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学校代码：１０２８５学号：２０１４５２３３０３０ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ硕士学位论文．铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏ＭＲ成像Ｔ２ＷＩ增强效应分析及其病理基础研究ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｉｔｅｆｆｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｏｎＭＲＴＷＩａｎｄｂａｓｉｃ§ｉＭｍｓｒｆＢｉｇｔｙ—ｃａ＾ａａａｔ２ｐｉｌｉｖｅｒｂｙｎａｎｏｃｏｎｔｒａｓｔａｅｎｔｍａｎａｎｅｓｅｈｅｘａｃｖａｎｏｆａｉａｔｅｐｏｔａａｍｏａｓｓｉｉｉｍｐｇｇ研究生姓名徐耀ｂ指导教师姓名范国华专业名称影像医学与核医学研究方向胸腹部所在院部苏州大学附属第二医院论文提交日期２０１７－５０＊．■ 学校代码：10285学号：20145233030 学校代码：10285学号：20145233030 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究中文摘要第一部分铁氰化锰钾纳米颗粒物化特性及生物特性目的：通过对铁氰化锰钾纳米颗粒基本表征、稳定性、均匀性、磁性特征及生物毒性的分析，探讨铁氰化锰钾纳米颗粒作为MR对比剂的可行性及优势。方法：应用高分辨率透射电子显微镜（TEM）观察分析铁氰化锰钾纳米颗粒的大小、粒径分布、形态及表征；应用X射线粉末衍射仪测定铁氰化锰钾纳米颗粒的基本介孔结构和物相结构；应用0.5T核磁共振分析仪测定铁氰化锰钾纳米颗粒的纵向弛豫率R1及横向弛豫率R2；根据不同浓度（浓度分别为0.96、1.92、3.83、7.67mmol/L）的铁氰化锰钾纳米溶液进行体外MR成像，分析其浓度与磁共振信号强度变化的相关性。将ICR小鼠随机分成6组（5组为注射组，1组为空白对照组），注射组经尾静脉注射不同浓度的铁氰化锰钾纳米对比剂（410.4mg/kg、482.22mg/kg、513mg/kg、567.38mg/kg、615.6mg/kg体重），空白对照组注射生理盐水，观察给药后14天内所有小鼠的中毒及死亡情况。结果：制备的铁氰化锰钾纳米颗粒在高分辨率透射电镜下呈正方体，粒径均一，直径约30nm。X射线粉末衍射及透射电镜电子能谱分析测定其分子式为KMn[Fe(CN)6]2H2O。铁氰化锰钾纳米粒子的粒径分布较窄，峰值约90nm。0.5T核磁共振分析仪测定该颗粒的横向弛豫率R-1-12为1.2074mMs，纵向弛豫率R1为0.7599mM-1s-1。不同浓度的铁氰化锰钾纳米粒子T1、T2加权像信号强度差异非常明显，对比剂浓度与核磁共振图像信号强度成正相关性，浓度越高，图像信号强化越强。小鼠半数致死量（501.1mg/kg）是小鼠最佳有效剂量（4.9mg/kg）的102倍，安全剂量范围较大。结论：铁氰化锰钾纳米颗粒的表面结构稳定、粒径均一、分散性好、具有良好的生物相容性。铁氰化锰钾纳米颗粒具有较高的R1弛豫率和R2弛豫率，其浓度与磁共I 振图像信号强度具有明显相关性，可作为T1、T2对比剂。铁氰化锰钾纳米对比剂剂量使用具有足够的安全范围。关键词：锰；纳米；对比剂；磁共振成像；横向弛豫率；纵向弛豫率II 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠不同器官磁共振T2WI增强效果分析目的：经大鼠尾静脉注射45mmol/L浓度的铁氰化锰钾纳米对比剂，于注射后不同时间点对大鼠不同器官（心肌、肝脏、肾脏）进行磁共振增强扫描，分析各器官的增强效果及强化特点，探讨铁氰化锰钾纳米对比剂的组织分布特性及增强时效性。方法：取同龄、雄性SD大鼠16只，随机分成两组，每组8只，随机选取一组为扫描组，另一组为空白对照组，分别对扫描组每只大鼠进行TSE-T1WI、TSE-T2WI序列平扫，扫描器官包括心肌、肝脏及肾脏。然后经尾静脉注射45mmol/L的铁氰化锰钾纳米对比剂（剂量为1ml/300g体重），分别于注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h行大鼠不同器官（心肌、肝脏、肾脏）MR扫描，测量增强后各时间点及增强前各器官的信号强度（SI）和背景噪声信号强度的标准差（SD），计算各器官信噪比（SNR）及信号增强率（SER），绘制各器官信噪比(SNR)-时间动态变化曲线及信号增强率（SER）-时间动态变化曲线，采用单因素方差分析比较增强后各时间点心肌、肝脏、肾脏SI、SNR及SER的差异有无统计学意义。结果：铁氰化锰钾纳米对比剂注射前及注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h，大鼠心肌T2WI的SI分别为：253.21±33.17、152.19±15.46、153.96±11.66、146.61±10.19、116.32±9.74、111.23±6.61、124.17±11.48、147.48±13.27、200.19±28.82；SNR分别为：10.09±1.60、6.22±1.88、5.90±0.59、5.90±1.06、4.96±0.98、5.47±0.89、5.59±1.01、8.09±1.88、9.79±1.65；注射后5min～10h各时间点心肌SER分别为：0.37±0.23、0.40±0.10、0.39±0.17、0.49±0.12、0.44±0.17、0.43±0.13、0.21±0.17、0.16±0.14。注射铁氰化锰钾纳米对比剂后心肌可见强化，其SI于3h信号强度最低、SNR及SER于2h达到高峰，1h～4.5h之间强化基本平稳，随后强化程度逐渐减弱，10h后逐渐恢复。5min-6h各时间点心肌SNR与平扫比较差异具有统计学意义（P＜0.05），10h心肌SNR与平扫比较差异无统计学意义（P＞0.05）。5min-4.5h各时间点心肌SER与6h心肌SER比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。5min-6h各时间点心肌SER与10h心肌SER比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。III 铁氰化锰钾纳米对比剂注射前及注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h，大鼠肾脏皮质T2WI的SI分别为：757.46±144.47、560.26±100.74、506.60±98.87、531.50±106.54、363.36±145.11、413.86±170.66、529.67±157.21、443.49±58.46、512.34±44.51；SNR分别为：35.42±4.62、29.54±10.77、18.42±3.48、17.40±2.92、15.71±6.13、15.85±3.99、18.37±5.17、16.78±7.43、16.66±5.26；注射后5min～10h各时间点SER分别为：0.25±0.18、0.30±0.23、0.28±0.08、0.50±0.09、0.42±0.15、0.34±0.21、0.36±0.16、0.29±0.17。铁氰化锰钾纳米对比剂注射前及注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h，大鼠肾脏髓质T2WI的SI分别为：876.48±71.93、622.45±156.38、512.84±165.74、560.46±131.09、484.84±238.80、520.22±56.74、464.24±56.74、546.62±96.25、692.64±114.00；SNR分别为：43.15±5.24、23.16±5.93、18.58±7.67、18.15±6.30、16.75±3.54、20.68±4.81、22.81±4.50、21.50±5.95、26.21±5.02；注射后5min～10h各时间点SER分别为:0.44±0.16、0.57±0.08、0.58±0.08、0.61±0.17、0.58±0.15、0.57±0.04、0.56±0.19、0.56±0.16。注射铁氰化锰钾纳米对比剂后肾脏T2WI信号逐渐降低，强化程度逐渐增加，肾脏皮质于2h强化达到峰值，2小时后肾脏皮质强化程度逐渐降低。肾脏髓质于2h后强化达到峰值，肾脏髓质延迟强化至10h。5min-10h各时间点肾脏皮质SI、SNR分别与平扫比较，5min-10h各时间点肾脏髓质SI、SNR分别与平扫比较，P<0.05，差异均具有统计学意义。2h肾脏皮质SER分别与5min、30min、1h、3h、4.5h、6h、10h肾脏皮质SER比较，P<0.05，差异具有统计学意义。2h肾脏髓质SER分别与3h、4.5h、6h、10h肾脏髓质SER比较，P<0.05，差异具有统计学意义。4.5h肾脏髓质SER与6h肾脏髓质SER比较，6h肾脏髓质SER与10h肾脏髓质SER比较，P>0.05，差异均无统计学意义。铁氰化锰钾纳米对比剂注射前及注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h，大鼠肝脏T2WI的SI分别为：305.70±75.81、104.54±23.84、93.70±14.99、85.46±17.84、104.22±16.02、116.45±23.43、126.51±14.08、139.91±27.36、156.95±28.57；SNR分别为：14.25±7.70、4.91±1.96、3.76±0.92、3.30±0.71、4.37±1.54、4.69±2.51、6.25±2.21、5.34±1.95、7.04±2.50；注射后5min～10h各时间点SER分别为：0.64±0.19、0.71±0.12、0.75±0.15、0.67±0.16、0.69±0.22、IV 0.56±0.22、0.60±0.20、0.51±0.25。注射铁氰化锰钾纳米对比剂后肝脏T2WI强化迅速且明显，5min肝脏SI明显降低，SER为0.64±0.19，30min后肝脏实质信号持续降低，SER为0.71±0.12，1h肝脏强化达到峰值，SER为0.75±0.15，4.5h肝脏SER明显下降。注射对比剂后5min-10h各时间点肝脏SNR与平扫比较，P<0.05，差异均具有统计学意义。5min-6h各时间点肝脏SER与10h的SER比较，30min-3h各时间点肝脏SER与4.5h的SER比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。结论：铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏的T2负性增强效果明显，成像时间窗较长，注射后5min开始出现T2负性增强效果，于1h到达强化峰值，保持平台型强化至3h。肝脏强化效果最明显，肾脏次之，心肌强化最弱；肾脏强化相对较慢，肾脏皮质、髓质于2h达到强化峰值，肾脏髓质强化平台期较长，约持续5h。铁氰化锰钾纳米对比剂可作为肝脏T2负性对比剂。关键词：锰；对比剂；器官；肝脏；特异性；磁共振成像V 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏增强的病理基础分析目的：通过注射铁氰化锰钾纳米对比剂，于不同时间点对大鼠肝脏取材进行病理组织学检查，分析铁氰化锰钾纳米颗粒在大鼠肝脏的生物性分布、代谢特点，探讨铁氰化锰钾纳米对比剂的增强原理。方法：取同龄、雄性SD大鼠22只，随机分成两组，实验组11只，对照组11只。对实验组大鼠经尾静脉注射45mmo/L的铁氰化锰钾纳米对比剂，注射剂量为1ml/300g，分别于注射对比剂后5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h行肝脏组织取材。对照组SD大鼠作为空白对照组行肝脏组织取材。对12只SD大鼠肝脏行光镜、电镜取材后，常规固定制片进行光镜、电镜观察，分析铁氰化锰钾纳米颗粒在SD大鼠肝脏内的分布特点。结果：正常大鼠肝脏HE染色显示肝小叶结构完整，肝细胞形态规则，汇管区结构清晰。普鲁士蓝铁染色法染色显示肝窦区可见蓝染细小颗粒，注射后1-2小时时间段肝窦区蓝染颗粒最多，16小时、24小时时间段肝窦区蓝染颗粒基本消失。电镜检查显示氰化锰钾纳米颗粒在肝窦区Kupffer细胞内呈簇状聚集，通过电镜能谱元素分析符合铁氰化锰钾化学式KMn[Fe(CN)6]。结论：经尾静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂后，纳米颗粒被肝脏Kupffer细胞摄取，在肝窦区Kupffer细胞内聚集。肝脏摄取的铁氰化锰钾纳米颗粒数量与时间呈相关性，于注射后1-2小时摄取数量最多，该分布特征与铁氰化锰钾纳米对比剂肝脏MR成像信号变化特征一致。关键词：锰；对比剂；病理；普鲁士蓝染色；HE染色；电镜作者：徐耀导师：范国华VI ExperimenteffectanalysisonMRT2WIandbasicpathologyfeaturesofliverbynanocontrastagentmanganesehexacyanoferratepotassiumpotassiumAbstractPartⅠThebasicphysicochemicalpropertiesandbiologicalofpropertiesmanganesehexacyanoferratepotassiumpotassiumnanoparticlesObjective:Toanalyseofpotassiummanganesehexacyanoferratenanoparticlesbasiccharacterization,stability,uniformity,magneticcharacteristicsandbiologicaltoxicity,exploringitsfeasibilityandadvantageofMRcontrastagents.Methods:Theapplicationofhighresolutiontransmissionelectronmicroscopy(TEM)observationandanalysisofmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticlesize,particlesizedistribution,morphologyandcharacterization;determinationofmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlesusingX-raypowderdiffractionofmesoporousstructureandphasestructure;transverserelaxationusing0.5TMRanalyzerdeterminationofmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticleslongitudinalrelaxationrateofR1andthetransverserelaxationrateofR2;accordingtodifferentconcentration(concentrationwere0.96,1.92,3.83,7.67mmol/L)ofthemanganesehexacyanoferratepotassiumpotassiumsolutioninvitroMRimaging,correlationanalysisbetweentheconcentrationandthemagneticresonancesignalintensitychanges.TheICRmicewererandomlydividedinto6groups(5groupsforinjectiongroup,the1groupwascontrolgroup),intravenousinjectionofdifferentconcentrationsofironandmanganesepotassiumhydridenanocontrastagent(410.4mg/kg,482.22mg/kg,513mg/kg,567.38mg/kg,615.6mg/kg),thecontrolgroupwereinjectedwithsaline,observeallmicewereadministeredfor14daysaboutthepoisoninganddeath.Results:Manganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlespreparedbycubeinhighresolutiontransmissionelectronmicroscope,uniformparticlesize,adiameterofabout30nm.ThemolecularformulaKMn[Fe(CN)6]2H2OwasdeterminedbyXraypowderdiffractionandelectronmicroscope.TheparticlesizedistributionofpotassiumVII manganesehexacyanoferratenanoparticlesisnarrowandthepeakvalueisabout90nm.Thetransverserelaxationrateof1.2074mM-1s-1wasdeterminedby0.5Tmagneticresonanceanalyzer,andlongitudinalrelaxationratewas0.7599mM-1s-1.ThesignalintensityofT1andT2weightedimagesofdifferentconcentrationsofpotassiumhexacyanoferratenanoparticleswasveryobvious,andtheconcentrationofcontrastmediumwaspositivelycorrelatedwiththeintensityofthesignal.Themedianlethaldose(501.1mg/kg)ofmicewas102timesthatofthebesteffectivedose(4.9mg/kg),andthesafedoserangewaswide.Conclusions:Thesurfacestructureofmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticlesstable,uniformparticlesize,gooddispersibilityandgoodbiocompatibility.ManganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticleswithhighR1relaxivityandR2relaxationrate,withitsconcentrationandthemagneticresonancesignalintensityofimagecorrelation,whichcanbeusedasT1andT2contrastagent.Withsafeenoughtousepotassiummanganesehexacyanoferratenanoparticlesdose,goodbiocompatibility.Keywords:manganese;nano;contrastagent;magneticresonanceimaging;transverserelaxationrate;longitudinalrelaxationrateVIII PartⅡMRT2WIenhancementeffectindifferentorgansoftheratwithdifferentconcentrationofmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticlescontrastagentObjective:Afterinjecting45mmol/Lmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentthroughthetailveinoftheratsatdifferenttimepoints,MRIenhancedscaninratsindifferentorgans(heart,liverandkidney),thenanalyzingthebiologicaldistributionrelationshipsbetweeninjectionconcentrationandthedegreeofenhancementindifferentorgansoftherat.Methods:16healthymaleSDratswererandomlydividedinto2groups,onegroupwith8ratsforinjecting,theothergroupwith8ratforblankcontrolgroup.TheTSE-T1WIandTSE-T2WIsequencesofeachratsinthescanninggroupwerescanned,andthescanningorgansincludedthemyocardium,liverandkidney.StartMRscanningindifferentorgansoftherat(heart,liverandkidney)afterinjecting45mmol/Lmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagent（doseweightratio1ml/300g）throughthetailveinoftheratson5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h。Themeasurementofeachorganaboutsignalintensity(SI)andbackgroundnoisesignalintensity,standarddeviation(SD)ateachtimepointafterenhancement,calculatingtheorgansignal-to-noiseratio(SNR)andsignalenhancementratio(SER),renderingtheorgansofsignal-to-noiseratio(SNR)-timeandsignalenhancementratio(SER)-timecurve,comparedwithonefactoranalysisofvarianceincreasedateachtimepointaboutheart,liverandkidneySI,SNRandSERhavenosignificantdifference.Results:Manganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentbeforeandafterinjectionof5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h,myocardialSIwere：253.21±33.17、152.19±15.46、153.96±11.66、146.61±10.19、116.32±9.74、111.23±6.61、124.17±11.48、147.48±13.27、200.19±28.82；SNRwere：10.09±1.60、6.22±1.88、5.90±0.59、5.90±1.06、4.96±0.98、5.47±0.89、5.59±1.01、8.09±1.88、9.79±1.65；afterinjection5minto10hateachtimepoint,themyocardialSER:0.37±0.23、0.40±0.10、0.39±0.17、0.49±0.12、0.44±0.17、0.43±0.13、0.21±0.17,0.16±0.14.Injectionofmanganesehexacyanoferratenanoparticlesenhancedmyocardialpotassiumaftercontrast,SI,SNRandSERreachedthepeakat1h,1h~4.5htostrengthenthebasicsmooth,thenIX theenhancementdegreedecreasedgradually,graduallyrecoveredafter10h.SI,SNRandSERinthemyocardiumafter10hwere200.19±28.82、9.79±1.65、0.16±0.14,comparedwiththemyocardialSIandSNR,therewasstatisticaldifference.ThedifferenceofmyocardialSNRbetween5min-6handplainscanwasstatisticallysignificant(P<0.05).Thedifferenceof10htimebetweenDuanXinjiSNRandplainscanwasnotstatisticallysignificant(P>0.05).5min-4.5hmyocardialSERateachtimepointcomparedwith6h,P<0.05,thedifferencewasstatisticallysignificant.5min-6hmyocardialSERateachtimepointcomparedwith10h,P<0.05,thedifferencewasstatisticallysignificant.Manganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentbeforeandafterinjectionof5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h,ratrenalcortexSIwere757.46±144.47、560.26±100.74、506.60±98.87、531.50±106.54、363.36±145.11、413.86±170.66、529.67±157.21、443.49±58.46、512.34±44.51;SNRwere35.42±4.62、29.54±10.77、18.42±3.48、17.40±2.92、15.71±6.13、15.85±3.99、18.37±5.17、16.78±7.43、16.66±5.26;SERwere0.25±0.18、0.30±0.23、0.28±0.08、0.50±0.09、0.42±0.15、0.34±0.15、0.36±0.16、0.29±0.17.Manganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentbeforeandafterinjectionof5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h,renalmedullaSIwere876.48±71.93、622.45±156.38、512.84±165.74、560.46±131.09、484.84±138.80、520.22±56.74、464.24±56.74、546.62±96.25、692.64±114.00;SNRwere43.15±5.24、23.16±5.93、18.58±7.67、18.15±6.30、16.75±3.54、20.68±4.81、22.81±4.50、21.50±5.95、26.21±5.02;SERwere0.44±0.16、0.57±0.08、0.58±0.08、0.61±0.17、0.58±0.15、0.57±0.04、0.56±0.19、0.56±0.16.Injectionofmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentkidneyaftersignalintensitydecreasedgradually,theenhancementdegreegraduallyincreased,therenalcortexin2henhancedtopeak,2hoursaftertherenalcortexenhancementdegreedecreasedgradually.10hourslater,theSI,SNRandSERofrenalcortexwere512.34±44.51、16.66±5.26、0.29±0.17,respectively,buttherewassignificantdifferencebetweenthetwogroups.Therenalmedullaincreasedtothepeakafter2h,andtherewasnosignificantdecreaseinthedegreeofrenalenhancementinthe2h-10hperiod.10hourslater,theSI,SNRandSERofrenalX medullawere692.64±114.00、26.21±5.02、0.56±0.16,andthedifferencewassignificantbetweentheplainandthemedullaofkidney.2hrenalcortexSER,respectively,comparedwith5min,30min,1H,3h,4.5H,6h,10h,renalcortexcomparedwithP<0.05,thedifferencewasstatisticallysignificant.2HrenalmedullaSERwerecomparedwith5min,30min,4.5H,6h,10hrenalcortex,P<0.05,thedifferencewasstatisticallysignificant.4.5HrenalmedullaSERcomparedwith6h、10h,kidney,medulla,SER,P>0.05,thedifferencewasnotstatisticallysignificant.Manganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentbeforeandafterinjectionof5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h,liverSIwere305.70±75.81、104.54±23.84、93.70±14.99、85.46±17.84、104.22±16.02、116.45±23.43、126.51±14.08、139.91±27.36、156.95±28.57；SNRwere14.25±7.70、4.91±1.96、3.76±0.92、3.30±0.71、4.37±1.54、4.69±2.51、6.25±2.21、5.34±1.95、7.04±2.50；SERwere0.64±0.19、0.71±0.12、0.75±0.15、0.67±0.16、0.69±0.22、0.56±0.22、0.60±0.20、0.51±0.25.Afterinjectionofnanoparticlescontrastagent,theliverwasenhancedrapidlyandobviously,theSIofliverwassignificantlyreducedafter5min,SERwas0.64±0.19,thedifferencewasstatisticallysignificant.1hafterliverenhancementintensitytothepeak,thenbegantostrengthen,4.5hdecreasedsignificantlyafter10h,SNR,SER,SIinliverwere156.95±28.57、7.04±2.50、0.51±0.25,andthescanofliverSI,SNRstillhasastatisticallysignificantdifferencewithenhancement.Intravenousinjectionofnanoparticlescontrastagentafter5min,comparedwithplain,liverSERwas0.64±0.19,30minaftertheliversignalcontinuestorise,1hafterliverenhancementpeakwas0.75±0.15,SER,3hafterliverSERdecreasedsignificantly.ComparisonSNRbetween5minand30mininliverafterinjectioncontrastagent.Afterinjectionofcontrastagents,liverSNRateachtimepointof5min-10hcomparedwithplainscan,P<0.05,thedifferencewasstatisticallysignificant,P<0.05.5min-6heachtimepointliverSERand10hcomparison,30min-3heachtimepointliverSERand4.5Hcompare,P<0.05,thedifferencehasstatisticalsignificance.Conclusions:ManganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagentonratliverT2negativesignificantlyenhancetheeffectofimagingalongertimewindow,theliverin5minT2initialnegativeenhancementeffect,after1hreachedthepeakenhancement,andtokeeptheplatformenhancedto3h.ManganesehexacyanoferrateXI nanoparticlescanbeusedaspotassiumcontrastagentliverT2negativecontrastagent.Themyocardialenhancementeffectwasthesecond;therenalenhancementeffectwasrelativelyslow,andtherenalcortexandmedullareachedthepeakvalueat2h,andtherenalmedullawasenhancedbyabout5h.Keywords:manganese;contrastagent;organ;liver;specificity;magneticresonanceimagingXII PartⅢAnalysisofpathologicalbasisofenhancedlivercontrastwithmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticlesinratsObjective:Injectingmanganesehexacyanoferratepotassiumnanoparticlescontrastagentbytheoptimalconcentration(45mmol/L)indifferenttime.Theliverofratswasexaminedbylightmicroscopyandelectronmicroscopy,anddiscussingnanoparticlescontrastagentinratliverbiologicaldistribution(subcellularlevel),distributioncharacteristics，thetimepointofcontactandenhanceprinciple.Methods:22healthymaleSDratswererandomlydividedinto2groups,onegroupwith11ratsforinjecting,theothergroupwith11ratforblankcontrolgroup.Onexperimentalgroup,afterinjecting45mmol/Lmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticlescontrastagent（doseweightratio1ml/300g）throughthetailveinoftheratsthansamplinglivertissue.TheblankgroupwasrandomlyselectedoneSDratasablankcontrolgroup.The12SDratswerenumberedas1-12inchronologicalorder.EachSDratswereperformedwithlightandelectronmicroscopywerefixedaftersectioning,observedandstudythedistributionofnanoparticlescontrastagentinSDrats’liver.Results:HEstainingmethodwasusedtostainthenormalratliver,whichshowedthatthemorphologyoflivercellswascompleteandthenucleuswasclear.StainingofnormalratliverbyPrussianblue,liversinusvisibleblueparticles,thenumbersofbluedyenanoparticlesin1-2hoursofhepaticsinusweremost,nearlyinvisibledisappearancein16hours,24hours.,TheresultsofelectronmicroscopeshowedthatnanoparticlesinthehepaticsinusKupffercellswereclustedaggregation,whichwereaccordwithmanganesehexacyanoferratepotassiumpotassiumchemicalformulaKMn[Fe(CN)6]byelementanalysisofelectronmicroscopy.Conclusions:Afterintravenousinjectionofmanganesepotassiumhexacyanoferratenanoparticles,contrastagentsisliverspecificuptake,mainlymasslikeaccumulationinthehepaticsinusKupffercells.Thequantityofmanganesehexacyanoferratenanoparticlesuptakedbyliverhadcorrelationwithtime.Thehighestintakewasafter1hour,thecharacteristicsmatchmanganesepotassiumhexacyanoferrateintheSDratsvivoMRimagingfeatures.XIII Keywords:manganese；contrastagent;pathology；prussian；electronmicroscope；HEWrittenbyXuYaoSupervisedbyFanGuoHuaXIV 目录前言....................................................................................................................................1参考文献............................................................................................................................6第一部分铁氰化锰钾纳米颗粒物化特性及生物特性..................................................8材料与方法........................................................................................................................8一、材料及仪器............................................................................................................8二、方法........................................................................................................................8三、结果....................................................................................................................9讨论..............................................................................................................................14参考文献..........................................................................................................................17第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠不同器官T2WI增强效果分析..................19材料与方法......................................................................................................................19一、材料......................................................................................................................19二、方法......................................................................................................................19结果..............................................................................................................................211、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠心肌T2增强程度分析...........212、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肾脏（皮质、髓质）T2增强程度分析..........................................................................................................................243、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肝脏T2增强程度分析...........30讨论..............................................................................................................................33参考文献..........................................................................................................................37第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏增强的病理基础分析..........................39一、材料..........................................................................................................................391.实验动物...................................................................................................................392.实验试剂及仪器.....................................................................................................39 二、方法......................................................................................................................40三、结果......................................................................................................................42讨论..............................................................................................................................47参考文献..........................................................................................................................53结论..................................................................................................................................57综述..................................................................................................................................58参考文献..........................................................................................................................64中英文对照缩略词表..........................................................................................................68攻读硕士研究生期间公开发表的学术论文......................................................................69致谢..................................................................................................................................70 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究前言前言原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤发病的第六位，死亡率居所有恶性肿瘤的第二位。中国是肝脏疾病的高发国家，全国每年肝癌新发病例约有39万，死亡顺位排位仅次于肺癌[1]。原发性肝癌（简称肝癌）发病隐匿、侵袭性强、恶性程度高，约70%肝癌患者确诊时已属中晚期。随着医学的发展，由肝硬化本身所导致的死亡率正在下降，但是由肝癌所致的死亡率正在上升。肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低肝癌患者死亡率、提高患者生存率的关键。临床常用的肝癌影像学检查方法有超声、CT、MRI、PET、肝血管造影等。目前，磁共振成像（MagneticResonanceImage,MRI）是最先进的无创性影像学检查技术之一，MRI具有无辐射、高分辨率、多序列、多参数成像等优势，尤其是软组织分辨率高，是肝脏影像诊断首选检查之一。MR动态增强扫描具有以下优势:①动脉期对小病灶（尤其小肝癌）检出率高于螺旋CT增强动脉期；②MRI对比剂用量少，为CT的十分之一，安全性好，尤其适用于心、肾功能不全患者；③MRI检查无放射线损伤；④可进行不同序列扫描，有助于病灶的检出及定性。但是，不同组织与肿瘤之间的弛豫时间存在一定的重叠，鉴别诊断存在一定困难。此外，常规检查对微小病灶或早期病变的发现及定性诊断存在一定的限度。为了进一步提高MRI的诊断敏感性，MRI对比剂在临床上的应用越来越广泛。近年来，国内外MRI临床应用中约35%的病例需要进行MR增强检查，相关专家预测这个比例将会随着更高效的对比剂研发而增加[2]。MRI对比剂有多种分类方法[3]，按化学成分可分为顺磁性离子混合物和超顺磁性粒子（包含镧系金属元素和过渡金属元素）；按临床应用可分为主动型（细胞外间隙对比剂、血池对比剂、肝脏特异性对比剂），被动型（被动靶向型）[4]；按MR成像特征可分为，T1弛豫对比剂、T2弛豫对比剂及双弛豫对比剂。目前，临床上普遍应用的MR对比剂Gd-DTPA（二乙三胺五乙酸钆，商品名马根维显）是一种T1弛豫对比剂。Gd-DTPA是小分子离子型对比剂，是线性钆螯合物，属于细胞外间隙型对比剂（ExtracelluarFluidagent，ECFagent）。此外，含钆对比剂钆贝葡胺（Gd-BOPTA)、1 前言铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究钆塞酸二纳（Gd-EOB-DTPA）在临床上也有小范围的使用，Gd-BOPTA以及Gd-EOB-DTPA均通过Gd离子结合特异性蛋白，改变对比剂的药代动力学及代谢途径，前者95%-97%肾脏代谢，3%-5%肝脏代谢，后者50%肾脏代谢，50%肝脏代谢。所有的临床批准的钆类对比剂中，Gd离子均要螯合小分子线型或环型配体，该类对比剂通过静脉注射后，迅速扩散到血管外细胞外间隙中，随后经过微血管循环由原型通过肾脏肾小球过滤代谢。钆类对比剂具有高弛豫率，可以显著提高图像对比度，尤其是对微小病灶及与正常结构不易区分的病灶。但是，该类对比剂引起的肾源性系统纤维化（nephrogenicsystemicfibrosisi,NSF）首次由Grobner[5]于2006年提出，并引起了学者们的广泛关注。随后，美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）发布了关于钆对比剂的相关公共卫生公告，要求把钆剂不良反应写入药品的使用说明中，并要求急性肾损伤及进展到后期的慢性肾病患者不做MRI增强扫描。NSF是属于一种罕见的多系统纤维性疾病[5-8]，第一例发生于1997年，但直到2006年钆对比剂的不良反应才逐渐引起多个领域学者的重视。NSF可能会导致多系统衰弱，皮肤纤维化挛缩和在极端情况下（5%）导致骨折或死亡的后果。NSF这种不可治愈的疾病性质强烈影响钆剂MRI增强对比剂的使用。此外，随着钆对比剂应用越来越广泛，“钆沉积病”逐渐被报道。最新研究发现[9]，虽然大环螯合物提供比柔性开链线性螯合物更稳定的特性可以和钆离子结合，但含钆对比剂进入人体后会以钆离子或者钆螯合物形式存储，特别是在骨骼和大脑中的一些区域，尤其是齿状核和苍白球，因此，“钆沉积病”同样应该被重视。由于钆基对比剂的肾源性系统性纤维化的副作用，探索新的钆对比剂替代物迫在眉睫。近年来，有学者将过渡元素Mn2+应用于新的MRI对比剂研究中。Mn2+具有5个不成对的电子，由于电子自旋特征（高自旋量子数），Mn2+具有较好的顺磁性及较长的弛豫时间[10]。目前，锰基对比剂领域研究活跃，如MnO、Mn3O4，Mn3O4@SiO2，MnO@介孔SiO2、以及中空的MnO纳米粒子。越来越多的锰基MR对比剂应用于人体解剖成像、神经元活动及连接、监测神经元束的研究和脂质体药物输送监控等。在MRI细胞跟踪功能研究方面，Russell[11]采用MnCl2于体外标记NK淋巴细胞、T淋巴细胞跟踪迁移途径，从而评价肿瘤治疗效果。此外，功能化氧化锰纳米颗粒与肿瘤特异性抗体结合对肿瘤进行靶向治疗的技术亦在进一步研发中。2 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究前言为了克服现有螯合物对比剂的诸多缺点，纳米对比剂成为磁共振对比剂的研发热点。新的纳米对比剂包括Gd螯合纳米粒子以及Gd/Mn载合无机纳米粒子等。磁性纳米粒子具有独特的磁学性质，如超顺磁性和高饱和磁化强度等，而且生物相容性较好，毒副作用小，在靶向药物载体、磁共振成像、细胞和生物分子分离、免疫检测等生物医学领域具有广阔的应用前景，这些新型对比剂有望为临床提供更高的成像敏感性、病种的特异性以及追踪癌症的发展和转移等，因此，近年来备受关注。为了拓宽磁性纳米粒子的应用领域，人们对磁性纳米粒子进行各种表面修饰从而实现其功能化。纳米粒子对比剂的进一步研发将不仅仅是临床医学的进步，亦是生命科学的跨越[12]。纳米对比剂具有以下诸多优势[13]，①纳米对比剂可应用于多模式成像中的研究；②可以通过改变化学成分、大小、形状调整生物相容性、磁性特征、对比剂的靶向性；③表面修饰调控生物相容性和稳定性等。尤其是通过表面修饰调控可以与多配体功能耦合，在分子成像领域发挥重要作用，例如靶抗体（标记）、叶酸受体、荧光探针的光学追踪等。此外，纳米对比剂的颗粒大小及生物特性可以使其富集于某种特定的靶器官或靶细胞，从而实现靶成像。国外有学者报道[14]，叶酸结合氧化铁纳米粒子在不诱导细胞毒性的同时可以在体外特异性结合卵巢癌细胞，该T2负性对比剂也可以定位腹腔中卵巢癌转移病灶。王鹏发现[15]，葡萄糖受体过表达与乳腺癌细胞吸收增加有关，因此他通过γ-Fe203@DMSANPs表面链接2-DG（2-脱氧-D-葡萄糖）合成γ-Fe203@DMSA-DGNPs进行体外MRI显示，乳腺癌MDA-MB-231细胞与γ-Fe203@DMSA-DGNPs孵育后，T2WI信号强度明显降低，表明通过2-DG与葡萄糖受体的特异性结合可增加γ-Fe203@DMSA-DGNPs的吸收。这种具有分子探针功能的潜在价值将会在以后精准医疗领域得到充分体现。器官或组织的特异性成像为磁共振对比剂的发展方向。近年来，肝细胞特异性对比剂开始应用于肝脏MR成像，此类对比剂的特点是对比剂被肝细胞（或肝脏）特异性摄取，然后通过胆道系统代谢。目前，临床上常见的肝脏特异性对比剂有锰福地吡三纳（Mn-DPDP），钆贝葡胺（Gd-BOPDA）、钆塞酸二纳（Gd-EOB-DTPA）、SPIO等等。Mn-DPDP是为数不多的Mn基肝脏特异性对比剂，由于DPDP结构与VitB6相似，因而可以通过PLP细胞膜转运系统进入肝细胞内。由于Mn-DPDP是由肝细胞摄取的，因此可以根据病灶是否含有肝细胞的特征对某些疾病进行鉴别，如HCC、肝脏局灶性结节状增生、肝腺瘤等疾病增强扫描后病灶明显强化，而转移瘤不强化。3 前言铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究但是，Mn-DPDP缓慢输注的给药方式在临床上使用受限，此外Mn-DPDP常见的副作用（血压增高、心率加快、呕吐）和不能进行动态增强观察亦是Mn-DPDP的重要缺陷。临床上另外一种常见的肝脏特异性对比剂GD-EOB-DTPA（普美显），于2004年在瑞典首先获批后应用于临床，并于2011年7月在中国正式上市。Gd-EOB-DTPA能被肝细胞特异性摄取的原理是在钆螯合物上加上一个亲脂基团—乙氧基苯甲基(ethoxybenzyl，EOB)，使其具有亲脂性而进入肝细胞内，能够在肝胆期被肝细胞摄取并分泌进入胆道，可以实现肝胆期肝脏和胆道的成像[16]，其中50%的Gd-EOB-DTPA经由胆道排泄，50%经由肾脏排泄。其机理为：Gd-EOB-DTPA进入人体后由有机阴离子转运多肽（OATP）介导而被肝细胞吸收，通过多药耐药相关蛋白（MRP）介导Gd-EOB-DTPA通过胆道经胆汁排泄[17]。有学者认为肝功能下降患者的肝细胞膜表达有机阴离子转移多肽（organicaniontransportingpolypeptide,OATP）的数量也会下降，而50%的Gd-EOB-DTPA是通过肝细胞窦状间隙膜上的有机阴离子转移多肽1B1和OATP1B3摄取的，所以，OATP1B3数量下降必定会导致肝细胞摄取Gd-EOB-DTPA的剂量减少，从而使注射Gd-EOB-DTPA后的肝脏信号强度下降，故通过比较Gd-EOB-DTPA增强前后的信号强度的变化可以评估肝功能的分级。此外，Gd-EOB-DTPA可以动态观察胆道显影情况，实现功能性胆道成像(fMRC)，以反映胆道功能[18-19]。Gd-EOB-DTP磁共振成像有望成为评价肝功能及胆道功能的有效的影像学方法。目前，尽管临床广泛应用的T1对比剂（以钆螯合物为主）、T2负性对比剂（以SPIO为主）均具有较高的灵敏度及准确性。T1对比剂可以增加T1弛豫时间，致T1加权图像显示更亮，如顺磁性的Gd3+和Mn2+等；T2对比剂：超顺磁性物质（如Fe3O4纳米粒子）而T[20]2对比剂可以减少T2弛豫时间，使T2加权图像显示更暗，如超顺磁性物质Fe3O4纳米粒子等。总体而言，T1对比剂优于T2对比剂，因为增亮的信号相对于变暗的信号对于人眼更敏感，可以更清晰区分组织间的信号差异。此外，T2对比剂具有明显的磁化率伪影，常与陈旧性出血、钙化等不易区分。然而，无论是T1对比剂或T2对比剂均具有固有的优点和局限性。具有T1-T2双模态特性的对比剂可以整合两者优势。早在1988年，Weissleder[21]等人进行双对比磁共振成像研究，探讨这种成像方法对乳腺癌肝转移模型的诊断价值。但开发双模式T1和T2加权MR对比剂仍然面临着巨大的挑战，必须对核心基团的表面（羧基集团、硫醇化）进行必要的修4 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究前言饰。Yang[22]等人对二氧化硅包覆的纳米颗粒通过硅烷化胺基，与Gd-DTPA进一步共价结合（二乙烯三胺五乙酸）后链接到RGD肽，实现双向对比，通过对大鼠磁共振成像发现，多功能RGD-NPs可靶向肿瘤细胞的avb3整合素受体，显示细胞表面的受体表达及传递途径，T1-T2双对比模式磁共振成像比单独T1增强能显著提高诊断准确率。本课题主要研究内容：1.对制备的铁氰化锰钾纳米颗粒采用高分辨透射电子显微镜（TEM）、X射线粉末衍射分析、核磁共振分析仪等测定铁氰化锰钾的表征、粒径分布、晶体结构、弛豫率（T1／T2）等。通过小鼠实验研究，探讨铁氰化锰钾纳米粒子的生物毒性，及其作为MR对比剂的可行性。2.经SD大鼠尾静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂后，于不同时间点对大鼠不同器官（心肌、肝脏、肾脏）进行MR扫描，观察分析其强化程度，测量并计算各器官的SI、SNR、SER，探讨铁氰化锰钾纳米对比剂对不同器官的T2WI增强时效性，探讨铁氰化锰钾纳米对比剂作为T2负性对比剂的可行性。3.经SD大鼠尾静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂，并设立对照组，于注射后不同时间点（5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h）对大鼠肝脏进行取材，分别采用高分辨率扫描电镜和光镜观察铁氰化锰钾纳米颗粒在肝脏中的分布及代谢特点，探讨铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏增强的病理基础及其增强原理。5 前言铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究参考文献[1].王黎君,殷鹏,刘韫宁,等.1990年与2013年中国人群肝癌疾病负担研究[J].中华流行病学杂志,2016,37(6):758-762.[2].HingoraniDV,BernsteinAS,PagelMD.AreviewofresponsiveMRIcontrastagents:2005-2014[J].ContrastMediaMolImaging,2015,10(4):245-265.[3].XiaoYD,PaudelR,LiuJ,etal.MRIcontrastagents:Classificationandapplication(Review)[J].IntJMolMed,2016,38(5):1319-1326.[4].WatersEA,WicklineSA.ContrastagentsforMRI[J].BasicResCardiol,2008,103(2):114-121.[5].GrobnerT.Gadolinium-aspecifictriggerforthedevelopmentofnephrogenicfibrosingdermopathyandnephrogenicsystemicfibrosis?[J].NephrolDialTransplant.,2006,21(4):1104-1108.[6].PanD,CaruthersSD,SenpanA,etal.Revisitinganoldfriend:manganese-basedMRIcontrastagents[J].WileyInterdiscipRevNanomedNanobiotechnol,2011,3(2):162-173.[7].MitsumoriLM,BhargavaP,EssigM,etal.Magneticresonanceimagingusinggadolinium-basedcontrastagents[J].TopMagnResonImaging,2014,23(1):51-69.[8].FraumTJ,LudwigDR,BashirMR,etal.Gadolinium-basedcontrastagents:Acomprehensiveriskassessment[J].JMagnResonImaging,2017.[9].MalikovaH，HolestaM.Gadoliniumcontrastagents-aretheyreallysafe?JVascAccess[J].2017,18(2):1-7.[10].ZhenZ,XieJ.Developmentofmanganese-basednanoparticlesascontrastprobesformagneticresonanceimaging[J].Theranostics,2012,2(1):45-54.[11].AokiI,TakahashiY,ChuangKH,etal.CelllabelingformagneticresonanceimagingwiththeT1agentmanganesechloride[J].NMRBiomed,2006,19(1):50-59.[12].ZhuD,LiuF,MaL,etal.Nanoparticle-BasedSystemsforT1-WeightedMagneticResonanceImagingContrastAgents[J].IntJMolSci,2013,14(5):10591-10607.[13].孟洁,许海燕.纳米材料在分子影像学研究中的应用进展[J].中国生物医学工程学报,2011,30(1):1-5.[14].HeZ,LiJ,YongH,etal.Folicacid-targetedironoxidenanoparticlesascontrastagentsformagneticresonanceimagingofhumanovariancancer[J].JOvarianRes,6 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究前言2016,9(1):1-8.[15].王鹏,单秀红,熊非,等.2-脱氧-D-葡萄糖标记的氧化铁纳米粒对乳腺癌细胞和正常细胞靶向性的比较[J].中华肿瘤杂志,2013,35(8):566-571.[16].VanBeersBE,PastorCM,HussainHK.Primovist,Eovist:whattoexpect?[J].JHepato,2012,57(2):421-429.[17].VanMontfoortJE,StiegerB,MeijerDK,etal.HepaticuptakeofthemagneticresonanceimagingcontrastagentgadoxetatebytheorganicaniontransportingpolypeptideOatp1[J].JPharmacolExpTher,1999,290(1):153-157.[18].TakaoH,AkaiH,TajimaT,etal.MRimagingofthebiliarytractwithGd-EOB-DTPA:effectofliverfunctiononsignalintensity[J].EurJRadiol,2011,77(2):325-329.[19].OkadaM,IshiiK,NumataK,etal.CanthebiliaryenhancementofGd-EOB-DTPApredictthedegreeofliverfunction?[J].HepatobiliaryPancreatDisInt,2012,11(3):307-313.[20].ShenZ,WuA,ChenX.IronOxideNanoparticleBasedContrastAgentsforMagneticResonanceImaging.MolPharm,2017,14(5):1352-1364.[21].WeisslederR,SainiS,StarkDD,etal.Dual-contrastMRimagingoflivercancerinrats[J].AmericanJournalofRoentgenology,1988,150(3):561-566.[22].YangH,ZhuangY,SunY,etal.Targeteddual-contrastT1-andT2-weightedmagneticresonanceimagingoftumorsusingmultifunctionalgadolinium-labeledsuperparamagneticironoxidenanoparticles[J].Biomaterial,2011,32(20):584-593.7 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分铁氰化锰钾纳米颗粒物化特性及生物特性材料与方法一、材料及仪器铁氰化锰钾纳米对比剂常州柯艾医药科技有限公司提供高分辨透射电子显微镜（TEM）苏州大学分析测试中心提供X射线单晶体衍射仪（XRD）苏州大学分析测试中心提供MesoMR21-060H-I核磁共振成像分析仪上海纽迈电子科技有限公司提供ICR小鼠上海西普尔-必凯实验动物有限公司二、方法1、高分辨率透射电子显微镜下观察铁氰化锰钾纳米粒子的基本表征通过高分辨率透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察已制备的铁氰化锰钾纳米粒子的大小、形态、表面特征及粒径分布。2、X射线衍射仪测定铁氰化锰钾纳米粒子的晶体结构X射线衍射（X-raydiffraction，XRD）分析是利用X射线在晶体物质中的衍射效应进行物质结构分析的技术。X射线衍射分析仪器主要由X射线发生器、测角仪、X射线强度测量系统以及衍射仪控制与衍射数据采集、处理系统四大部分组成。X射线对于晶体的衍射强度是由晶体晶胞中原子的元素种类、数目及其排列方式决定的。通过测定衍射角位置（峰位）可以进行化合物的定性分析，测定谱线的积分强度（峰强度）可以进行定量分析，测定谱线强度随角度的变化关系可进行晶粒的大小和形状的检测。3、铁氰化锰钾纳米粒子弛豫率R1、R2的测定通过磁共振分析仪测定铁氰化锰钾纳米颗粒的弛豫率R1、R2,设备参数设置为共振频率21MHz，磁体强度0.5T，线圈直径为60mm，磁体温度为32.0℃。分别将不同浓度的铁氰化锰钾纳米溶液（0.938mmol/L、1.875mmol/L、3.750mmol/L、7.500mmol/L、15.000mmol/L）置入核磁管密封进行扫描，测定弛豫率R1、R2。设原先样品的弛豫时间为T0，加入浓度为C的对比剂，现在的弛豫时间为T。弛豫时间T和T0、C之间的关系为：8 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分将浓度C作为X轴，1/T作为y轴，常数k值就是斜率，1/T0是截距。这样我们可以用已知浓度的对比剂和测量出的弛豫时间求出弛豫率拟合曲线。其中，斜率K叫做弛豫率。4、铁氰化锰钾纳米粒子的生物毒性实验将50只ICR小鼠（雄性）随机分成5组，每组10只，再将50只ICR小鼠（雌性）随机分成5组，每组10只，此外，另设一组对照组（ICR小鼠20只，雄雌各半）。每组小鼠通过尾静脉注射410.4mg/kg、482.22mg/kg、513mg/kg、567.38mg/kg、615.6mg/kg铁氰化锰钾纳米粒子，对照组注射生理盐水，观察给药后14天内小鼠的中毒及死亡情况，未死亡小鼠于第7、14天分别称重，第14天称重后处死，解剖，检查各主要脏器是否有异常改变。三、结果1、铁氰化锰钾纳米粒子的基本表征将铁氰化锰钾纳米粒子经缓冲液稀释后，放置6、12、24小时再观察，溶液呈浅黄色，均匀分布，容器底部未见明显纳米粒子沉降，无聚集、沉淀、挥发现象（图1）。将纳米粒子溶解于水中，而后将溶液滴入由碳膜包裹的铜网上，透射电子显微镜（TEM）下观察铁氰化锰钾纳米粒子呈正方体形，粒径大小较均一，分散性较好（图2、3），平均粒径约30nm。图19 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究图2图3TEM电子能谱图显示，铁氰化锰钾纳米粒子中Mn与Fe的原子比例为1:1（图4），因此，可以间接推测铁氰化锰钾纳米粒子的化学结构式为KMn[Fe(CN)6]。图410 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分图4图5图6图711 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究2、铁氰化锰钾纳米粒子的X射线粉末衍射分析由铁氰化锰钾纳米粒子的X射线粉末衍射图发现，粒子的衍射峰与KMn[Fe(CN)6]的标准衍射峰基本符合。铁氰化锰钾纳米粒子粉末XRD图表明其结构式为KMn[Fe(CN)6]，且纳米粒子含量较高（图5、6）。铁氰化锰钾纳米粒子的粒径分布较窄，峰值约90nm（图7），意味着铁氰化锰钾纳米粒子和包裹剂（聚乙烯吡咯烷酮K-14-16）的平均直径约90nm左右，纳米粒子直径约为30nm左右，说明铁氰化锰钾纳米粒子的粒径均匀性较好。3、铁氰化锰钾纳米粒子弛豫率R1、R2测定铁氰化锰钾纳米粒子弛豫率测定结果显示，纳米粒子浓度越大，T1、T2弛豫时间越短，反之浓度越小，T1、T2弛豫时间越长（表1）。这样可以通过已知浓度的对比剂和测量出的弛豫时间得到弛豫率拟合曲线。该纳米粒子的弛豫率R1为0.7599mM-1s-1，弛豫率R-1-12为1.2074mMs。弛豫率曲线图见图8。表1不同浓度的铁氰化锰钾纳米粒子T1、T2值浓度0.4690.9381.8753.7507.50015.000(mmol/L）T1（ms）1497.6541015.513613.796342.205166.28484.312T2（ms）1331.572769.186444.025241.688116.63354.54512 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分图84、铁氰化锰钾纳米粒子的生物毒性试验对照组及410.4mg/kg剂量组小鼠14天内未出现死亡现象。482.22mg/kg剂量组给药后7天出现死亡现象（雄性4只，雌性6只），513mg/kg剂量组给药后7天出现死亡现象（雄性4只，雌性8只），563.38mg/kg剂量组给药后7天出现死亡现象（雄性7只，雌性7只），615.6mg/kg剂量组给药后，小鼠立即死亡（雄性10只，雌性10只），各剂量组剩余小鼠均未出现死亡现象。实验结果表明，小鼠半数致死量为501.1mg/kg，小鼠最佳有效剂量为4.9mg/kg，小鼠半数致死量是小鼠最佳有效剂量的（501.1mg/kg／4.9mg/kg）102倍，铁氰化锰钾纳米对比剂的使用剂量有足够的安全范围,说明铁氰化锰钾纳米对比剂具有很好的生物相容性。13 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究讨论锰是人体必需的微量元素，其通过生物调节系统可以有效地保持人体内、外环境的稳定。Mn拥有特殊的物理化学特性，尤其是具有5个不成对外周电子及较长的电子弛豫时间[1-2]。近几年，Mn被认为是最有前途的T1增强对比剂，将来有可能取代具有诸多弊端的Gd螯合物类MR对比剂。Mn基对比剂种类较多，目前按化合物形态主要分为锰盐类、小分子螯合物类、大分子螯合物类、氧化物纳米粒子类[3-4]。锰是维持人体内外环境稳定的一种重要的金属，是精氨酸激酶、丙酮酸羧化酶的重要组成部分，也是部分激酶、转移酶、水解酶等的激活剂。由于它能够通过电压门控钙离子通道进入神经细胞，因而被广泛应用于MR成像研究以显示脑活动功能区。此外，Mn在血液中的半衰期较短，而在组织中的半衰期却较长。Mn在安全性方面相对于Gd而言有一定的优势，尤其是锰基纳米材料，毒性更低，更易排出体外[5]。本研究利用Mn的特殊物理化学特性，通过先进的制备工艺、全新的模版，成功研发一种新型、高效、高弛豫率的锰纳米材料-铁氰化锰钾。高分辨率透射电镜显示，铁氰化锰钾纳米粒子呈正方体，结合X射线粉末衍射分析，该纳米粒子粒径分布带较窄，均匀性较好。将其分散在缓冲液中6h、12h、24h小时后，容器底部均未见明显沉积物，说明该纳米粒子具有很好的水溶性，并且能够稳定存在。纳米粒子作为MR对比剂有诸多优点[6-8]，如其易于穿透生物屏障（血脑屏障等），分子高效结合，低毒性，最重要的是血液循环的时间较长和靶向性较好。最近，锰基氧化物纳米粒子作为MRI对比剂被应用于不同器官和不同部位的显影研究，特别是应用于肝脏、肾脏、膀胱及脑神经的研究。此外，PEG官能团有助于血脑屏障穿透，Na[9]等人开发聚乙二醇（PEG）-磷脂包裹二氧化锰纳米粒子应用于MRI大脑结构显像。铁氰化锰钾纳米对比剂的毒性试验是实验对比剂走向临床对比剂必须面临的挑战。本研究的纳米粒子通过长期毒性实验表明，小鼠半数致死量是小鼠最佳有效剂量的102倍，安全剂量使用范围很宽，对比剂的安全系数较高。目前，获准用于肝显像的Mn-DPDP，LD−150的剂量为540mmolkg，安全系数（LD50/有效剂量）高达540。临床上广泛使用的Gd-DTPA安全系数为60–100[10]。本研究铁氰化锰钾纳米对比剂的安全系数较Gd-DTPA明显增高。然而，高浓度的Mn会引起神经毒性，包括进展性14 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分神经退行性疾病，其表现类似于帕金森病。离子型锰对比剂如MnCl2，是FDA批准的对比剂。应用MnCl2标记细胞，已被用于研究正常脑组织与病变脑组织之间的结构、功能差异。但是Mn离子直接作为对比剂有两大缺点，第一、毒性较高；第二、锰离子血液循环时间太短，对于器官显像尤其是脑功能-神经显像弊端较大。此外，中枢神经系统长期暴露于过量锰元素时，机体将进入一种锰中毒状态。锰中毒的患者可出现类似帕金森疾病的临床表现，具有不可逆性脑功能障碍（纹状体损伤），出现头痛、肌肉痛、食欲减退、淡漠、肌张力障碍，运动减少，肢体僵硬和肌肉震颤[11-12]。众所周知，在人体内螯合的锰比锰离子更稳定、更安全。Mn-DPDP是另一种FDA批准应用于临床的肝脏特异性对比剂。由于DPDP结构与VitB6相似，因而可以通过PLP细胞膜转运系统进入肝细胞内，这是其成为肝脏特异性对比剂的重要机制。此外，有学者开展锰掺杂纳米粒子以增加稳定性、减少毒性的实验研究。国内外多位学者研究表明[13-14]，锰基对比剂掺杂纳米粒子如二氧化硅基质和有机金属基质后更不容易释放Mn离子，比锰螯合物更加安全。但是，此类对比剂粒子尺寸较大，不能通过肾滤过膜，在部分器官潴留时间较长。近年来，具有高敏感度和弛豫率的锰基纳米粒子多被设计与合成为磁共振成像T[15]1WI对比剂，如MnO、Mn3O4、Mn3O4@SiO2和MnO@mSiO2等。遗憾的是，锰基纳米对比剂纵向弛豫(通常R-1-11<0.5mMs）均大大低于目前临床使用的钆基对比剂(R-1s-11约3.4mM）。弛豫是指水质子弛豫速率的变化能力。最近研究表明，可以通过改善Mn基对比剂的顺磁中心结构提高其弛豫能力。上述诸多锰氧化物纳米颗粒，由于锰顺磁中心大多在纳米粒子中心，且对比剂的顺磁中心与水分子之间的相互作用减少，故弛豫能力较低。因此，提高锰顺磁中心与水分子的结合率成为提高锰基对比剂弛豫性的关键。本研究中，铁氰化锰钾纳米粒子弛豫率实验结果表明，该对比剂无论是T1还是T2弛豫率均较现有锰基对比剂高，显示铁氰化锰钾纳米颗粒作为MR对比剂的优越性。本研究中，铁氰化锰钾纳米颗粒表面的包裹材料为乙烯吡咯烷酮（PVP），是一种非离子型高分子化合物[16]，同时PVP是一种双亲非离子型表面活性剂，分子中含有疏水性的亚甲基碳链和亲水性的内酰基，可以多种方式吸附在纳米颗粒的表面，在控制颗粒形成、粒径大小及颗粒分布等方面发挥重要的作用，而纳米颗粒的分散性和粒径大小等特征又影响着纳米颗粒的磁性，因此，使用PVP表面活15 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究性剂在一定程度上可以提高铁氰化锰钾纳米对比剂的弛豫率。此外，PVP具有良好的生理惰性，不参与人体新陈代谢，又具有优良的溶解性和生物相容性，故安全性较高。铁氰化锰钾的化学式为KMn[Fe(CN)6]·2H2O，结构中无论是铁还是锰都被氰根连接不易解离，结构中含有结晶水和配位水，锰离子与水分子的氢离子相互作用，形成稳固的化合结构，化合物的配位水可在一定程度上提高弛豫率。KMn[Fe(CN)3-6]·2H2O是一种非常稳定的网状结构，其中[Fe(CN)6]稳定性很高，因此，不会有CN-的游离水解而产生毒性作用。正如包含[Fe(CN)6]3-的常见化合物普鲁士蓝（化学式：Fe4[Fe(CN)6]3·nH2O），在医学上常被用做铊中毒的解毒剂。KMn[Fe(CN)2+3-6]·2H2O有别于通常使用的Mn和[Fe(CN)6]的盐结构形式，具备作为对比剂的基本特性，具有磁共振成像增强作用。综上所述，铁氰化锰钾纳米粒子具有较高的T1、T2弛豫率，粒子稳定性及分散性良好，毒性极低，具备作为磁共振成像对比剂的基本特性，有望成为新型MR对比剂。16 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第一部分参考文献[1].GiladAA,WalczakP,McMahonMT,etal.MRtrackingoftransplantedcellswith“positivecontrast”usingmanganeseoxidenanoparticles[J].MagnResonMed,2008,60(1):1-7.[2].CostanzoM,ScolaroL,BerlierG,etal.Celluptakeandintracellularfateofphospholipidicmanganese-basednanoparticles[J].IntJPhar,2016,508(1-2):83-91.[3].KimSM,ImGH,LeeDG,etal.Mn(2+)-dopedsilicananoparticlesforhepatocyte-targeteddetectionoflivercancerinT1-weightedMRI[J].Biomaterials,2013,34(35):8941-8948.[4].ChenW,LuF,ChenCC,etal.Manganese-enhancedMRIofratbrainbasedonslowcerebraldeliveryofmanganese(II)withsilica-encapsulatedMnxFe(1-x)Onanoparticles[J].NmrinBiomedicine,2013,26(9):1176-1185.[5].XingR,ZhangF,XieJ,etal.PolyasparticacidcoatedmanganeseoxidenanoparticlesforefficientliverMRI[J].Nanoscale,2011,3(12):4943-4945.[6].林炳权.长循环SPIO-PBCA-PEG纳米微粒的合成及其在大鼠肝脏肿瘤MR成像中的研究[D].南方医科大学,2010.[7].ZhuD,LiuF,MaL,etal.Nanoparticle-BasedSystemsforT1-WeightedMagneticResonanceImagingContrastAgents[J].IntJMolSci,2013,14(5):10591-10607.[8].ZhenZ,XieJ.Developmentofmanganese-basednanoparticlesascontrastprobesformagneticresonanceimaging[J].Theranostics,2012,2(1):45-54.[9].NaHB,LeeJH,AnK,etal.DevelopmentofaT1contrastagentformagneticresonanceimagingusingMnOnanoparticles[J].AngewChemIntEdEngl,2007,46(28):5397-5401.[10].ElizondoG,FretzCJ,StarkDD,etal.PreclinicalevaluationofMnDPDP:newparamagnetichepatobiliarycontrastagentforMRimaging[J].Radiology,1991,178(1):73-78.[11].MátéZ,HorváthE,KozmaG,etal.Size-DependentToxicityDifferencesofIntratracheallyInstilledManganeseOxideNanoparticles:ConclusionsofaSubacuteAnimalExperiment[J].BiologicalTraceElementResearch,2016,171(1):156-166.[12].SinghSP,KumariM,KumariSI,etal.ToxicityassessmentofmanganeseoxidemicroandnanoparticlesinWistarratsafter28daysofrepeatedoralexposure[J].J17 第一部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究ApplToxicol,2013,33:1165-1179.[13].KimJH,HaTL,ImGH,etal.Magneticresonanceimagingofamyloidplaquesusinghollowmanganeseoxidenanoparticlesconjugatedwithantibodyaβ1-40inatransgenicmousemodel[J].Neuroreport,2013,24(1):16-21.[14].ShinJ,AnisurRM,KoMK,etal.Hollowmanganeseoxidenanoparticlesasmultifunctionalagentsformagneticresonanceimaginganddrugdelivery[J].AngewChemIntEdEngl,2009,121(2):327-330.[15].ZhenZ,XieJ.Developmentofmanganese-basednanoparticlesascontrastprobesformagneticresonanceimaging[J].Theranostics,2012,2(1):45-54.[16].杜雪岩,刘广菊,杨洪奎,等.PVP对FePt纳米颗粒磁性能的影响.稀有金属材料与工程[J],2013,5(42):1009-1012.18 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠不同器官T2WI增强效果分析材料与方法一、材料1.实验动物健康、雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（清洁级），体重260～310g，鼠龄均为7周龄，常州卡文斯实验动物中心提供。饲养于25℃～28℃实验动物房，保持温度、相对湿度的恒定，12小时昼夜节律，每日以全价营养颗粒饲料喂养，自由进食、进水。定期消毒饲养室及笼具。动物实验符合医学实验动物相关法规及标准。2.实验试剂及仪器铁氰化锰钾纳米对比剂常州柯艾医药科技有限公司提供2ml、5ml一次性注射器常州卡文斯实验动物中心提供无菌生理盐水，4%水合氯醛苏州大学附属第二医院实验中心提供1.5T超导磁共振成像仪荷兰Philips公司Microscopy4.7cm显微线圈荷兰Philips公司图像处理工作站DELL公司Osirix软件PixmeoSARL公司其他器械：自制大鼠扫描固定架，电子天平等二、方法1.MR成像方法取雄性、同龄SD大鼠16只，随机分成两组，实验组和对照组，每组8只。所有实验组大鼠采用4%的水合氯醛（剂量为1ml/100g体重）进行腹腔注射麻醉，待10～15min大鼠深度麻醉后（角膜反射减弱、肌张力减弱）使其俯卧位固定于自制扫描架上，身体长轴与MR扫描仪器频率编码方向垂直。扫描部位置于Microscopy4.7cm显微线圈中心，腹部加压包扎以控制呼吸运动伪影，调整大鼠位置保证大鼠肝脏位于磁体中心位置（体表标志点为剑突）。MR成像设备为荷兰Philips公司的多通道全身扫描仪，场强为1.5T。所有大鼠均行三平面定位扫描，首先进行大鼠不同部位19 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究（心肌、肝脏、肾脏）的TSE-T1WI、TSE-T2WI-SPAIR序列平扫。具体扫描参数为TSE-T1WI（TR100ms，TE7.6ms），TSE-T2WI-SPAIR（TR2500ms，TE110ms）层厚2mm，层间距0.2mm，FOV80mm×80mm，矩阵256×196，激励次数4次。然后，实验组每只SD大鼠经尾静脉注射对比剂，剂量体重比为1ml/300g，对比剂浓度为45mmol／L，分别于注射后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h行MR增强扫描，扫描序列和参数同平扫。对照组每只SD大鼠经尾静脉注射同剂量的生理盐水后行MR扫描。2.MR图像分析使用Osirix（医学专用版）软件，在轴位TSE-T2WI-SPAIR序列图像上分别测量每只大鼠心肌、肝脏、肾脏增强前、后的信号强度（signalintensity，SI）及背景噪声信号强度的标准差（Standarddeviationofthenoise，SD）。ROI选择及测量：①ROI设定为圆形，面积为5mm2;②对于同一个体增强前后扫描图像的测量，ROI尽可能选在同一层面的相同部位；③器官SI测量选择信号强度相对均匀、无大血管和伪影的区域，避免器官边缘；背景噪声SI测量选择与相位编码方向一致的腹前壁外的背景区域（包括呼吸运动伪影）；④心肌测量部位选择较厚的左心室壁；⑤肾脏测量部位分别选择肾皮质和肾髓质区域。⑥各ROI测量5次，取其平均值作为测量值。计算各器官信噪比（signaltonoiseratio，SNR）及信号增强率（signalenhancementratio，SER）。计算公式如下：SNR=SI器官/SDSER=（SNR增强前－SNR增强后）/SNR增强前×100％SNR增强前、SNR增强后分别代表平扫时器官的SNR和增强后各时间点器官的SNR。绘制各器官信号强度-时间、信噪比-时间、信号增强率-时间动态变化曲线。3.统计学分析采用SPSS22.0统计软件包，各器官SI、SNR及SER以平均值±标准差(xs)表示。注射对比剂后不同器官各时间点的SI、SNR分别与平扫比较。如果数据呈正态分布，方差齐，采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用最小显著差法（LSD）；方差不齐时选用Dunnett’sT3检验进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01认为差异具有高度统计学意义。20 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分结果1、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠心肌T2增强程度分析实验组大鼠经尾静脉注入铁氰化锰钾纳米对比剂增强前、增强后各时间点大鼠心肌T2WI的SI、SNR及SER值见表1。正常大鼠心肌T2WI平扫SI为253.21±33.17，SNR为10.09±1.60，注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min，心肌组织开始出现负性强化，SI为152.19±15.46，SNR为6.22±1.88，注射对比剂后2h心肌强化程度达到最大，SI为116.32±9.74，SNR为4.96±0.98。注射对比剂5min至10h各时间点的心肌SI与平扫相比，P<0.05，差异具有统计学意义。注射对比剂2h心肌负性强化达到峰值，6h-10h时间段心肌负性强化程度明显降低。5min-6h各时间点心肌SNR与平扫比较差异具有统计学意义（P＜0.05），10h时间点心肌SNR与平扫比较差异无统计学意义（P＞0.05）。5min-4.5h各时间点心肌SER与6h比较，P＜0.05，差异均具有统计学意义。5min-6h各时间点心肌SER与10h心肌SER比较，P＜0.05，差异均具有统计学意义。增强前及增强后各时间点大鼠心肌T2WI图像见图1，心肌SI-时间、SNR-时间、SER-时间曲线见图2、图3、图4。表1注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠心肌SI、SNR、SER（xs）比较时间点SIt1P1SNRt2P2SER平扫253.21±33.1710.09±1.605min152.19±15.468.730.006.22±1.884.960.000.37±0.2330min153.96±11.668.930.005.90±0.597.770.000.40±0.101h146.61±10.199.710.005.90±1.066.900.000.39±0.172h116.32±9.7412.520.004.96±0.988.640.000.49±0.123h111.23±6.6113.270.005.47±0.897.970.000.44±0.174.5h124.17±11.4811.620.005.59±1.017.520.000.43±0.136h147.48±13.279.360.008.09±1.880.780.0190.21±0.1710h200.19±28.823.820.0019.79±1.650.720.690.16±0.14注:P1、P2分别为心肌各时间点SI、SNR与平扫比较的P值。21 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究abcdefghi图1心肌平扫及注射对比剂后各时间点T2WI图像（图a~i分别为平扫及注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h图像）22 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分图2心肌SI-时间柱状图图3心肌SNR-时间曲线23 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究图4心肌SER-时间曲线2、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肾脏（皮质、髓质）T2增强程度分析实验组大鼠经尾静脉注入铁氰化锰钾纳米对比剂增强前、后各时间点大鼠肾脏（皮质、髓质）T2WI-SPAIR的SI、SNR及SER见表2、表3。正常大鼠肾脏皮质T2WI平扫SI为757.46±144.47，SNR为35.42±4.62，肾脏髓质T2WI平扫SI为876.48±71.93，SNR为43.15±5.24。注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min，肾脏开始出现负性强化，此时肾脏皮质SI为560.26±100.74，SNR为23.54±10.77，肾脏髓质SI为622.45±156.38，SNR为27.16±5.93，注射对比剂后2h肾脏皮质负性强化达到峰值，SI为363.36±145.11，SNR为15.71±6.13，肾脏髓质亦于注射对比剂后2h负性强化达到峰值，SI为484.84±238.80，SNR为16.75±3.54，但肾脏髓质的强化平台期较皮质长，髓质强化平台期为2h至10h。5min至10h各增强时间点的肾脏皮质SI、SNR与平扫比较，P<0.05，差异具有统计学意义。5min至10h各增强时间点的肾脏髓质SI、SNR与平扫比较，P<0.05，差异具有统计学意义。2h肾脏皮质SER分别与5min、30min、1h、3h、4.5h、6h、10h肾脏皮质SER比较，P<0.05，差异具有统计学意义。2h肾脏髓质SER分别与3h、4.5h、6h、10h肾脏皮质SER比较，P<0.05，差异具有统计学意义。4.5h肾脏髓质SER与6h肾脏髓质SER比较，6h肾脏髓质SER24 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分与10h肾脏髓质SER比较，P>0.05，差异均无统计学意义。大鼠肾脏增强前及增强后各时间点T2WI图像见图5，肾脏皮质SI-时间曲线、SNR-时间曲线、SER-时间曲线见图6、图7、图8，肾脏髓质SI-时间曲线、SNR-时间曲线、SER-时间曲线见图9、图10、图11。表2注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肾脏皮质SI、SNR、SER（xs）比较时间点SIt1P1SNRt2P2SER平扫757.46±144.4735.42±4.625min560.26±100.743.530.00129.54±10.774.80.000.25±0.1830min506.60±98.874.420.0018.42±3.486.970.000.30±0.231h531.50±106.543.940.0017.40±2.926.250.000.28±0.082h363.36±145.116.430.0015.71±6.136.810.000.50±0.093h413.86±170.665.720.0015.85±3.996.860.000.42±0.154.5h529.67±157.214.540.0018.37±5.174.710.000.34±0.216h443.49±58.465.050.0016.78±7.436.470.000.36±0.1610h512.34±44.514.100.0016.66±5.266.520.000.29±0.17注:P1、P2分别为肾脏皮质各时间点SI、SNR与平扫比较的P值。表3注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肾脏髓质SI、SNR、SER（xs）比较时间点SIt1P1SNRt2P2SER平扫876.48±71.930.0043.15±5.240.005min622.45±156.384.720.0023.16±5.935.970.000.44±0.1630min512.84±165.745.550.0018.58±7.678.910.000.57±0.081h560.46±131.095.040.0018.15±6.309.120.000.58±0.082h484.84±238.805.910.0016.75±3.549.510.000.61±0.173h520.22±56.745.340.0020.68±4.818.570.000.58±0.154.5h464.24±56.745.960.0022.81±4.507.650.000.57±0.046h546.62±96.255.240.0021.50±5.958.050.000.56±0.1910h692.64±114.004.570.0026.21±5.025.210.000.56±0.16注:P1、P2分别为肾脏髓质各时间点SI、SNR与平扫比较的P值。25 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究abcdefghi图5肾脏平扫及注射对比剂后各时间点T2WI增强图像（图a-i分别为平扫及注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h图像）26 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分图6肾脏皮质SI-时间柱状图图7肾脏髓质SI-时间柱状图27 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究图8肾脏皮质SNR-时间曲线图9肾脏皮质SER-时间曲线28 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分图10肾脏髓质SNR-时间曲线图11肾脏髓质SER-时间曲线29 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究3、注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肝脏T2增强程度分析实验组大鼠经尾静脉注入铁氰化锰钾纳米对比剂增强前、增强后各时间点肝脏T2WI-SPAIR的SI、SNR及SER见表4。正常大鼠肝脏T2WI平扫SI为305.70±75.81，SNR为14.25±7.70，注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min，肝脏组织开始出现明显负性强化，肝脏SI为104.54±23.84，SNR为4.91±1.96，注射对比剂后1h肝脏负性强化达到峰值，SI为85.46±17.84，SNR为3.30±0.71，至注射对比剂后3h肝脏负性强化程度仍很高，5min-3h为增强平台期，3h至10h肝脏信号强度呈逐渐恢复趋势。注射对比剂后5min至10h各时间点肝脏SI与平扫相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。注射对比剂后5min-10h各时间点肝脏SNR与平扫SNR比较，P<0.05，差异均具有统计学意义。5min-6h各时间点肝脏SER与10hSER比较，30min-3h各时间点肝脏SER与4.5hSER比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。增强前及增强后各时间点大鼠肝脏T2WI图像见图12，肝脏SI-时间曲线、肝脏SNR-时间曲线、肝脏SER-时间曲线见图13、图14、图15。表4注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点大鼠肝脏SI、SNR、SER（xs）比较时间点SIt1P1SNRt2P2SER平扫305.70±75.8114.25±7.705min104.54±23.8412.490.004.91±1.965.990.000.64±0.1930min93.70±14.9913.180.003.76±0.926.720.000.71±0.121h85.46±17.8413.700.003.30±0.717.010.000.75±0.152h104.22±16.0212.510.004.37±1.546.330.000.67±0.163h116.45±23.4311.730.004.69±2.516.130.000.69±0.224.5h126.51±14.0811.090.006.25±2.215.130.000.56±0.226h139.91±27.3610.230.005.34±1.955.710.000.60±0.2010h156.95±28.579.150.007.04±2.504.620.000.51±0.25注:P1、P2分别为肝脏各时间点SI、SNR与平扫比较的P值。30 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分cacbdefghgggghi图12肝脏平扫及注射铁氰化锰钾纳米对比剂后各时间点T2WI图像（图a-i分别为平扫及注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min、30min、1h、2h、3h、4.5h、6h、10h图像）图13肝脏SI-时间柱状图31 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究图14肝脏SNR-时间曲线图图15肝脏SER-时间曲线图15肝脏SER-时间曲线图32 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分讨论锰是一种过渡金属元素，外周电子排布为3d54s2，最外一层轨道具有5个不成对电子，自旋系数高，具有较强的顺磁性，弛豫效能比较高，可以明显减少周围水质子的横向、纵向弛豫时间，是继钆对比剂后的磁共振对比剂研究热点[1-3]。Mn2+作为MRI对比剂的应用价值不仅仅在于增强MR图像的对比度，而且对研究机体器官的生物学功能、神经和细胞的可视化结构具有重要意义。锰是机体生长、发育所需要的重要微量元素，作为生物物质的组成部分和一些酶类的活性基团，参与多种生理反应[4-5]。在人体内参与骨质形成、脂肪和糖类新陈代谢、血糖调节和钙吸收等多种生理活动。人体内锰的总量约为12-20mg，主要分布在胰腺、肝脏、大脑。锰对比剂中的锰被机体摄取后，有可能被整合到机体内源Mn贮存库内（肝脏为主）[20]，外源性Mn引入机体后在各器官中的分布不同。Ni[6]等人通过给大鼠静脉注射MnCl2后，观察Mn在大鼠体内各器官的分布，他们采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）分别测定了Mn在脑、肝、胰、脾、肾、肾上腺和唾液腺中的浓度，结果显示，在10分钟内，胰腺内Mn浓度最高，其次是肾脏、肝脏、肾上腺、心脏、唾液腺、脾脏和脑。具有分泌功能的腺器官（如胰腺、肝、肾上腺等）Mn的含量明显高于无分泌性的器官。目前，多数锰类对比剂进入人体后容易解离成锰离子，对人体产生较大副作用。锰类对比剂的毒性问题一直是研究者面临的巨大挑战。心肌细胞L型钙通道和线粒体是锰毒性的作用靶点，锰离子可以引起L型钙通道蛋白分子水平的变化，在阻断L型钙通道的同时又导致细胞内钙的释放，造成细胞钙超载。锰离子还可以导致细胞内抗氧化物质谷胱甘肽含量的减少，致使过氧化氢的过量积累，对线粒体膜造成伤害，引起线粒体膜电位的下降。线粒体脱氢酶的活性降低是锰作用下心肌细胞活性下降的主要原因，并可导致细胞的凋亡，上述锰对心肌细胞的作用机制为锰对心肌毒性的病理基础。本研究中采用的铁氰化锰钾纳米对比剂化学结构中的锰被氰根连接不易解离，基本避免了该对比剂的锰毒性作用。锰离子（Mn2+）可通过电压门控钙通道进入存活的心肌细胞，产生T1缩短效应，并且Mn2+具有相对较长的半衰期，故应用Mn2+对比剂可对心肌灌注和心肌细胞的存活状态进行评估。研究表明，应用Mn2+对比剂不仅可以对心肌梗死区域大小进行量33 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究化，同时可以评估体内Ca2+稳态[7-9]。但是，目前国内外有关锰基对比剂应用于心脏等领域研究较少，未来有望进一步拓展心脏功能磁共振成像领域[10]。本研究发现，大鼠心肌、肝脏、肾脏的T2WI信号在注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min，即开始明显降低，具有明显负性增强效果。其中肝脏的SER和SNR在注射后1h达到高峰，心肌与肾脏（肾皮质、肾髓质）也都于2h信号强度达到峰值。但是肝脏强化峰值均明显高于心肌和肾脏强化峰值，而且强化峰值出现时间均比心肌和肾脏早。国内外文献报道[11-12]，人体注射锰对比剂后，锰的摄入量以肝脏最为突出，且以肝脏的弛豫率升高最为明显。目前，经由FDA批准而应用于临床的锰基对比剂主要有Mn-DPDP和MnCl[11,13-14]2，Mn-DPDP（锰福地匹三纳）是肝脏特异性对比剂，是由Mn2+和两个磷酸吡多醛螯合而成。由于磷酸毗哆醛的分子结构与维生素B6类似，故DPDP能通过维生素B6通道进入肝细胞内。经静脉注射后的Mn-DPDP在血流中通过Zn2+进行金属转移并释放自由Mn2+，使Mn2+逐渐与DPDP分离，Mn2+与血浆蛋白结合，并主要通过肝细胞吸收，最终通过肾脏排泄。Mn-DPDP本身的弛豫效能并不高，进入肝细胞内的Mn-DPDP通过与特定蛋白结合进行代谢，使其成为特殊构型，可明显降低局部肝细胞的弛豫时间，实现肝脏特异性显像。Vogl[15]等人对8例肝细胞源性疾病患者进行Mn-DPDP增强磁共振检查，其中病理诊断为肝细胞癌5例，肝硬化2例，局灶性结节性增生1例，研究发现增强图像上肝脏所有病灶T1WI呈现明显高信号，肝脏正常组织信噪比亦明显增加。本研究重点关注铁氰化锰钾纳米对比剂的负性增强效应，结果表明，大鼠经尾静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂后肝脏组织T2WI信号强度最大降低幅度约75%，为肝脏某些病变与正常肝脏组织的信号对比奠定了基础，但T2WI负性增强效应对肝脏病变的鉴别诊断价值有待于进一步研究。Murakami[16]等人报道Mn-DPDP可以用于诊断肝硬化，通过分组对照研究发现，非肝硬化组肝脏强化明显比肝硬化组肝脏强化明显，结合病理结果，肝硬化组织中的纤维化及铁沉积区域信号减弱较明显，而良性再生结节区信号明显增强。有研究表明[17-19]，肝硬化时大量纤维结缔组织增生，胶原纤维沉积于肝窦血管壁的内外即形成肝窦的毛细血管化，使氧弥散距离增加，导致肝细胞和线粒体缺氧。肝脏的网状内皮系统吞噬功能与总胆红素、血氨呈负相关，与白蛋白、凝血酶呈正相关。铁氰化锰钾的摄取途径主要是通过网状内皮系统，肝硬化患者的网状内皮系统清除能力下降，因此，34 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂有望应用于肝硬化的诊断，以及对肝硬化Child-Pugh分级评分进行评估。本研究中，注射铁氰化锰钾纳米对比剂后5min，大鼠肝脏T2WI信号即明显减低，注射后1h肝脏的SNR及SER均达到高峰，维持较高程度强化直至3h时间点，肝脏强化平台期较长，3h后肝脏强化程度逐渐减弱。本研究所采用的铁氰化锰钾纳米对比剂在肝脏中的强化特征与Mn-DPDP颇相似，Mn-DPDP对比剂经静脉注射1min后，肝实质开始强化，10～30min达到强化高峰，并持续2h～4h，24h后对比剂完全排出，强化程度恢复至基线水平。但两者成像机理不同，Mn-DPDP成像基础是对比剂可以通过肝细胞膜通道，被肝细胞摄取，而铁氰化锰钾纳米粒子（含包裹剂）由于粒子直径较大，经静脉注射后特异性地被肝脏网状内皮系统-枯否氏细胞摄取。本研究发现，肝脏强化峰值SER高达0.75±0.15，而心肌强化峰值SER仅仅为0.49±0.12，肾脏皮质、髓质强化峰值SER分别为0.50±0.09、0.61±0.17，肝脏强化程度明显高于心肌和肾脏，表明铁氰化锰钾纳米粒子在一定程度上对肝脏负性增强具有特异性。本研究发现，铁氰化锰钾纳米对比剂经静脉注入后，大鼠肾脏皮质于2h达到强化峰值，SNR、SER分别为15.71±6.13、0.50±0.09。肾脏髓质的SNR、SER亦在2h达到峰值，分别为16.75±3.54,0.61±0.17。由于肾脏皮质、髓质的生理结构不同，皮质强化程度较髓质稍低，且髓质强化持续时间明显较皮质长。有研究认为，肾脏不是锰排泄的主要器官，所以对比剂注射后10h的SI仍较低。本研究中肾脏的延迟强化时间最长。铁氰化锰钾纳米对比剂在体内具有较长的血液循环时间及缓释性，肝脏成像时间窗约6小时左右，而临床常用的Gd-DTPA仅为1个小时左右。较长的成像时间窗一方面可以在有效的时间内进行更丰富的成像，如更多参数、薄层扫描、定义扫描、多序列扫描等，另一方面在增强初次扫描失败后可以进行重复扫描，如循环时间变异、动脉期扫描太早、呼吸运动伪影严重、患者配合欠佳等。此外，Mn2+与Ca2+具有相似的离子半径，生理特性与Ca2+十分类似，有学者通过模拟Mn2+示踪脑部的神经活动，锰可作为对比剂应用于中枢神经系统脑神经活动的MR成像研究[21-22]。锰增强磁共振成像（MEMRI）对比技术已被开发应用于评估组织活力、细胞钙内流和神经元连接示踪等。也逐步应用于可视化的大脑和心脏活动35 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究以及细胞结构及功能研究，有望成为一种功能成像、分子成像的新的成像方法。铁氰化锰钾纳米粒子在神经领域的成像应用有待以后进一步研究。铁氰化锰钾纳米颗粒可作为一种新型磁共振锰基纳米对比剂，它不同于目前常用的钆类对比剂和其它锰基对比剂。根据李冬飞[23]研究的结果，铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏具有明显的T1增强效果，且对肝脏增强具有一定的特异性。本研究发现，铁氰化锰钾纳米对比剂不仅在T1成像方面具有良好的增强效果及肝脏特异性，在T2成像方面亦有较好的增强效果及肝脏特异性，表现出T1-T2双模态对比增强效能，可作为T1-T2双模态对比剂进行深入研究，具有广阔的开发应用前景。本研究尚存在以下不足之处：①本研究将大鼠多个器官（心肌、肝脏、肾脏）通过一次性扫描成像，不同器官MR扫描参数的个性化设计有待进一步调整完善；②本研究受磁共振扫描时间的限制，注射对比剂后扫描时间点的设计尚不够密集，对客观反映对比剂强化特征可能有一定的影响；③铁氰化锰钾纳米对比剂的负性增强作用致肝脏T2WI序列信号很低，影响肝脏结构的细节观察。36 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第二部分参考文献[1]FitsanakisVA,ZhangN,GarciaS,etal.Manganese(Mn)andiron(Fe):Interdependencytransportandregulation[J].NeurotoxRes,2010,18(2):124-131.[2]LiuR,JingL,PengD,etal.Manganese(II)ChelateFunctionalizedCopperSulfideNanoparticlesforEfficientMagneticResonance/PhotoacousticDual-ModalImagingGuidedPhotothermalTherapy[J].Theranostics,2015,5(10):1144-1153.[3]FreitagMT,MártonG,PajerK,etal.MonitoringofShort-TermErythropoietinTherapyinRatswithAcuteSpinalCordInjuryUsingManganese-EnhancedMagneticResonanceImaging[J].Neuroimaging,2014,25(4):582-589.[4]PfalzerAC,BowmanAB.RelationshipsBetweenEssentialManganeseBiologyandManganeseToxicityinNeurologicalDisease[J].CurrEnvironHealthRep,2017，1-6.[5]GálosiR,SzalayC,AradiM,etal.Identifyingnon-toxicdosesofmanganeseformanganese-enhancedmagneticresonanceimagingtomapbrainareasactivatedbyoperantbehaviorintrainedrats[J].MagnResonImaging,2017,37:122-133.[6]NiY,PetreC,BosmansH,etal.ComparisonofmanganesebiodistributionandMRcontrastenhancementinratsafterintravenousinjectionofMnDPDPandMnCl2[J].ActaRadiologica,1997,38(2):700-707.[7]杨惠娟.锰对心肌细胞钙稳态、活性氧以及细胞凋亡的作用机制研究[D].浙江大学,2007.[8]AtkinsHL,SomP,FairchildRG,etal.Myocardialpositrontomographywithmanganese-52m.Radiology,1979,133(3Pt1):769-774.[9]HarrisSR,GlocknerJ,MisseltAJ,etal.CardiacMRImagingofNonischemicCardiomyopathies[J].MagnResonImagingClinNAm,2008,16(2):165-183.[10]JiangK,LiW,LiW,etal.RapidmultisliceT1mappingofmousemyocardium:Applicationtoquantificationofmanganeseuptakeinα-Dystrobrevinknockoutmice.MagnResonMed,2015,74(5):1370-1379.[11]BurkeC,GrantLA,GohV,etal.Theroleofhepatocyte-specificcontrastagentsinhepatobiliarymagneticresonanceimaging[J].SeminUltrasoundCTMR,2013,34(1):44-53.[12]SutoY,WeinrebJC,RofskiNM.Asegmentalhyperintensityareainthelivershown37 第二部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究bydelayedMRimageswithMn-DPDP[J].JComputAssistTomogr,1996,20(4):647-649.[13]RockallAG,PlancheK,PowerN,etal.DetectionofneuroendocrinelivermetastaseswithMnDPDP-enhancedMRI[J].Neuroendocrinology,2009,89(3):288-295.[14]WangDB,ZhouKR,ZengMS,etal.Mn-DPDP-enhanced24-hdelayed-scanMRIofhepatocellularcarcinomaiscorrelatedwithhistology[J].EurRadiol,2004,14(4):743-745.[15]VoglTJ,HammB,SchnellB,etal.Mn-DPDPenhancementpatternsofhepatocellularlesionsonMRimages[J].JMagnResonImaging,1993,3(1):51-58.[16]MurakamiT,BaronRL,FederleMP,etal.Cirrhosisoftheliver:MRimagingwithmangafodipirtrisodium(Mn-DPDP)[J].Radiology,1996,198(2):567-572.[17]赵云辉,许乙凯,高新疆.大鼠肝硬化肝癌SPIO增强MRI表现与Kupffer细胞的关系[J].放射学实践,2009,24(11):1182-1186.[18]ZhangM,WangFL,ZhuJY,etal.Livermyofibroblastsregulatethephenotypeandfunctionofmonocytesthroughsolublefactorsincirrhosis[J].ExpTherMed,2013,5(1):143-149.[19]Oliveira-JuniorMC,MonteiroAS,Leal-JuniorEC,etal.Low-levellasertherapyamelioratesCCl4-inducedlivercirrhosisinrats[J].PhotochemPhotobiol,2012,89(1):173-178.[20]龚明福,杨华.锰对比剂磁共振成像研究进展[J].中国医学影像技术,2013,29(1):142-145.[21]BockNA,PaivaFF.Fractionatedmanganese-enhancedMRI.NMRBiomed,2008,21(5):473-478.[22]AokiI,EbisuT,NaruseS,etal.Detectionoftheanoxicdepolarizationoffocalischemiausingmanganese-enhancedMRI.MagnResonMed,2003,50(1):7-12.[23].李冬飞.铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠不同器官增强特性的MRI实验研究[D].苏州大学,2016.38 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏增强的病理基础分析一、材料1.实验动物健康、雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（清洁级），体重260～310g，鼠龄均为7周龄，常州卡文斯实验动物中心提供。饲养于25℃～28℃实验动物房，保持温度、相对湿度的恒定，12小时昼夜节律，每日以全价营养颗粒饲料喂养，自由进食、进水。定期消毒饲养室及笼具。动物实验符合医学实验动物相关法规及标准。2.实验试剂及仪器2.1仪器高分辨率透射电镜TecnaiG2spiritBioTwin(美国FEI公司)光学显微镜莱卡DMI3000石蜡连续切片机德国Microm(HM340E)公司电镜超薄切片机莱卡（UC6型）2ml、5ml一次性注射器常州卡文斯实验动物中心提供40C摄氏度冰箱海尔公司电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司BMJ-Ⅲ型包埋机常州中威电子仪器厂EP管苏州大学附属第二医院动物实验中心2.2试剂铁氰化锰钾纳米对比剂常州柯艾医药科技有限公司提供PBS缓冲液苏州大学附属第二医院动物实验中心4%水合氯醛苏州大学附属第二医院动物实验中心10%缓冲中性甲醛苏州大学附属第二医院动物实验中心亚铁氰化钾苏州大学基础医学部病理教研制片室苏木色精中国国药（集团）上海化学试剂公司伊红Solarbio生化试剂供应商盐酸溶液苏州大学基础医学部病理教研制片核固红溶液苏州大学基础医学部病理教研制片39 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究乙醇国药集团化学试剂有限公司4%戊二醛国药集团化学试剂有限公司30%、50%、80%、90%、100%丙酮苏州大学透射电镜制样室环氧树脂618型北京中镜科仪技术有限公司切片石蜡国药集团化学试剂有限公司锇酸苏州大学国资处采购办二、方法1.大鼠分组实验及肝脏取材22只雄性SD大鼠，随机分成两组，一组为实验组，一组为对照组，每组11只。实验组大鼠采用4%的水合氯醛（剂量为1ml/100g体重）进行腹腔注射麻醉，待10分钟大鼠深度麻醉后（角膜反射减弱，肌张力减弱）经尾静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂，剂量为1ml/300g体重，注射后分别于每个时间点（5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h）抽取1只大鼠进行肝脏取材，按常规光镜和电镜检查要求留取标本并固定。对照组随机抽取1只大鼠，采用4%的水合氯醛行腹腔注射麻醉后经尾静脉注射等量生理盐水，肝脏取材同实验组大鼠。2.大鼠肝脏病理组织学检查2.1大鼠肝脏光学显微镜病理组织学检查2.1.1HE染色大鼠肝脏组织取材后固定于10%缓冲中性甲醛溶液，常规脱水、石蜡包埋及染色，具体步骤如下:1)二甲苯I,二甲苯II中洗浴3-5分钟以脱蜡，然后分别在梯度酒精中洗浴3-5分钟至蒸馏水;2)苏木精染色5-10分钟;3)自来水洗1分钟;4)1%盐酸乙醇分化数秒;5)蒸馏水洗1分钟;6)0.2%氨水返蓝30秒左右;7)蒸馏水洗1分钟;8)伊红染色3-5分钟;40 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分9)自来水洗;10)梯度乙醇和二甲苯脱水透明;11)中性树胶封固。2.1.2普鲁士蓝染色大鼠肝脏组织取材后固定于10%缓冲中性甲醛溶液，常规脱水、石蜡包埋及染色，具体步骤如下:1)切片厚度4微米，常规脱蜡至水洗，蒸馏水再洗一次，时间1分钟以内；2)取FeCl3溶液和盐酸溶液等份混合，滴入切片，作用20-30分钟；3)蒸馏水充分冲洗2-5分钟；4)核固红染液复染胞核5-10分钟，蒸馏水洗1-5秒；5)95%酒精、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。注意事项：①组织固定采用10%的中性甲醛溶液，经普通福尔马林长期固定后，组织会有损伤；②整个操作过程中容器要清洁，避免使用金属铁制品，以蒸馏水冲洗切片和容器，避免普通水中的铁质对标本的影响；③PerlsStain染色时，应根据样本具体情况调整着色时间。2.2大鼠肝脏透射电子显微镜病理组织学检查1)将大鼠麻醉处死，在1分钟内完成肝脏取材，将1mm3大小的肝脏标本迅速浸入冷的戊二醛固定液中进行固定（4小时以上）；2)PBS缓冲液冲洗2次，每次15分钟；3)锇酸固定1小时；4)PBS缓冲液冲洗2次，每次15分钟；5)30%丙酮脱水15分钟，50%丙酮脱水15分钟，70%丙酮饱和醋酸铀过夜；5.80%丙酮脱水15分钟，90%丙酮脱水15分钟，100%丙酮脱水3次，每次10分钟；6)包埋剂（环氧树脂618型）与100%丙酮1:1混合1小时，包埋浸透肝脏组织2小时以上；7)组织样品放入烘箱聚合；8)样品切片，置于100目碳镀膜的铜网上。2.3病理结果分析2.3.1光镜检查结果分析（HE染色、普鲁士蓝染色）41 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究采用光学显微镜对HE染色和普鲁士蓝染色切片进行观察，重点观察注射铁氰化锰钾纳米对比剂后各不同时间点（5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h）纳米粒子在肝脏内的数量及分布规律，分析铁氰化锰钾纳米颗粒在肝脏中的数量及分布规律与肝脏T2WI图像信号变化的相关性。普鲁士蓝染色原理：盐酸使三价铁离子分解出来，三价铁离子与亚铁氰化钾反应，生成亚铁氰化高铁，即普鲁士蓝。本研究肝组织普鲁士蓝染色与常规染色方法略有不同，铁氰化锰钾首先分解为铁氰根、锰离子、钾离子，通过FeCl3染液中的三价铁离子与铁氰根结合形成稳定化合物普鲁士蓝。即亚铁氰化钾与三价铁离子作用，生成一种不溶解的蓝色化合物即三价铁的亚铁氰化物普鲁士蓝，该反应称为普鲁士蓝反应。本研究应用该染色方法达到很好的染色效果，铁染色阳性细胞内铁氰化锰钾粒子分布比较均匀，染色较深。其反应式为：4Fe3++3Fe(CN)4-Fe4[Fe(CN)6]362.3.2电镜检查结果分析采用透射电子显微镜观察铁氰化锰钾纳米颗粒在大鼠肝脏中的数量及分布规律，重点观察肝窦区的网状内皮系统（包括枯否细胞、内皮细胞）及线粒体等细胞器内纳米颗粒的数量与对比剂注射时间的关系。并应用电镜能谱分析功能分析肝脏内纳米粒子的各元素成分。三、结果大鼠肝脏HE染色显示肝脏结构正常，肝细胞形态完整，细胞质红染，细胞核深染，未见明显异常颗粒显示（图1）。大鼠肝脏普鲁士蓝铁染色法染色显示，蓝染的铁氰化锰钾纳米颗粒在肝窦区聚集（图2）。注射对比剂后5分钟肝窦区可见蓝染的细小颗粒，随着时间的延长蓝染的细小颗粒数量逐渐增多，注射后1~2小时时间点肝窦区蓝染颗粒最多，随后随着时间的延长蓝染的细小颗粒数量逐渐减少，注射后16小时、24小时时间点肝窦区蓝染颗粒基本消失。电镜检查结果显示，肝窦区Kupffer细胞内见簇状聚集的纳米粒子（图3）。通过高分辨率透射电镜的能谱元素分析（图4、表1），显示该粒子含Mn、Fe元素，且Mn与Fe元素比约为1:1（分别为45.44%和54.56%），与铁氰化锰钾化学式KMn[Fe(CN)6]一致。42 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分abcfdeghijkl图1大鼠肝脏组织HE染色(HE×250)，图a为对照组（未注射对比剂），图b-l依次为注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点（5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h）肝组织HE染色图片。肝脏结构正常，肝细胞形态完整，细胞质红染，细胞核深染，未见明显异常颗粒显示。43 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究abcdefghijkl图2大鼠肝脏组织普鲁士蓝染色(放大倍数×400)，图a为对照组（未注射对比剂），图b-l依次为注射铁氰化锰钾纳米对比剂后不同时间点（5min、15min、30min、1h2h、3h、4h、6h、10h、16h、24h）肝组织普鲁士蓝染色图片。对照组肝脏组织内未见蓝染颗粒。实验组肝脏组织内见蓝染颗粒，1h、2h时间点（图e、图f）肝脏组织内蓝染颗粒最多，24h时间点（图l）仅见少量蓝染颗粒。44 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分abcdef图3注射铁氰化锰钾纳米对比剂后1h时间点大鼠肝脏电镜图片。图a肝细胞（白箭），肝窦区（白五角星区域）内见铁氰化锰钾纳米颗粒（黑箭）。图b-e依次为纳米颗粒在2μm、1μm、200nm、100nm下的图像。图d-e显示铁氰化锰钾纳米颗粒开始分解，显示为无正常晶体样结构。图f显示多个纳米颗粒簇状聚集。45 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究表1高分辨率电镜能谱元素分析元素线类型k因子k因子类型吸收修正wt%wt%SigmaMnK线系1.21811.0045.442.97FeK线系1.22211.0054.562.97总量:100.00注：wt%表示质量百分数；wt%Sigma表示质量相对标准偏差图4肝窦内纳米颗粒的电镜能谱元素分析，颗粒主要含Mn、Fe元素，且Mn与Fe元素比约为1:1，符合铁氰化锰钾化学式KMn[Fe(CN)6]。46 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分讨论肝脏是人体具有消化功能的重要器官，亦是构成网状内皮系统的重要组成部分，参与正常免疫活动，虽然它不直接产生抗体，但是，肝内有大量的吞噬细胞，在机体免疫中发挥重要作用[1-2]。血液中颗粒物质都是通过人体网状内皮系统的细胞吞噬作用来清除掉的，这些吞噬细胞主要分布于肝脏、脾脏、骨髓内，其中在肝脏内起作用的主要为Kupffer吞噬细胞。高效的弛豫效能、良好的安全性、高选择性的生物分布是所有肝脏磁共振对比剂应具备的基本特征。所谓的高选择性的生物分布意味着MR对比剂进入生物体内后由不同组织或者细胞特异性摄取或清除。MR对比剂在不同器官或组织中被摄取或清除的程度不同、空间分布上差异或时间上的先后决定了该对比剂的生物选择性或组织器官的特异性。肝脏MRI对比剂按临床应用可分为以下五类：非特异性血管外细胞外间隙对比剂、网状内皮系统对比剂、血池对比剂、肝细胞特异性对比剂和肿瘤定向对比剂[2-4]。肝脏MRI对比剂按作用部位主要分为：肝细胞特异性对比剂和网状内皮系统对比剂。肝细胞特异性对比剂主要有：Mn-DPDP、Gd-BOPTA、Gd-EOB-DPTA。Mn-DPDP的螯合物结构DPDP与维生素B6的化学式相似，其进入生物体内通过肝细胞膜上的维生素B6通道转运入肝细胞内。Gd-BOPTA、Gd-EOB-DPTA均是通过肝细胞膜上的有机阴离子转运系统，即胆色素转运系统进入肝细胞内的。作用于网状内皮系统的对比剂主要以超顺磁性氧化铁颗粒为主，该颗粒通过血管进入生物体内会被网状内皮系统的Kupffer摄取、清除。本研究中的铁氰化锰钾纳米颗粒属于后者，作用机制主要是特异性地被肝脏Kupffer细胞摄取。肝脏不典型局灶性病灶的良恶性鉴别诊断一直是影像学面临的难题，肝脏特异性对比剂对肝脏病变的早期定性诊断和预后具有重要的临床意义[5]。因此，需要研发更敏感、更高效、特异性更高的MR成像对比剂。1.非特异性对比剂Gd-DTPA在肝脏中的应用Gd-DTPA作为磁共振成像最早的细胞外间隙对比剂，在临床上应用广泛。随着磁共振成像软件和硬件新技术的不断开发应用，尤其是快速梯度回波等扫描技术的应用，使肝脏快速动态增强扫描得以实现。病灶的血供状态是鉴别病变性质的重要特征之一，通过动态增强扫描可以反映病变的血供情况，在肝脏结节性病变的检测和定性诊断方面具有重要的作用。国外有学者研究表明[6-7]，Gd-DTPA在显示不典型增生结47 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究节（dysplasticnodule，DN）的敏感性方面明显高于肝脏特异性对比剂超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagneticironoxide，SPIO）。此外，对于肝硬化的患者，Gd-DTPA的显影效果也较SPIO更好。semelka报道[8]，动态增强磁共振检测小肝癌的敏感性高于动态增强CT扫描。原发性小肝癌主要由肝动脉供血，Gd-DTPA增强扫描时动脉期明显强化，门静脉期和延迟期信号下降，呈典型的“快进快出”的改变[8-10]。有研究表明，绝大多数原发性肝癌的血供主要来自肝动脉，但少数病灶也会通过门静脉供血。在标本体外血管铸型的研究中，涂小煌[11]发现，75.6%(34/45)的肝癌结节中既有肝动脉分支，也有门静脉分支的存在。在少数（7/35）直径小于3cm的肿瘤结节中仅有门静脉分支进入。在应用常规SE序列扫描时，因为成像速度慢，大多数层面落在增强晚期。快速梯度回波序列的开发，可以实现在一次屏气或两次屏气期间完成全肝的成像，不但可以动态观察肝脏病灶的信号曲线的变化，而且减少了伪影，图像质量大大提高。有文献[12]报道，为了减轻T2穿透效应（即本身T2值很长的组织或器官在增强上可以表现为明显高信号），TE须选最短值，以提高信噪比。目前，国内公认将动态增强期相细分为五个[13-14]：即动脉早期、动脉晚期、门静脉期、门静脉晚期、平衡期。动脉早期：即经外周静脉注射Gd-DTPA后20-30秒内，此时腹主动脉及其分支强化显著，清楚显示左肝动脉、右肝动脉，胰腺和肾皮质也明显强化，肝脏实质尚未开始强化。动脉晚期：一般在对比剂注入后30-50秒内，肝动脉隐约可见且门静脉开始强化，肝脏实质轻度增强。门静脉早期：一般在注射对比剂后55-70秒内，门静脉左支、右前支和右后支或其下级分支显影，此时为肝实质强化的峰值期。门静脉晚期：一般在注入对比剂后75-90秒内，肝静脉明显强化，肝实质及腹主动脉强化程度开始缓慢下降。平衡期：一般在注射对比剂后2-5分钟，对比剂在血管内外的分布处于平衡状态。2．肝脏特异性对比剂GD-EOB-DTPA的应用GD-EOB-DTPA，又称钆塞酸二钠，商品名普美显，是德国拜耳医药公司研发并投入临床使用的一种新型双功能肝胆特异性磁共振成像对比剂，是在经典的顺磁性磁共振对比剂Gd-DTPA基础上增加亲脂性的EOB基团[15-17]。所谓双功能对比剂，是指该对比剂具有与Gd-DTPA相类似的细胞外代谢过程，亦能提供多期动态增强扫描图像。此外，还能以50%的比例被正常功能肝细胞选择性摄取代谢并从胆道排泄，因而48 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分实现肝实质和胆道系统的特异性强化，故又被称为肝胆特异性对比剂，这种延迟显像也被称为肝胆特异期（hepatobiliaryphase）。Park[18]等人通过受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲线），分别研究了Gd-DTPA、Gd-EOB-DTPA诊断小肝癌的敏感性和准确性，在对59例肝脏病灶的检测中，Gd-EOB-DTPA的灵敏度为86.4%，95%置信区间为75-93.9%，Gd-DTPA的灵敏度为64.4%，95%置信区间为50.9-76.4%。结果表明，Gd-EOB-DTPA对小肝癌的检测灵敏度明显高于临床常用的Gd-DTPA。目前，大多数Gd-EOB-DTPA的应用研究仅局限于肝脏局灶性病变的定性诊断和肝内小病灶的筛查。Ma[19]试图应用Gd-EOB-DTPA评估大鼠肝损伤纤维化及早期肝硬化肝细胞的功能，结果发现，肝脏的相对增强指数（relativecontrastenhancementindex，RCEI）与肝脏纤维化存在一定的相关性。尽管Gd-EOB-DTPA在检测小肝癌方面具有一定的优势，但是，有学者认为该对比剂亦可用于肝纤维化、肝硬化等肝功能评估。Ma等在大鼠给药CCl4后1周内进行MRI扫描和血清白蛋白测定（避免了急性毒性和炎症反应），测定RCEI（SI增强后-SI增强前）／SI增强前）与白蛋白的相关性。结果表明，将Gd-EOB-DTPA对肝脏的相对对比度增强指数作为肝功能变化的指标，可用于评估患者的肝细胞功能，为精确评估肝纤维化提供依据。GD-EOB-DTPA评估肝纤维化及早期肝硬化的价值有待于进一步深入研究。3．肝脏特异性对比剂SPIO的应用SPIO属于网状内皮系统特异性对比剂，其T2效应由偶极一偶极相互作用和磁化率效应引起，磁化率效应是SPIO成像的主要强化机制[20-22]。SPIO粒子在体内主要分布于吞噬细胞及血管内，呈不均匀腔隙性分布，且SPIO粒子的磁化矢量大，会诱导局部磁场的不均匀性，水分子(质子)扩散通过这个不均匀磁场时，改变了质子横向磁化的相位，从而导致快速自旋散相，加速了质子去相位过程，使质子的T2驰豫时间缩短。Weissleder[23]等首先成功制备出标记阿拉伯半乳糖衣和去唾液酸胎蛋白的超顺磁氧化铁及超微型超顺磁氧化铁颗粒，使SPIO靶向聚集到肝组织的能力得到提高。张晓东等[24]制备半乳糖基白蛋白-SPIO，发现其主要作用于肝实质细胞，肝脏负性强化效应较好，有助于发现肝内的小肿瘤。在比较不同的肝脏特异性药物的研究中，SPIO增强MRI显示了不同程度的优势，特别是对小病灶的诊断。最近几年，磁共振静脉（IV）的超顺磁性氧化铁（SPIO）49 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究一直被认为是检测肝转移最敏感的方法[25]。目前，用于肝脏特异性显像的SPIO主要有AMI-25、和SHU555A型。这两种药物的粒径约为30-200纳米，这导致约80%的注射剂量被正常肝脏网状内皮系统摄取。目前SPIO在肝脏领域的研究主要包括[26-27]，肝硬化的分级、小转移癌病灶的诊断、肝癌的靶向性建立等。其中肝癌的靶向性研究最为火热，Veiseh[28]发现慢性肝炎和肝硬化的肝组织内，MMP-2的表达较弱，而在肝癌中的具有较高的表达，并且肿瘤的侵袭性、转移、复发趋势、分化程度均与MMP-2具有相关性。他于2009年成功合成了CTX修饰的SPIO-NPs纳米粒子，CTX对以下两种物质有亲和性，包括氯离子通道中的脂类复合物以及MMP-2。Veriseh与Kievit等人[29]研究发现核糖核酸苷(RNAi)治疗癌症是一种有潜力的方法，通过与该纳米探针结合，能有效地干扰RNA(siRNA)传递，从而提高了治疗肿瘤的特异性。SPIO临床上一直被用于T2WI成像，但是SPIO对T1WI亦有一定影响，增强原理与Gd-DTPA相似，也是通过PEDDPRE起的作用。当浓度较低时可以明显缩短T1弛豫时间，随着浓度增高T[30-31]1WI增强效果减弱。这种原因可能是高浓度的氧化铁粒子与水分子接触面积减小，T1增强效果减弱，或者是高浓度的SPIO粒子T2效应占优势，超过了其缩短T[32-33]1WI的作用。Ferucarbrotran等人认为，通过GRE序列在注射后的前几分钟获得动态T1图像同样具有重要意义。在这一阶段，铁氧化物颗粒分布在血管内的空间，剂量相对比较少但是很集中，产生T1增强图像对肝脏小肿瘤的鉴别具有重要意义，尤其是肝转移瘤。我们有必要重新认识到，在临床工作中通过薄层3D序列，结合T1WI和T2WI增强图像比仅用T2WI增强图像更能提高疾病诊断准确率。4．肝脏特异性对比剂Mn-DPDP的应用Mn-DPDP（泰乃影，Teslascan）是另外一种肝脏特异性MR对比剂，于欧美部分国家已经完成了三期临床试验，正式进入临床应用。一般认为，Mn-DPDP的安全性较高，LD50（半数致死率）为Gd-DTPA的2-5倍，不良反应的发生率也较低，约7%-17%。由于DPDP的化学结构与磷酸吡哆醛相似，因此Mn-DPDP可以通过维生素B6吸收途径进入肝细胞内，形成具有较好成像效果的肝脏特异性显像对比剂[34-36]。Mn-DPDP峰值持续时间窗较长，一次注射有足够的时间完成多种MRI序列扫描，这一优势与铁氰化锰钾的4-6小时时间窗特征相似，可增加数据采集时间以提高信噪比，层厚也可以很薄，从而提高病灶的显示率。正常成人静脉注射Mn-DPDP（5mmol／50 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分kg）后，1分钟后肝脏开始强化，5-10分钟胆管开始显影，大约20分钟肝实质强化达到峰值，持续强化时间约2-4小时。Mn-DPDP进入体内主要被有功能的肝细胞摄取，呈高信号，主要用于鉴别肝细胞源性疾病与非肝细胞源性病变，如肝细胞肝癌（HCCs）、局灶性结节增生（FNH）、肝腺癌[37]。Rockall[38]等人提出通过T2WI结合Mn-DPDP增强扫描可以进行神经内分泌类肿瘤肝转移的随访。他们对11例患者依次进行T1WI、T2WI和Mn—DPDP增强扫描，病灶在3个序列中均显示为低信号团块。在Mn—DPDP增强图像中，由于正常肝细胞对Mn—DPDP的吸收，使病灶周围正常肝组织呈明显高信号。T1WI、T2WI和Mn—DPDP增强MRI对全部11例265个肝内转移灶的检出率分别为48％、52％和92％。Mn—DPDP增强MRI是一种显示神经内分泌肝转移的可靠技术，明显提高了对转移灶的检出率，同时可以重复的检测肝脏转移病灶的数量和病变的大小。Pomeroy[39]等人通过成年大鼠的左冠脉闭塞模型分析Mn-DPDP划分心肌急性缺血区域的评估能力。他发现正常心肌的信号强度（SI）注射对比剂后约增加125±9%SI平扫，正常心肌1小时后强化程度不改变。急性缺血区心肌注射对比剂后信号强度（SI）注射对比剂后约增加16±14%，1小时后会逐渐上升到44±1%。Pomeroy认为通过Mn-DPDP增强图像计算SI平扫用以显示冠状动脉阻塞引起的至少一个小时的的危险区划定非常具有意义。Wang[40]通过34名患者，47例HCCs研究了关于Mn-DPDP与肝癌结节分化的相关性。肝癌结节通过Mn-DPDP给药增强后，高分化肝癌细胞较低分化肝癌细胞更多的吸收，在MR图像上显示更亮。此外，肝硬化肝实质强化程度明显低于非肝硬化肝实质，可能是由于肝纤维化改变导致肝功能障碍，Mn-DPDP吸收受限，图像强化不明显。5．铁氰化锰钾纳米粒子对肝脏特异性成像研究Kupffer细胞为肝内巨噬细胞，细胞形态多样，细胞质内溶酶体多，具有吞噬、代谢、产生细胞因子及抗肿瘤免疫等多种作用，在宿主防御机制及维持体内环境稳定中起着重要作用[41]。SPIO进入体内后被肝脏Kupffer细胞吞噬，并聚集于溶酶体内，铁离子会缩短肝实质T2WI驰豫时间，使T2WI上正常肝脏信号强度明显降低。铁氰化锰钾纳米颗粒进入体内后，同样被肝脏Kupffer细胞摄取吞噬，使局部组织T2弛豫时间缩短，信号减低。本研究发现，铁氰化锰钾纳米对比剂经尾静脉注入大鼠体内后5分钟，肝窦区可见蓝染的颗粒，随着时间的增加肝窦区蓝染的颗粒数量逐渐增加，51 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究于注射后1小时至2小时达高峰，随后逐渐减少，注射后16小时、24小时时间点肝窦区蓝染颗粒基本消失。铁氰化锰钾纳米颗粒在肝脏中的分布特征及数量变化规律与本研究第二部分铁氰化锰钾纳米粒子的MR图像强化特征相符。通过电镜观察，铁氰化锰钾纳米颗粒在肝窦区的Kupffer细胞内呈簇状聚集分布，通过高分辨率透射电镜的能谱元素分析表明，该粒子含Mn、Fe元素，且Mn与Fe元素比约为1:1（分别为45.44%和54.56%），与铁氰化锰钾化学式KMn[Fe(CN)6]一致。铁氰化锰钾纳米对比剂注入机体后被网状内皮系统摄取，网状内皮系统主要包括内皮细胞、枯否氏细胞、网状细胞，只有Kupffer细胞具有吞噬功能。肝脏富含Kupffer细胞，铁氰化锰钾纳米对比剂注入机体后主要被肝脏Kupffer细胞吞噬、摄取，引起肝脏信号强度的明显变化，对肝脏具有特异性增强的功能。随着研究的深入，相信铁氰化锰钾纳米对比剂在肝脏的研究中具有广阔的发展和应用前景。52 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究第三部分参考文献[1].KarabulutN,ElmasN.ContrastagentsusedinMRimagingoftheliver[J].DiagnIntervRadiol,2006,12(1):22-30.[2].徐隽,宋彬,闵鹏秋.肝脏磁共振对比剂研究现状及发展方向[J].临床放射学杂志,2001,20(9):716-719.[3].陈柱，肖恩.SPIO纳米颗粒在肝癌磁共振早期诊断的基础研究进展[J].磁共振成像,2015,6(4):315-320.[4].WardJ.NewMRtechniquesforthedetectionoflivermetastases[J].CancerImaging,2006,6(1):33-42.[5].笪仍容.Mn-DPDP增强MRI对肝脏局灶性病变及HCCs分化、侵袭性的研究兼与Gd-DTPA比较[D].复旦大学,2001.[6].RasuharuI，TakamichiM，ShigeyukiY，eta1.Superparamagneticironoxide·enhancedMRimagingofhepatocellularcarcinoma:correlationwithhistolocical[J].Hepatology,2000，32(2):205-212.[7].MarchalG,ZhangX,NiY,etal.ComparisonbetweenGd-DTPA,Gd-EOB-DTPA,andMn-DPDPininducedHCCinrats:acorrelationstudyofMRimaging,microangiography,andhistology[J].MagnResonImaging,1993,11(5):665-674.[8].SemelkaRC,MartinDR,BalciC,etal.Focalliverlesions:comparisonofdual‐phaseCTandmultisequencemultiplanarMRimagingincludingdynamicgadoliniumenhancement[J].JMagnResonImaging2001,13(3):397-401.[9].AhmedA,ZhangC,GuoJ,etal.FabricationandCharacterizationofGd-DTPA-LoadedChitosan-Poly(AcrylicAcid)NanoparticlesforMagneticResonanceImaging.[J].MacroBio,2015,15(8):1105-1114.[10].YanC,ChenC,LinH,etal.Single-walledcarbonnanotube-loadeddoxorubicinandGd-DTPAfortargeteddrugdeliveryandmagneticresonanceimaging[J].JDrugTarget,2017,25(2):163-171.[11].涂小煌，陆志范，周信达，等.原发性肝癌的供血动脉解剖分析[J].中国临床医学影像杂志，1999;10:337-340.[12].HussainSM，SemelkaRC，MitchellDG.MRimagingofhepatocellularcarcinoma[J].MagnResonImagingClinNAm.,2002，10(1):31-52.53 第三部分铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究[13].黎美玲,陆健,曹鹏.动态对比增强MRI在肝脏中的应用与研究进展[J].中国医学影像技术,2017,33(1):149-152.[14].张雪辉.磁共振SPIO增强、Gd-DTPA动态增强在肝脏病变中的应用研究[D].中山大学,2004.[15].李莉,唐鹤菡,刘洋洋,等.Gd-EOB-DTPA增强MRI定量评估肝脏储备功能的可行性研究[J].放射学实践,2016,31(1):19-25.[16].DaiS,NishieA,AsayamaY,etal.MRPredictionofLiverFunctionandPathologyUsingGd-EOB-DTPA:EffectofLiverVolumeConsideration[J].BiomedResInt.,2015,2015:141853.[17].HaimerlM,VerlohN,FellnerC,etal.MRI-basedestimationofliverfunction:Gd-EOB-DTPA-enhancedT1relaxometryof3TvstheMELDscore[J].SciRep,2014,4:5621.[18].ParkG,KimYK,KimCS,etal.Diagnosticefficacyofgadoxeticacid-enhancedMRIinthedetectionofhepatocellularcarcinomas:comparisonwithgadopentetatedimeglumine[J].BrJRadiol,2010,83(996):1010-1016.[19].VoglTJ,SchwarzW,BlumeS,etal.Preoperativeevaluationofmalignantlivertumors:comparisonofunenhancedandSPIO(Resovist)-enhancedMRimagingwithbiphasicCTAPandintraoperativeUS[J].EurRadiol,2003,13(2):262-272.[20].ShenZ,WuA,ChenX.IronOxideNanoparticleBasedContrastAgentsforMagneticResonanceImaging[J].MolPharm,2016.[21].ParkHS,LeeJM,KimSH,etal.Differentiationofwell-differentiatedhepatocellularcarcinomasfromotherhepatocellularnodulesincirrhoticliver:valueofSPIO-enhancedMRimagingat3.0Tesla[J].JMagnResonImaging,2009,29(2):328-335.[22].LiauJ,ShiehmortezaM,GirardOM,etal.EvaluationofMRIfatfractionintheliverandspinepreandpostSPIOinfusion[J].MagnResonImaging2013,31(6):1012-1016.[23].WeisslederR,ReimerP,LeeAS,etal.MRreceptorimaging:ultrasmallironoxideparticlestargetedtoasialoglycoproteinreceptors[J].AJRAmJRoentgenol,1990,155(6):1161-1167.[24].XiaodongZ,YikaiX,GangD,etal.Thevalueofdetectionofsmalllivertumorwithgalactose-bovine-serum-albumincontainingsuperparamagneticironoxidein54 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铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究结论结论1、铁氰化锰钾纳米颗粒的表面结构稳定、粒径均一、分散性好、具有良好的生物相容性。铁氰化锰钾纳米颗粒具有较高的R1弛豫率和R2弛豫率，其浓度与磁共振图像信号强度具有明显相关性，可作为T1、T2对比剂。铁氰化锰钾纳米剂量使用具有足够的安全范围，生物相容性较好。2、铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏的T2负性增强效果最明显，于1h达到强化峰值，保持平台型强化至3h，成像时间窗较长。肾脏T2负性强化较弱，且强化相对较慢；心肌T2负性强化最弱。铁氰化锰钾纳米对比剂对肝脏具有一定的特异性，可作为肝脏T2负性对比剂。3、SD大鼠经静脉注射铁氰化锰钾纳米对比剂后，对比剂被肝脏特异性摄取，主要积聚在肝窦区Kupffer细胞内，肝脏摄取的铁氰化锰钾纳米颗粒数量与时间呈相关性，于1小时摄取数量最多，该特征与铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI图像信号变化一致。57 综述铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究综述磁共振锰基纳米对比剂最新研究进展及其应用徐耀综述范国华审校磁共振成像（MRI）是目前最受欢迎的无创性医学影像检查技术之一。MR具有以下诸多优势，软组织分辨率高、成像灵活（多序列、多参数）、实时3D图像、采集特定组织信息等。随着MRI应用领域的进一步拓展，其应用价值将会在疾病早期检测、早期诊断和个体化治疗等方面得到充分体现[1-3]。但统计显示，在所有磁共振检查的病例中约有30%需要注射对比剂来提高图像质量，以提高病变的诊断和鉴别诊断的准确性。因此，应用MR对比剂，尤其是器官或组织特异性对比剂可以进一步提高组织分辨率，提高微小病灶的显示、疑难病变的鉴别能力，更好地服务于临床。目前，绝大部分磁共振对比剂（magneticresonancecontrastagents，MRCA）的成像原理是通过缩短人体组织内的水质子T1弛豫时间或者缩短T2弛豫时间。镧系金属钆是开发最早、临床应用最广泛的小分子MR对比剂。但是，近年来发现钆对比剂可能引起严重的副反应-肾源性系统性纤维化，FDA已经发布了相关公共卫生公告，严禁肾功能障碍患者使用钆类对比剂[4-5]。近年来，有国内外学者致力于纳米对比剂的研究，纳米对比剂的优势主要包括[6-7]：①多模态、多模式成像；②纳米粒子的物化特征及生物相容性的高度整合及优化；③对纳米粒子表面功能化修饰实现肿瘤特异靶向性。1.MR对比剂主要分类MR对比剂的分类多种多样，按化学成分可分为顺磁性离子混合物型和超顺磁性粒子型（包含镧系金属元素和过渡金属元素）；按临床应用可分为正性对比剂[8]（细胞外间隙对比剂、血池对比剂、肝特异性对比剂），负性对比剂（被动靶向型）[9]；按MR成像特征可分为T1弛豫对比剂、T2弛豫对比剂和双弛豫对比剂；按生物学分布特性可分为细胞外间隙对比剂、血池对比剂、网状内皮系统清除对比剂、肝细胞特异性对比剂等。目前，临床上广泛使用的是钆类对比剂[10]，常见的主要有Gd-DTPA、Gd-DOTA、Gd-EOB-DTPA等钆类螯合物，其中Gd-DTPA的使用最为广泛。Gd-DTPA又称为二乙三胺五乙酸钆（商品名，马根维显），是T1弛豫对比剂，可用于全身MR增强对58 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究综述比，大大提高了磁共振成像的诊断水平。Gd-DTPA经静脉注射后，通过毛细血管壁进入周围组织细胞外间隙，不进入组织细胞内，再循环于外周组织间隙，最后100%对比剂通过肾脏代谢。Gd-DTPA分布没有特异性，组织强化的程度取决于肿瘤血供是否丰富。这种反应组织血管数量与灌注流量的特征，可通过FSE、FGRE等快速扫描序列获取组织或者肿瘤的动态增强信息。Gd-EOB-DTPA又称钆塞酸二纳（商品名，普美显）[11-12]，是一种肝细胞特异性磁共振对比剂。Gd-EOB-DTPA经静脉注射后，其中50%剂量通过肝窦肝细胞膜上的转运多肽由细胞外间隙转运入肝细胞，随后由位于胆小管上的蛋白载体（MRP2）排泄至胆小管，因此Gd-EOB-DTPA的肝细胞摄取量可以间接反应肝功能的状况。此外，Gd-EOB-DTPA50%剂量通过肝脏代谢，另50%通过肾脏代谢，如若肝、肾两种排泄途径之一存在排泄功能障碍，另外一种途径将排泄增加，出现代偿性排泄现象。目前，Gd-EOB-DTPA对比剂可以采集动态增强图像，显示病灶血供情况，同时可以进行肝胆期成像（观察对比剂的摄取情况），极大地提高乏血供HCC的检出率。虽然Gd-EOB-DTPA对HCC具有较高的诊断正确率，但是其肝胆期图像特异性不高。囊肿、血管瘤、转移瘤都不含正常肝细胞，在Gd-EOB-DTPA增强肝胆期图像上均表现为低信号，因此，Gd-EOB-DTPA在肝脏局灶性病变的定性诊断中存在一定的限度。2.磁共振纳米对比剂最新研究进展近年来，T1纳米粒子对比剂的研发已取得了可喜的成就，有望取代存在诸多弊端的钆基对比剂。纳米技术为生物医学和临床药学研究领域带来革命性的影响，也带来了多学科交叉融合发展的契机，如纳米肿瘤靶向药物、基因工程传递以及新型MRI对比剂等方面的开发应用[13-14]。交叉学科纳米医学的快速发展将磁共振对比剂的发展带入一个新纪元，更多新颖、方便、实用的纳米对比剂正在逐步应用于临床。与传统磁共振对比剂相比，纳米粒子对比剂具有以下优势[15-16]：①良好的生物特性和体内分布的可调性，保证对比剂一定的表面修饰特征；②通过控制对比剂的化学成分、形状和大小，调整其生物相容性和成像特性；③通过与抗体、核酸和多肽等生物分子共轭结合，从而具有特异靶向性特征；④将纳米材料与光学特性和磁性特征材料结合，实现多模态联合成像。59 综述铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究新型MRI对比剂包括钆螯合物修饰的纳米粒子和具有较高生物敏感性和特异性的无机纳米粒子对比剂，主要以含Gd/Mn的纳米对比剂为主。目前，常见纳米粒子MR对比剂主要有以下两种：①铁氧化物纳米对比剂；②钆基和锰基对比剂。2.1氧化铁纳米对比剂目前，研究比较热门的铁氧化物磁共振对比剂属于超顺磁性T2对比剂。按照粒子直径大小，主要分为磁性氧化铁纳米颗粒[17]（magneticironoxidenanoparticles,MION，μm）、超顺磁性氧化铁（superparamagneticironoxide，SPIO,hundredsofnm）、超微粒顺磁性氧化铁（ultra-smallparamagneticironoxide，USPIO,<50nm）。SPIO是目前使用最广泛的网状内皮系统对比剂，主要用于肝脏局灶性病变的良恶性鉴别诊断[18-19]。SPIO经静脉注射后，主要被肝脏的网状内皮系统的Kupffer细胞特异性吞噬摄取，缩短局部组织的T2弛豫时间，从而引起相应区域的信号减低。相反，肝脏组织内不含Kupffer细胞的病灶相对于周围低信号的正常肝实质呈高信号，从而使病变与组织的信号对比度增加，易于病变的检出。USPIO临床应用相对较少，由于其粒子直径小于SPIO，故不被网状内皮系统Kupffer细胞吞噬摄取，USPIO经静脉给药后可以长时间存留在毛细血管内（血浆半衰期约200min），因此USPIO又称血池对比剂。目前，其应用领域主要包括淋巴结显影成像、血管显影成像、血池成像、监测血脑屏障渗透等。Lammers[20]研究发现，USPIO以α-氰基丙烯酸正丁酯作为胞衣可以有效调节和监控BBB渗透，在时间和空间上控制血脑屏障开放，进行引导及针对性触发，对部分肿瘤以及阿尔茨海默病的诊治具有重大意义。Valdora[21]等人采用USPIO监测大鼠慢性淋巴细胞性白血病模型的进展，结果表明，USPIO可用于评估治疗效果，为选择最佳治疗时机提供信息。2.2钆基纳米对比剂钆基纳米对比剂是另一种新型对比剂。目前，除了常见的含钆的小分子对比剂Gd-DTPA、Gd-DOTA外，国内外学者对一系列大分子钆基对比剂进行了研究，包括白蛋白、多糖、聚乙二醇、聚赖氨酸等大分子结构对比剂。这种基于大分子树突样结构的对比剂颗粒直径较大，使其荷载的钆螯合物充分暴露于大量水分子中，提高了弛豫效果。这类对比剂多用于分子靶向成像领域。目前，可用于荷载Gd3+的纳米材料包括树突体、复合物、乳胶、金属、硅纳米粒子及微泡等[22]。国外关于钆基纳米粒子对比剂的研究主要包括[23-24]：①脂质顺磁性全氟化碳纳米粒子，粒径约250nm，具有60 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究综述较高的钆结合率及较好的弛豫效能；②树突钆纳米粒子，树突分子合成纳米粒子的粒径很大，但是结合位点数目有限；③脂质体，表面型含钆脂质体可产生较高的弛豫效果。但是，由葡聚糖合成的小型氧化钆纳米对比剂，由于其纳米粒子的分散性受限，目前还难于应用于磁共振成像。2.3锰基纳米对比剂Mn2+有5个不成对的电子，且具有较高的弛豫时间，是继钆离子后另一种常用于MR对比剂的金属离子。早期由于受制于合成技术的限制，一直很难合成具有较高敏感性和稳定性的Mn2+磁共振对比剂化合物[25-26]。近几年，国内外有学者致力于锰基纳米粒子对比剂研发，研制了多种锰基纳米颗粒磁共振对比剂[27-29]，如MnO、Mn3O4，Mn3O4@SiO2，MnO@介孔SiO2、以及中空的MnO纳米粒子，该类对比剂具有较高的弛豫率，同时又具有较好的生物学稳定性。锰基纳米对比剂按粒子体积主要分为小分子型和大分子型，按结构功能主要分为以下四类：2.3.1氧化锰纳米粒子目前，研制的氧化锰纳米粒子众多，如MnO、Mn3O4等，常用的合成途径是热油酸锰在高沸点溶剂诱导下合成。这种纳米颗粒制备方法能精确控制粒子的大小，但其主要的缺点是纳米粒子的表面存在钝化层与油酸，使其具有高度的疏水性。与T2对比剂不同的是T1对比剂需要对周围水质子产生直接的相互作用，从而影响其弛豫时间。对水质子弛豫时间的影响主要取决于纳米粒子表面的Mn粒子。对于纳米对比剂而言，粒子体积越小、面积／体积比越大、T[30]1弛豫率越高。Huang使用硬脂酸锰为前驱体，制备MnO/Mn3O4水热分解纳米粒子，纳米粒子尺寸小于5mn，使MnO的R1较高，约为1mM-1s-1。Baek[31]等以三乙二醇为溶剂，以D-葡萄糖醛酸为包衣材料制备2-3nm级别的纳米MnO，R1为7.02mM-1s-1，大大超过其他氧化锰对比剂。2.3.2空心氧化锰纳米粒子如上所述，提高纳米粒子的面积／体积比能提高对比剂的r1值。一方面可以通过减小粒子尺寸，另一方面可采用空心纳米粒子以提高纳米粒子的面积／体积比。空心的纳米粒子不仅可以提高弛豫率，同时其内部空间亦可装载药物、靶向探针、基因传递系统等[32]。Jeon[33]等采用空心氧化锰纳米粒子监测新生大鼠缺氧缺血性脑病的疾病进展，发现凋亡细胞的区域与空心氧化锰纳米对比剂增强区域相匹配，而星形胶质细胞区域没有强化。Varshosaz[34]等研究空心无机物纳米粒子的传递性能，结果表明，61 综述铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究空心氧化锰纳米粒子作为非病毒siRNA传递系统具有较好的增强细胞摄取的作用。kim[35]等发现空心氧化锰纳米粒子结合抗体Aβ1-40可以检测到小鼠脑区的阿尔茨海默氏淀粉样板块沉积。空心氧化锰纳米粒子的这种独特作用具有广阔的临床应用前景，特别是应用于监测阿尔茨海默病对药物治疗的反应。在目前应用的生物医学纳米材料中，介孔二氧化硅纳米颗粒具有规则的孔道结构、高的面积／体积比、可调的孔道尺寸、优良的表面可修饰性和良好的生物相容性等特点，在未来的影像诊断治疗学中，介孔二氧化硅纳米颗粒可广泛应用于装载药物、连接光学材料或MR成像分子探针等。2.3.3二氧化硅包覆氧化锰纳米粒子锰基纳米粒子作为新型MR对比剂，近年来备受关注。进一步提高其水溶分散性、生物相容性、生物官能团结合能力有助于提高其成像功能。二氧化硅涂层在生物环境中具有稳定的化学／物理性能，与此同时，二氧化硅包覆氧化锰纳米粒子在特定的生理变化中可改变MR的弛豫能力，如组织/细胞的pH值、氧化还原状态、氧合的变化或代谢物的水平等，受到了研究者越来越多的关注。众所周知，过渡金属氧化物，如氧化锰，溶于酸性溶液导致Mn2+离子的释放[36]。因此，不同涂层材料的MnO纳米粒子，会有不同的离子释放率。在pH等于7.4时，MnO@SiO2具有稳定的胶体特性，极少释放Mn2+，粒子弛豫率较小。在pH等于5时，由于二氧化硅壳层的多孔结构，MnO@SiO2呈时间依赖性缓慢释放Mn2+，使Mn2+完全溶解，此时粒子弛豫率是在pH等于7.4时弛豫率的20倍。Lee[37]认为MR对比剂在经胞体内／溶酶体途径引起的低pH环境下缓慢释放的特征，对提高分子对比剂特异性和敏感性具有重要意义。2.3.4锰纳米粒子掺杂纳米有机金属基质在锰氧化物纳米工程中，有一种通过掺杂自由Mn离子或者将锰配合物联合其它纳米基质合成锰基纳米粒子的方法，以提高锰基纳米对比剂的磁共振成像效能。Niesman[38]等发现，将MnCl2加载到脂质体后，肝脏特异性对比剂LD50比MnCl2低7-11倍。此外，在大鼠肝脏肿瘤种植模型中，该纳米粒子使肝脏组织弛豫率增加，而肿瘤区域弛豫率则没有变化，这一特征表明该对比剂可以作为肝脏特异性对比剂。但是，脂质体类对比剂在体内的不稳定性需引起重视，经静脉注射后该类对比剂很快被免疫系统捕获并降解，除了肝脏和脾脏外，很少在人体其他部位停留。Taylor[39]等研究了含锰有机金属框架类锰基纳米对比剂，此类晶体结构与上述金属氧化物纳米晶体62 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究综述截然不同，通过使用苯二甲酸（BDC）或苯三酸（BTC）作为桥联配体，然后通过反相微乳液过程，Mn（II）与桥联配体络合并形成纳米棒结构，该纳米颗粒具有良好的R-1-11弛豫率，可以达到5.5mMS。3.T1-T2对比剂目前，MRI对比剂通常是顺磁性T1对比剂或超顺磁性T2阴性对比剂。临床上首选的T1对比剂是钆类对比剂，钆类对比剂具有较高的弛豫率，但是，狭窄的成像时间窗和脂肪组织的信号干扰是其亟待解决的问题。超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒作为T2阴性对比剂，在过去的20年里受到极大的关注，SPIO具有优异的超顺磁性，在磁共振T2增强成像方面颇具优势。但是，在对比增强图像上出现的病灶信号强度降低易与出血、钙化或其他异常相混淆。这种负性对比效应和磁化率伪影大大限制了其临床应用。上述两种增强成像技术均有各自独特的优势和限度，将不同成像技术进行组合有助于为图像数据可视化提供全面的诊断信息，同时有助于更全面了解病变的影像特征及其病理生理基础。Weissleder[40]将大鼠分为3组对三种增强效果进行比较，3组大鼠分别注射Gd-DTPA、菲立磁、Gd-DTPA+菲立磁（15分钟后）观察肝脏局限性病灶的信号强度、对比信号强度（增强前后）。结果发现，Gd-DTPA+菲立磁双对比增强技术在提高肿瘤信号强度的同时降低了肝脏组织信号，较单独注射Gd-DTPA、菲立磁更易发现病灶。Yang[41]认为，开发双模态T1-T2对比剂是有必要的，必将显著提高影像医学的疾病诊断正确率。Yang通过热分解方法胺官能化二氧化硅包覆的四氧化三铁纳米粒子，形成Gd-DTPA-RGD，合成的纳米粒子R1值为4.2mM-1s-1，R-1s-1[42]2值为17.4mM。Li开发四氧化三铁/氧化钆纳米粒子作为T1–T2双模态对比剂，这种结合钆和铁特性的混合纳米对比剂R-1-11值为45.24Ms，R2值达到186.51mM-1s-1。Li通过大鼠对该对比剂进行体内磁共振成像实验，成年健康大鼠注射Fe3O4/Gd2O3后，分别于10分钟、30分钟、60分钟观察肝脏信号强度，并与增强前（平扫）的肝脏信号强度比较，结果显示，T2增强程度比平扫增加50%，但是T1增强程度比平扫只增加10%。总体而言，T1-T2双模态对比剂是未来磁共振对比剂发展的趋势[43]，但是，目前该类对比剂仅限于理化特性等研究，如高磁化率、最佳纳米粒子尺寸、高分散性和胶体稳定性等。由前期基础研究过渡到早期临床实验尚需进一步深入研究。63 综述铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究综上所述，锰基纳米对比剂具有广阔的开发应用前景，尤其是具有器官和组织特异性的对比剂，以及T1-T2双模态对比剂为磁共振对比剂的发展方向，对影像学的发展具有重要的意义。参考文献[1].PanD,SchmiederAH,WicklineSA,etal.Manganese-basedMRIcontrastagents:past,present,andfuture[J].Tetrahedron,2011,67(44):8431-8444.[2].BogdanovAJ,MazzantiML.Molecularmagneticresonancecontrastagentsforthedetectionofcancer:pastandpresent[J].SeminOncol.2011,38(1):42–54.[3].TakeshitaK,MatsumotoK.DevelopmentofMagneticResonanceBasedFunctionalImagingTechniquesHeadingUptoTheranostics~CreatingNextGenerationFunctionalContrastAgents~[J].YakugakuZasshi.,2016,136(8):1073-1074.[4].ThomsenHS.Recenthottopicsincontrastmedia.EurRadiol,2011,21(3):492-495.[5].PanD,CaruthersSD,SenpanA,etal.Revisitinganoldfriend:manganese-basedMRIcontrastagents[J].WileyInterdisciplinaryReviewsNanomedicine&Nanobiotechnology,2011,3(2):162–173.[6].BonnetCS,ÉvaTóth.SmartContrastAgentsforMagneticResonanceImaging[J].Chimia(Aarau)2016,70(1):102-108.[7].EstelrichJ,SánchezmartínMJ,BusquetsMA.Nanoparticlesinmagneticresonanceimaging:fromsimpletodualcontrastagents[J].IntJNanomedicine,2014,10：1727-1741.[8].XiaoYD,PaudelR,LiuJ,etal.MRIcontrastagents:Classificationandapplication(Review)[J].IntJMolMed,2016,38(5)：1319-1326.[9].WatersEA,WicklineSA.ContrastagentsforMRI[J].BasicResCardiol,2008,103(2):114-121.[10].RasuharuI，TakamichiM，ShigeyukiYeta1.SuperparamagneticironoxideenhancedMRimagingofhepatocellularcarcinoma:correlationwithhistolocical[J].Hepatology,2000，32(2):205-212.[11].DaiS,NishieA,AsayamaY,etal.MRPredictionofLiverFunctionandPathologyUsingGd-EOB-DTPA:EffectofLiverVolumeConsideration[J].BiomedResInt.,2015,2015:141853.64 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中英文对照缩略词表铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称MRImagneticresonanceimaging磁共振成像NSFnephrogenicsystemicfibrosis肾源性系统纤维化Mn-DPDPmangafodipirtrisodium锰福地吡三钠Gd-DTPAGd-Diethylene-tiaminepentaacetieacid二亚乙基三胺五乙酸钆Gd-BOPTAGadobenateDimeglumine钆贝葡胺Gd-EOB-DTPAGd-ethoxybenzyldiethylenetramine钆塞酸二钠pentaacetieacidT1WIT1weightedimaging纵向弛豫加权成像T2WIT2weightedimaging横向弛豫加权成像SPIOsuperparamagneticironoxide超顺磁性氧化铁TEMtransmissionelectronmicroscope透射电子显微镜XRDXraypowderdiffractometerX射线粉末衍射TRtimeofrepetition重复时间TEtimeofecho回波时间ROIregionofinterest感兴趣区SIsignalintensity信号强度SDstandarddeviationofthenoise背景噪声的标准差SNRsignaltonoiseratio信噪比SERsignalenhancementratio信号增强率NEXnumberofsignalsaveraged激励次数SPSSstatisticalpackageforthesocialscience社会科学统计软件包HCChepatocellularcarcinoma肝细胞肝癌FDAFoodandDrugAdministration美国食品药品监督管理局HEHematoxylin-eosinstaining苏木精伊红染色法DNdysplasticnodule不典型增生结节68 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究公开发表的学术论文攻读硕士研究生期间公开发表的学术论文徐耀，胡蓉，范国华.局限性机化性肺炎CT表现.实用放射学杂志.2017，33(5),25-28.69 致谢铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究致谢光阴荏苒，转眼间，三年的硕士研究生求学生活即将结束，这三年让我受益匪浅。苏州大学以其优良的学习风气、严谨的科研氛围教我求学，以其博大包容的情怀胸襟、浪漫充实的校园生活育我成人。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。首先，我要向我的导师范国华主任表示深切的谢意与祝福!本论文是在范主任的悉心指导之下完成的。虽然范主任对我要求严格，但是这些严格的要求都是对我的鞭策及鼓励。我的导师，学识渊博，严己律人，对专业孜孜以求，精益求精。如果说我从导师那里学会了怎样做好学问，那么首先应该说我从导师那里领略了真正的学术精神，导师严谨的治学态度和坚韧的探索精神将使我终生受益。在论文的选题、搜集资料和写作阶段，范主任都倾注了极大的关怀和鼓励，在论文的写作过程中，每当我有所疑问，遇到困难时，范主任总是会放下繁忙的工作，不厌其烦的指点我，在我初稿完成后，范主任又在百忙之中抽出空来对我的论文进行逐字逐句的批改，多次批改至深夜，给我提出许多非常宝贵意见和写作经验，使我在研究和写作过程中不致迷失方向。在此，我要再次深深感谢我敬爱地范老师。其次，本论文的完成也离不开其他各位老师、同学和朋友的关心与帮助。在此也要感谢沈钧康主任、龚建平主任等各位老师在论文开题时提出的宝贵意见，并为本课题的实验研究提供了诸多便利的条件。感谢苏州大学附属第二医院影像科各位主任在我学习写报告过程中给予的指点和帮助。感谢磁共振室各位技术员在实验过程中给予的技术支持和指导。感谢师姐潘冬梅、李冬飞给我解惑、感谢师妹胡蓉、倪晓琼、师弟侯金鹏，在科研及学习过程中给予我许多的鼓励和帮助。回想整个论文的写作过程，虽有不易，却让我除却浮躁，经历了思考和启示，也更加深切地体会了其中的精髓和意义，因此倍感珍惜。此外我还要感谢我的父母在我求学生涯中给与我的生活保障，没有他们的辛苦就不会有我求学的机会。同时，还要感谢周闪、张峻围、温茹、卢丽娜、高艳艳、高欣、李誉、张云等同窗好友三年来对我的爱护、包容和帮助，愿友谊长存!要感谢的人实在太多，在此不能全部列出，但我想在此衷心的对你们说一句：谢谢！70 铁氰化锰钾纳米对比剂对大鼠肝脏MR成像T2WI增强效应分析及其病理基础研究致谢最后，衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们！最后向参加我论文评阅和答辩的的各位专家和老师致以崇高的敬意，感谢你们在百忙之中评阅我的论文，参加我的论文答辩，并提出宝贵意见，使我的研究生硕士学业画上一个圆满的句号。徐耀2017年6月于苏州71 苏州大学—（专业学位）苏州大学研究生院统一印制
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