同作用也使blaNDM阳性菌株具有多重耐药的特性（Walshetal.,2011）。本研究中大肠杆菌THSJ02含有多个不同类型的质粒，各质粒携带不同耐药基因，其中包括同时携带blaNDM-5和fosA3的质粒，携带fosA3，rmtB，blaCTX-M-65的质粒以及携带mcr-1基因的质粒。这三类质粒以及其他耐药机制协同作用，使THSJ02对几乎所有的试验药物耐药，包括原本用于治疗CPE感染的黏菌素也对该菌无效。blaNDM基因常39 位于可接合的IncA/C,IncF,IncL/M,IncX3型上（Poireletal.,2011；Kumarasamyetal.,2010；Nordmannetal.,2011;Yangetal.,2014）。可接合型质粒可以在细菌之间水平传播，增加了blaNDM扩散的机会，另外由于多质粒多耐药基因之间协同作用，使NDM阳性菌获得更好的适应环境的能力，促进了NDM散播。自从质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1被发现后，细菌耐药问题又一次成为全球的焦点。黏菌素在内的多粘菌素是治疗对碳青霉烯药物耐药肠杆菌引起感染的最后一道防线。本研究在超市零售的生鸡肉中发现了一株同时携带blaNDM-9和mcr-1基因的大肠杆菌，对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类药物以及黏菌素均存在耐药现象。这两个基因位于不同质粒，这和中国学者Du等人从病人体内分离得到同时携带blaNDM-5和mcr-1的肺炎克雷伯菌情况相似，该菌也对大部分药物都不敏感（Duetal.,2016）。Hasman等人在鸡肉中检出了携带mcr-1基因的ST131型大肠杆菌，该基因位于IncI2型质粒，（Hasmanetal.,2015），本文中mcr-1也位于IncI2质粒。食品中携带mcr-1基因的报道已不少见，而今在食品中发现了同时携带mcr-1和blaNDM-9两种基因的“超级细菌”，不得不使我们惊醒，假如携带耐药基因的大肠杆菌随食物进入胃肠道，可接合性质粒携耐药基因转移入其他革兰氏阴性菌中，对人类健康将会造成更大的影响。因此，我们必须阻止这些耐药基因的进一步传播。食品与人类的生活息息相关，食品安全问题直接关系人类健康。当前，国内很多媒体出于保证蔬菜营养不损失的目的，倡导生吃蔬菜瓜果。但是，耐药细菌可能会通过灌溉所用的肥料和水源进入土壤，污染蔬菜，最终通过食物链进入人体。本文的耐药性调查数据显示，生吃蔬菜存在食入耐药菌的风险。而零售的新鲜肉类在加工运输等过程中，暴露于空气或接触等原因，可能会加大受耐药菌污染的概率。在国际贸易的迅速发展的今天，进出口蔬菜和肉类食品会加速耐药基因的跳跃式的传播，这些都应该引起足够的重视。这些潜在的危害也提示我们应该加强食品生产加工过程的安全措施，采用高温消毒等正确的食用方式，尽可能降低“超级细菌”给公众健康带来的危害。40 5结论（1）蔬菜源产ESBL肠杆菌主要携带blaCTX-M-15和blaCTX-M-55基因。（2）首次在蔬菜中检出产KPC酶大肠杆菌，多序列位点分型结果为ST877型。该基因位于一个大小约54kb的质粒上，复制子分型未成功，对黏菌素和替加环素敏感，对其余几种药物均存在耐药现象，用亚胺培南药板筛选出的接合子对亚胺培南和头孢类药物不敏感。（3）首次在零售鸡肉中检出同时携带blaNDM-9和mcr-1基因的大肠杆菌，该菌还携带floR、fosA3、rmtB和blaCTX-M-65基因，多序列位点分型结果为ST167，除对多西环素和替加环素敏感以外，对其余药物全部耐药。41 致谢在导师刘健华教授的悉心指导和严格要求下终于完成了本论文，导师严谨的治学态度、开阔的科研视野、无私的奉献精神、宽厚待人的为人准则是我永远学习的榜样。在此，谨向刘老师致以最诚挚和最衷心的谢意！感谢本实验室陈杖榴教授、曾振灵教授、刘雅红教授、方炳虎教授、丁焕中教授、孙永学教授、陈建新教授、贺利民教授、蒋红霞教授、陈红副教授、黄显会高级兽医师、廖晓萍副教授、汤有志副教授、孙坚副教授，曾东平、潘广方、和蒋佩莲老师等在实验中给予大力帮助。在此特向各位老师致以深深的谢意！感谢华南农业大学兽医药理研究室贺丹丹、吕鲁超、刘小琴等博士研究生，感谢刘艺云、曾莉、俞林锋、李伟、赵丽青、郭泽文、植婵萍、易灵娴、张秀风、郭保卫、宋倩华、吴仁杰、罗娟、马振报等硕士研究生，感谢周宇星、唐勇东、许艳杰、鲁红升、黄斯诚等本科生及其他多位同学在实验及论文写作过程中对我的帮助和支持。感谢攻读硕士学位期间兽医学院各位领导的关心和帮助。感谢我的家人多年来对我的默默奉献和支持，正是有了他们的关爱，我才能顺利完成我的学业。最后，再次感谢所有给予我关心和帮助的人！本研究得到973项目2013CB127200和广东省高等学校高层次人才项目的资助，特此致谢！42 参考文献胡付品,朱德妹,汪复,等.2014年CHINET中国细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志,2015(05):401-410AbdallahHM,ReulandEA,WintermansBB,etal..Extended-spectrumbeta-lactamasesand/orcarbapenemases-producingEnterobacteriaceaeisolatedfromretailchickenmeatinZagazig,Egypt[J].PLoSOne,2015,10(8):e136052.AccogliM,GianiT,MonacoM,etal..EmergenceofEscherichiacoliST131sub-cloneH30producingVIM-1andKPC-3carbapenemases,Italy[J].JAntimicrobChemother,2014,69(8):2293-2296.AdlerA,Miller-RollT,AssousMV,etal..AmulticenterstudyoftheclonalstructureandresistancemechanismofKPC-producingEscherichiacoliisolatesinIsrael[J].ClinMicrobiolInfect,2015,21(3):230-235.BauernfeindA,GrimmH,SchweighartS.AnewplasmidiccefotaximaseinaclinicalisolateofEscherichiacoli[J].Infection,1990,18(5):294-298.BerrazegM,DieneS,MedjahedL,etal..NewDelhiMetallo-beta-lactamasearoundtheworld:aneReviewusingGoogleMaps[J].EuroSurveill,2014,19(20).BonnetR.Growinggroupofextended-spectrumbeta-lactamases:theCTX-Menzymes[J].AntimicrobAgentsChemother,2004,48(1):1-14.BonninRA,PoirelL,CarattoliA,etal..CharacterizationofanIncFIIplasmidencodingNDM-1fromEscherichiacoliST131[J].PLoSOne,2012,7(4):e34752.BradfordPA,BratuS,UrbanC,etal..Emergenceofcarbapenem-resistantKlebsiellaspeciespossessingtheclassacarbapenem-hydrolyzingKPC-2andinhibitor-resistantTEM-30beta-lactamasesinNewYorkCity[J].ClinicalInfectiousDiseases,2004,39(1):55-60.BratuS,LandmanD,HaagR,etal..Rapidspreadofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeinNewYorkCity:anewthreattoourantibioticarmamentarium[J].ArchInternMed,2005,165(12):1430-1435.BraunSD,DorneanuOS,VremeraT,etal..Carbapenemase-producingEnterobacteriaceae:a2-yearsurveillanceinahospitalinIasi,Romania[J].FutureMicrobiology,2016.BuchholzU,BernardH,WerberD,etal..GermanoutbreakofEscherichiacoliO104:H4associatedwithsprouts[J].NEnglJMed,2011,365(19):1763-1770.BushK.Alarmingbeta-lactamase-mediatedresistanceinmultidrug-resistantEnterobacteriaceae[J].CurrentOpinioninMicrobiology,2010,13(5):558-564.CaiJC,ZhangR,HuYY,etal..EmergenceofEscherichiacolisequencetype131isolatesproducingKPC-2carbapenemaseinChina[J].AntimicrobAgentsChemother,2014,58(2):1146-1152.CamposJ,MouraoJ,PestanaN,etal..Microbiologicalqualityofready-to-eatsalads:anunderestimatedvehicleofbacteriaandclinicallyrelevantantibioticresistancegenes[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2013,166(3):464-470.CarattoliA.Animalreservoirsforextendedspectrumbeta-lactamaseproducers[J].ClinMicrobiolInfect,43 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