腺病毒介导hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折的实验研究

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中图法分类号：R683学校代码：10661学号：2014534密级：公开硕士学位论文（专业型学位）腺病毒介导hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折的实验研究TheExperimentofRabbitOsteoporoticFractureTreatmentwithAdipose-derivedStemCellsTransfectedbyAdenovirusMediatedhBMP-2姓名：闵巍专业：外科学研究方向：骨、关节损伤与修复导师：安荣泽培养单位：遵义医学院2017年5月 遵义医学院硕士学位论文闵巍遵义医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。及取得的研宄成果学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构己经发表或撰写过的研宄成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均己在学位论文中作了明确的说明并表示了谢。，居、学位论文作者签名：签字日期：年＜月日ｄ遵义医学院学位论文版权使用授权书、：本人完全了解遵义医学院有关保留使用学位论文的规定，即遵义医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内、：，容，可以采用影印缩印或其它复制手段保存学位论文即遵义医学。院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权保密的学位论文在解密后适用本授权书。ｆ＾学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月ｙ日签字日期年月日ｖ＾ 目录1、论文：腺病毒介导hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折的实验研究…………………………………1中英缩略词对照表………………………………………1中文摘要…………………………………………………2英文摘要…………………………………………………4前言………………………………………………………7材料与方法………………………………………………9结果………………………………………………………17讨论………………………………………………………26结论………………………………………………………30参考文献…………………………………………………312、综述…………………………………………………363、致谢…………………………………………………444.作者简介………………………………………………45课题基金来源：贵州省科学技术基金（编号：LKZ【2013】43） 中英文缩略词表缩略词英文全称中文全称AdAdenovirusvector腺病毒载体ADSCsAdiposederivedstemcells脂肪干细胞BMDBonemineraldensity骨矿物质密度BonemarrowmesenchymalBMSCs骨髓间充质干细胞stemcellsCEPCytopathiceffect细胞病变效应DuIbecco’smodifiedeagIe’sDMEM改良杜氏细胞培养基mediumFBSFetalbovineserum胎牛血清FGFFibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子HumanbonemorphogenetichBMP-2人骨形态发生蛋白-2protein-2HRTHormonereplacementtreatment,雌激素代替治疗HEK293Humanembryonickidney293人胚肾细胞293IGFInsulin-likegrowthfactor胰岛素样生长因子MarrowmesenchymalstemMSCs间充质干细胞cellsmRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸MOIMutiplicityofInfection复感指数OPOsteoporosis骨质疏松症OPFOsteoporoticfracture骨质疏松性骨折PDGFPlatelet-derivedgrowthfactor血小板衍生生长因子ReverseTranscription-PolymeraseRT-PCR逆转录聚合酶链反应ChainReactionSVFStromavascularfraction间质血管部分TGF-βTransforminggrowthfactorbeta转化生长因子-βVEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子1 腺病毒介导hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折的实验研究中文摘要目的：利用腺病毒载体将hBMP-2基因转染于ADSCs，并将其局部注入骨质疏松性骨折模型兔的骨折处，观察其对骨折修复的影响。方法：(1)将所获得的新西兰兔颈背部脂肪组织用无酶法分离、提取ADSCs，行传代培养后取P3细胞经流式细胞技术测定CD44、CD49d、CD34、CD106特异性表面抗原。P3细胞行成骨诱导培养后，利用茜红素染色对其成骨分化能力做进一步鉴定。(2)通过HEK293细胞扩增Ad-hBMP-2/GFP。经反复感染、冻融后，收集并纯化病毒液，以MOI100将其接种于ADSCs，培养至6d时置于荧光显微镜下观察转染效率。取转染后培养至第10d的ADSCs行RT-PCR检测hBMP-2mRNA表达，并用免疫荧光法检测不同时间段hBMP-2蛋白的表达情况。(3)取骨质疏松模型兔60只，随机分为转染组（20只）、未转染组（20只）、空白对照组（20只）并人为切断股骨干（深度达横截面1/3），每组兔于骨折术后24h内分别行以下处理：局部注射转染ADSCs；局部注射未经转染的ADSCs；局部注射生理盐水。分别取注射后第2、4、7周的三组模型兔，X线摄片后用半定量评分法对骨折恢复情况进行评分并对骨折处行骨密度检查，所得数据由SPSS20.0软件进行统计分析：3组数据经方差齐性检验，单因素方差分析评价总体差异后，再利用SNK检验对不同组间的数据进行两两比较。结果：(1)将获得的ADSCs置于相差显微镜下观察显示：经培养72h后，可见有呈成纤维细胞样细胞析出并快速增殖，在第6日时铺满瓶底。析出的细胞具有间充质干细胞组织形态学特征。经流式细胞技术检验P3细胞表面特异性抗原，结果表明80%以上细胞表面抗原CD44、CD49d呈阳性反应，CD34、CD106为阴性。茜红素染色检测结果：P3细胞经成骨诱导培养至21d时，显微镜下观察有若干红染钙结节形成，证实获得了较高纯度的ADSCs。2 遵义医学院硕士学位论文闵巍(2)构建完成的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染HEK293细胞，3d后HEK293细胞可出现完全CEP现象。检测腺病毒滴度可达5×108PFU/ml。将纯化后的Ad-hBMP-2/GFP按MOI100感染ADSCs并检测转染效率，6d时GFP表达量达高峰，此时转染率约85%。RT-PCR检测hBMP-2mRNA表达：转染组出现440bp的hBMP-2cDNA片段，未转染组未见hBMP-2cDNA特异性条带显影。免疫组织学检查，hBMP-2基因转染ADSCs后7d，ADSCs胞质中可见明显hBMP-2蛋白表达。(3)各时段3组动物X线评分及骨密度数据方差具有齐次性(P>0.05)，单因素方差分析有显著性差异(P<0.05)。不同时段各组兔X线评分SNK检验结果显示：转染组和未转染组骨折愈合X射线评分较空白对照组高(P<0.05)。转染组骨折愈合X射线评分高于未转染组(P<0.05)。骨折处骨密度数据SNK检验结果提示：局部注射2周后3组骨痂密度均有所增高，但空白对照组明显低于转染组及未转染组（P<0.05），骨密度检测值转染组较未转染组高，差异存在统计学意义（P<0.05）；第4周时，3组骨痂处骨密度均进一步增高，趋势延续第2周（P<0.05）；第7周，转染组骨痂骨密度较另外两组明显降低（P<0.05），空白对照组高于未转染组（P<0.05）。结论：(1)利用无酶法可获得较高纯度ADSCs。(2)Ad-hBMP-2成功转染的ADSCs可明显表达hBMP-2蛋白。(3)hBMP-2转染后的ADSCs局部注射可改善兔骨质疏松性骨折部位的愈合情况。关键词：腺病毒载体；骨形态发生蛋白2；脂肪干细胞；骨质疏松性骨折3 遵义医学院硕士学位论文闵巍TheExperimentofRabbitOsteoporoticFractureTreatmentwithAdipose-derivedStemCellsTransfectedbyAdenovirusMediatedhBMP-2AbstractObjective:ThehBMP-2genewastransfectedintoADSCswithadenovirus,someofwhichwastheninjectedintotheosteoporoticfracturemodelforobservationofitsinfluenceonfracturerecoveryandbonemass.Methods:(1)TheADSCswereisolatedandextractedfromtheadiposetissueofNewZealandRabbitsby"non-enzymaticmethod".Aftersubculture，thethirdgenerationADSCswereselected,thenthespecificsurfaceantigen:CD44,CD49d,CD34andCD106wereanalyzedbyflowcytometry.TheosteogenicdifferentiationabilityofthethirdgenerationADSCswerefurtheridentifiedbyalizarinredstainingafterosteogenicinduction.(2)Therecombinantadenovirusvectors(Ad-hBMP-2/GFP)wereamplifiedbyHEK293cells.Afterrepeatedinfection,freezingandthawingandcollection,ahighconcentrationvirusliquidcouldbeobtained.ThepurifiedrecombinantadenovirusvectorsinfectedthethirdgenerationADSCswithMOI100,thenthetransfectionefficiencywasdetectedbyfluorescencemicroscope.ThesuccessfullytransfectedADSCswereculturedfor10days,andtheexpressionofhBMP-2mRNAwasdetectedbyRT-PCR,theexpressionofhBMP-2proteinintransfectedADSCswasdetectedbyimmunofluorescence.(3)60successfullyestablishedosteoporosisfracturerabbitswereselected,whichwererandomlydividedinto3groups.TheexperimentalgroupwerelocallyinjectedthetransfectedADSCs,inthesameway,the2controlgroupswereinjectednontransfectedADSCsandsalineseparately.Allrabbitsweresacrificed,2,4and7weeksafterinjection,andtheinjectedsiteoffracturewereexaminedbyX-rayanddual-energyx-ray4 遵义医学院硕士学位论文闵巍absorptiometryscans.Objectivetoinvestigatetheeffectoftransfectedadiposederivedstemcellsontherepairofosteoporoticfractures.Results:(1)After72hours'culture,theappearanceoffibroblastlikecellsandtheirrapidproliferationcouldbeobserved.Onthesixthday,thecellscoveredthebottomofthebottle,andtheyhadthemorphologicalcharacteristicsofmesenchymalstemcells.Morethan80%cellswhoessurfaceantigen-CD44andCD49dperformedpositive.Nevertheless,theexpressionofCD34andCD106performednegative.AlizarinredstainingperformedthatanumberofredstainednoduleswereobservedundermicroscopewhentheF3wereculturedtoDay21.TheresultsshowedthatADSCswasobtainedwithhighpurity.(2)Ad-hBMP-2/GFPinfectedtheHEK293cellsbyMOI100,whichcanappearcompletelyCEPphenomenonafter3days.CollectionandlysisoftheinfectedHEK-293cellstoobtaintheamplifiedrecombinantadenovirus.Theadenoviruscanreachahightiter:about5x108PFU/ml.ThepurifiedAd-hBMP-2/GFPwastransfectedintoADSCsbyMOI100andthetransfectionefficiencywasdetected.TheexpressionofGFPreachedthepeakonthe6thday,andthetransfectionratereachedabout85%.TheexpressionofBMP-2mRNAwasdetectedbyRT-PCR.TheBMP-2cDNAfragmentof440bpwasfoundinthetransfectedgroup.NoBMP-2cDNAspecificbandwasobservedintheuntransfectedgroup.Onthe7thdayofImmunohistochemistry,cellsofhBMP-2genetransfectedADSCsweresignificantlyhBMP-2proteinexpression.(3)ThreegroupsofanimalswereexaminedbyX-rayanddual-energyx-rayabsorptiometryscansatweek2,4and7,respectively.ThefracturehealingX-rayscoresofthetransfectedgroupandthenon-transfectedgroupwerehigherthanblankcontrolgroup(P<0.05),andthedifferenceswerestatisticallysignificant.Thescoresofthetransfectedgroupwerehigherthanthoseofthenon-transfectedgroup(P<0.05).Theresultofthecomparisonbetweengroupsateachtimeisalmostthesame.2weeksafterinjection,thecallusdensityofeachgroupincreased,buttheBlankcontrolgroupwassignificantlylowerthantheothertwogroups(P<0.05).Inaddition,thetransfectedgroupishigherthanthenon-transfectedgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Atweek4,5 遵义医学院硕士学位论文闵巍threegroupsofcallusbonemineraldensitywerefurtherincreased,thetrendlastedforthesecondweek(P<0.05).Atweek7,thecallusdensityofthetransfectedgroupwassignificantlylowerthanthatoftheothertwogroups,andtheblankcontrolgroupwashigherthanthenon-transfectedgroup(P<0.05).Conclusion:(1)HighpurityADSCscouldbeextractedbythe"non-enzymaticmethod",.(2)ADSCssuccessfullytransfectedbyhBMP-2gene,whichcouldhighlyexpressBMP-2protein.(3)ADSCstransfectedbyhBMP-2genecouldsignificantlyimprovethehealingofosteoporoticfractureinrabbits.Keywords:Adenovirusvector；Bonemorphogeneticprotein2;Adiposederivedstemcells;Osteoporoticfracture6 遵义医学院硕士学位论文闵巍前言骨质疏松性骨折（Osteoporoticfracture，OPF）是好发于老年人群的骨科常见疾病[1]。基于骨质疏松症（Osteoporosis，OP）所造成的骨强度下降以及全身性的成骨生长因子/激素水平的下调，使得OPF的治疗成为临床工作者亟需解决的难题[2]。目前对OPF的预防及治疗是以抗骨质疏松药物的应用及手术治疗为主，然而抗骨质疏松药物在防治OP或OPF时存在较严重的副作用[3]，例如长期服用双膦酸盐可导致应力性骨折等。OPF的愈合时间通常较骨质量良好的骨折长，尽管各种骨折固定器械应用于治疗OPF，却并不能根本上缩短OPF愈合时间且患者的低骨量易造成骨折固定器械失效[4]。随着骨组织工程领域研究的逐步发展，现今该领域研究已被认为是最能在临床取[5、6][7]得实际效益的研究领域之一。自Zuk等首次报道发现脂肪源性干细胞（Adiposederivedstemcells，ADSCs）以来，其较强的体外扩增能力，稳定的细胞表型，以及简便的获取途径使其广泛的应用于骨组织工程的研究中[8]。在利用ADSCs治疗骨质疏松症的研究里，Cho等[9]将ADSCs沿尾静脉注射入去势小鼠体内，并将结果与接受雌激素治疗及注射PBS的小鼠进行比较，4到8周后，在注射ADSC的小鼠中观察到骨密度值的显著增加。You等[10]发现抑制Zfp467（锌指蛋白467）活性可促进ADSCs对成骨细胞的分化。对静脉注射到去势小鼠中的ADSCs进行RNA干扰以沉默Zfp467基因（si-Zfp467）在输注后的4周，小鼠胫骨的CT分析结果显示在si-Zfp467-ADSC组中骨体积分数，小梁数目和骨密度值恢复到正常水平。该类研究结果使得应用ADSCs治疗骨质疏松症受到关注。骨的再生是一复杂的过程，该过程受到体内有众多生长因子地调控，它们相互协[11、12]同并又发挥不同的作用，其中骨形态发生蛋白家族（Bonemorphogeneticproteins，BMPs）在众多促进成骨的因子中具有极其重要的地位，而该家族中的BMP-2则被认[13、14]为是最为重要的成骨细胞因子。在骨组织工程研究中，腺病毒载体（Adenovirusvector，Ad）是一种被广泛应用的外源基因载体，它的高效转导性、低毒性以及不改[15、16][17]变宿主细胞染色体等优点,使其成为最佳的目的基因载体之一。Sun等利用腺病毒载体介导hBMP-2基因治疗兔下颌骨缺损，研究结果表明，Ad-hBMP-2在转染成功后其hBMP-2基因至少2周可处于较高水平的表达状态，且Ad-hBMP-2治疗组在7 遵义医学院硕士学位论文闵巍任何时间点均比对照组有更多的新骨生成。Cheng[18]等利用Ad-hBMP-2治疗兔桡骨缺损，分别在第2,4,8和12周对桡骨标本进行组织学观察和μ-CT分析，结果显示：Ad-hBMP-2治疗组在第4周时即观察到新骨及桥接骨痂形成，明显早于对照组。同样，在一项利用载有Ad-hBMP-2转染干细胞的β-TCP复合支架治疗大鼠股骨巨大骨缺损的研究中[19]，大鼠模型组织学及X线检查结果显示：治疗6周后，Ad-hBMP-2复合支架治疗组骨缺损处周围牢固骨痂生成率为33%；12周后，骨缺损愈合率达90%，显著高于相同时段对照组的检测结果（P<0.05）。综合以上研究结果，我们发现Ad-hBMP-2转染ADSCs能有效治疗动物模型骨折或骨缺损，但其在治疗OPF方面的研究却鲜有报道。鉴于OPF骨量减少、骨强度下降等病理特点以及传统治疗方式的难度[20]，我们设想可利用hBMP-2基因转染ADSCs来增加OPF局部成骨生长因子的表达水平及局部干细胞含量以达到同时兼顾骨折修复与增强骨骼密度的目的。8 遵义医学院硕士学位论文闵巍1材料与方法1.1主要实验材料3月龄新西兰白兔，体重2.3-2.5kg，雌雄不限，购自广东省实验动物有限公司，许可证号：SCXK（粤）2012-0006。饲养于清洁动物房。腺病毒载体：Ad-hBMP-2/GFP（1.0×109PFU/ml）（北京中杉金桥公司构建并提供），人胚肾细胞293（HEK293）（北京中杉金桥公司提供），兔ADSCs（本实验室冻存）。骨质疏松模型兔60只（由本课题不同实验组造模、提供）；Ad-hBMP-2转染ADSCs（本实验室制备、冻存）。1.2主要实验试剂DMEM培养基（低糖型）Hyclone，美国胎牛血清FBS绿草原，新疆青霉素-链霉素合剂（100X）Hyclone，美国II型胶原酶Sigma，美国β-磷酸甘油Sigma，美国IBMXCyagen美国Anti-rabbitCD44PEBiolegendAnti-rabbitCD49dPEBiolegendAnti-rabbitCD34FITCBiolegendAnti-rabbitCD106FITCBiolegend同型对照抗体BiolegendPBS磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4）索莱宝，北京二甲基亚砜中杉金桥，北京吲哚美辛中杉金桥，北京胰岛素中杉金桥，北京地塞米松sigma美国抗坏血酸sigma美国0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH8.3）元亨，北京9 遵义医学院硕士学位论文闵巍低糖DMEM含10%FBS培养基Hyclone，美国FBS绿草原，新疆胰蛋白酶-EDTA消化液Hyclone，美国10%水合氯醛本实验室配制1.3主要仪器、设备二氧化碳培养箱Thermo，美国高压蒸汽灭菌锅TOMY，日本琼脂糖凝胶电泳仪Biorad，美国超纯水机Millipore，美国台式离心机Thermo，美国倒置显微镜OLYMPUS，日本－80℃低温冰箱SANYO，日本FACSCantoⅡ流式细胞仪Becton-Dickinson，美国InAlyzer动物用双能X线骨密度仪Medikors，韩国X线摄片系统西门子，德国无菌手术器械金环医疗用品公司，上海细胞培养瓶、6孔板、EP管、枪头等Corning公司，美国10 遵义医学院硕士学位论文闵巍2试验方法2.1ADSCs的分离提取、传代与鉴定2.1.1无酶法[21]分离、提取ADSCs3月大新西兰兔，10%水合氯醛以5ml/kg剂量行腹腔注射麻醉，麻醉完成后将兔置于清洁手术台上，颈背部术区经备皮、消毒、铺巾后切开表皮显露皮下脂肪组织，成块取出足量脂肪组织，PBS缓冲液漂洗净存入EP管中-80℃冻存备用。清洗并缝合手术切口、辅料包扎，处理后兔普食喂养。取适量脂肪组织，约20mg，置于无菌玻璃培养皿中，PBS缓冲液充分洗净后置于25cm2培养瓶中，移液枪取100ul预先加热至30℃的FBS滴加于脂肪组织表面，需注意加液后不能让脂肪块浮起离开培养瓶底，之后将脂肪组织置于标准培养箱中孵育24h。青链霉素合剂（100X）按1：100比例，FBS按1:5比例加入100ml低糖DEME中制成联合培养基备用，将孵育完成后的脂肪组织用移液枪吸去表面FBS，以上述联合培养基替代，培养基用量以恰能没过脂肪块表面为可，约5-6ml，后置于培养箱中培养，1次/48h更换培养基，更换培养基时需远离脂肪组织由浅至深轻柔吸取弃用的培养基，以同样方式缓缓加入新培养基。脂肪组织以联合培养基培养后每隔24h置于倒置相差显微镜下观察，见成纤维样细胞出现在脂肪块周围并逐渐融合达到培养瓶底85%左右时取出脂肪块行细胞传代培养：弃去培养基，用PBS轻柔洗净细胞后，加入1ml0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA混合液，轻轻晃动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下消化2-3min，倒置显微镜下观察细胞，见细胞突起收回变圆即可终止消化，如见消化程度不够时可适当延长消化1-2min。轻轻吸取消化液并加入5ml完全培养基终止消化，无菌弯头吸管轻柔并反复吹打消化好的细胞使其脱壁分散，形成细胞悬液，10倍物镜下计数，调整细胞浓度为104/ml后，取1ml细胞悬液分次等量接种于两个培养瓶中，每瓶加入完全培养液至4ml，盖好瓶盖标记清楚后置于标准条件下培养。2.1.2流式细胞技术检测细胞表面抗原：调整P3细胞悬液浓度至106/100ul，步骤同细胞传代培养，取1mlP3细胞悬液两份，分别标记为实验组、对照组。实验组加入荧光标记单克隆抗体CD44PE，对照组加入荧光标记单克隆抗体CD44对照抗体，各20ul，充分混匀，室温下避光孵育30min11 遵义医学院硕士学位论文闵巍后各加入2ml的PBS，1200r/min离心10min，弃去上清液，加入固定液0.5ml（染色缓冲剂）上机检测，软件采集数据。分析阳性细胞比例，CD49d、CD34、CD106表面抗原亦按上述方法检测。2.1.3ADSCs成骨诱导分化茜红素染色取P3细胞接种于6孔板中爬片，每24h换完全培养液一次，待显微镜下观察到细胞融合达80%时，吸去原培养液，替换成骨诱导培养液：低糖DMEM含10%FBS，β-甘油磷酸钠10mmol/l,地塞米松10mmol/l，维生素C50ug/ml，胰岛素6.25mg/ml，维生素D310mmol/L。隔天换液并显微镜下观察诱导情况，经诱导培养后21天时行茜红素染色：弃去原诱导培养基，细胞爬片后由清洗3次，每次5min；4%多聚甲醛浸泡30min，PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH=8.3）37℃，孵育30min；双蒸水洗涤三遍，每遍10s；茜红素分化液洗涤，15s；PBS清洗3次后，显微镜下观察并拍照。2.2Ad-hBMP-2转染兔ADSCs2.2.1重组腺病毒载体扩增将HEK293细胞行传代培养，当传代后细胞融合度达60%时，半量更新培养基，4h后，加入1ml0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA混合液，充分消化后，加入2ml不含FBS的DEME培养基，轻柔吹打制成单细胞悬液，用16×25规格血细胞计数板行细胞计数，测得细胞数约为5.0×107。接种HEK293细胞于新25cm2规格培养瓶中，当细胞融合达60%时，加500ulAd-hBMP-2/GFP，使其均匀覆盖于细胞表面后，置于标准孵育箱中培养，显微镜下观察待HEK293细胞出现完全CEP现象，将细胞混悬液收集至10ml离心管中，经3次重复冻融，镜下见细胞全部裂解后，1000r/min转速离心15min，用0.22um微孔滤膜过滤上清液，按1:10比例加入灭菌甘油后冻存备用。2.2.2检测扩增后Ad-hBMP-2/GFP滴度以每孔104个HEK293细胞共12份接种于96孔板中，各孔均添加200ulDEME培养基，置放标准孵育箱中培养24h。将待测病毒均分为6份接种于另一块96孔板孔中，采用DMEM分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-7、10-8。取出孵育后的HEK293细胞，并编号1-12,其中7-12号为对照，吸弃并更换200ulDMEM培养基，1-6号吸12 遵义医学院硕士学位论文闵巍弃表面培养基并代替加入各稀释度病毒液200ul，加液完成后的置于标准孵育箱中培养48h，取出行显微镜下观察CEP现象，按公式计算待测病毒滴度：PFU/ml=（接种细胞数×病毒稀释倍数×10Ad/cell）/加入病毒体积。2.2.3Ad-hBMP-2/GFP转染ADSCs第3代ADSCs制备成悬液，加入6孔板中，标准孵育箱中培养，当细胞融合度达80%后，吸弃表面培养基并以PBS缓冲液清洗3遍，按MOI100加入病毒液，增加对照（以等量FBS代替），后加入非血清型DMEM/F12200ul，标准孵育箱中孵育2min，完成后加入DMEM/F12含10%FBS2ml继续培养，荧光显微镜下观察并估算转染效率。2.3hBMP-2mRNA及hBMP-2蛋白的表达2.3.1RT-PCR检测hBMP-2mRNA表达选择β-actin为内参，再根据GeneBank中目的基因mRNA序列，引物由北京中杉金桥公司设计并合成：5'-TTGGAGGAGAAACAAGGTG-3’（上游）BMP-2引物序列5'-AACAATGGCATGATTAGTGG-3’（下游）5'-AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA-3’（上游）β-actin引物序列5'-ATGCTGCTTACATGTCTCGAT-3’（下游）总RNA的提取:待测细胞分为转染组、未转染组，两组细胞均按以下方式操作：总RNA提取：向细胞悬液（1×107）中加入1mlTRizol试剂，移液器均匀吹打至澄清后转至EP管，轻摇混匀约10次后室温内静置5min；按总体积比1:5比例加入氯仿，再次摇匀后，置于4℃环境下，12000rpm离心15min；转上层水相后置于1.5ml的EP管中，并加入异丙醇400ul，混匀后室温条件静置约10min，4℃，12000rpm再次离心约10min；吸去上清液，加75%乙醇（DEPC）1ml，4℃，7500rpm离心5min；弃上清液，空气干燥6min，溶于DEPC水中，-60℃条件下冻存。逆转录与琼脂糖凝胶电泳分析：按照Invitro公司的逆转录试剂盒说明书要求操作，取制备好的RNA3ug，浓度10mmol/LdNTP2uL，引物1ul以及DNTP水，混和加入后（总体积：12ul），65℃下反应5min，后置于冰上备用。将5×cDNAbuffer4ul，13 遵义医学院硕士学位论文闵巍0.1mol/LDTT，RNaseOUT40ul，经DEPC处理后的去离子水1ul及逆转录酶15U加入上一步备用溶液（8ul）中，混匀后依次置于50℃及85℃环境下各45sec，5min，最后再加入1ulRNaesH置于37℃环境下20min后，cDNA制备即完成，置于-20℃条件下备用。1g琼脂糖加入100ml电泳缓冲液中，加热至溶解混匀；将冷却至约50℃的上述琼脂糖加入胶板中至冷却凝固，拔出梳子后置于电泳槽中，加入电泳缓冲液覆盖凝胶；cDNA10ul，2ul载样缓冲液，0.25%溴酚蓝混匀后加入点样孔。接通电泳仪电源，电压调至10V/cm，电泳50min。2.3.2hBMP-2蛋白表达免疫荧光检测取转染及未转染ADSCs，分别重悬，两组细胞悬液均按照下述步骤操作后置于荧光倒置显微镜下观察。取6孔板，每孔植入1片预先消毒后的盖玻片，单孔加细胞悬液（约10ml）直至没过盖玻片，标准孵育箱中孵育48h；显微镜下观察单孔细胞覆盖率约达70%时取出盖玻片，足量PBS漂洗3次；室温下4%多聚甲醛固定细胞20min，PBS缓冲液浸洗爬片3次，单次维持3min；取PBS缓冲液配制的0.5%TritonX-100室温下通透20min，PBS缓冲液浸洗3次，单次维持3min。吸净PBS，于盖玻片上滴山羊血清室温下行封闭处理，维持时间约30min；吸除血清，加入经稀释后（1:200）的兔抗人BMP-2单克隆抗体置于湿盒中4℃孵育过夜；PBST缓冲液漂洗爬片3次后吸除漂洗液，在避光处加入稀释后（1:100）的罗丹明染色标记羊抗兔IgG抗体，37℃湿盒中孵育1h；去除二抗后经PBST浸洗3次，200ulDAPI稀释液行核复染，室温下避光孵育5min，PBST清洗4次后封片；2.4Ad-hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折2.4.1骨质疏松骨折模型兔制备本实验所用OP模型兔是由本课题不同实验组提前制备，造模方法如下：取5月龄大雌性新西兰白兔，单只兔体重约2.3-2.5kg，于去势前及去势后24周时分别行腰椎骨密度检测，以去势前所测BMD值为参照，去势后24周BMD值丢失百分率占去势前BMD值的6%-15%为OP兔造模成功[22]。取已制备好的OP模型兔60只，10%水合氯醛以5ml/kg剂量行腹腔注射麻醉，麻醉完成后将兔置于清洁手术台上，左股骨中部靠外侧术区经备皮、消毒、铺巾后切14 遵义医学院硕士学位论文闵巍开表皮、及皮下组织，钝性分离股直肌与股外侧肌肌间隙，从该间隙入路显露股骨干，摆锯垂直于股骨干切入，深度达骨干直径1/3即可，骨折处大小约为5mm×4mm（图1），清洗并逐层缝合手术切口、辅料包扎，普食喂养并每日肌注青霉素80万单位连续3天，隔日以碘伏辅料换药。ABB图1OPF模型制备A：OP兔左后肢备皮消毒；B：OP兔左股骨骨折制备2.4.2动物分组及细胞移植动物造模后随机分为转染组、未转染组及空白对照组，每组20只模型兔，各组动物模型于术后72h时在X光透视下对骨折端定位并作相应体表标记。转染组动物皮肤消毒后，避开手术切口，沿体表标记处进针，当针头触及骨质时延体表标记处附近1cm范围探索，至触及明显凹陷处时向该处注入1×107个/ml浓度的重组ADSCs悬液1ml。未转染组及空白对照组亦按以上方式分别注入等量未转染ADSCs及生理盐水。注射完毕后用无菌棉签以适当力度压迫针孔防止外溢。2.4.3动物模型X线检查各组于细胞移植后第2、4、7周时拍摄左后肢股骨X线片，并采取单盲法由放射科专业人员阅片，对骨折断端骨痂及骨折线以半定量法评分[23]，两项分值之和即为骨折恢复情况评分，具体评分标准见表1。15 遵义医学院硕士学位论文闵巍表1骨折X线半定量评分外骨痂定量分数骨折线定量分数外骨膜无反应0骨折线清晰无变化0外骨膜开始出现反应1骨折线开始变为模糊2外骨痂量较前显著增加2骨折线能见但不清,骨折断段连接较牢4外骨痂变成连续骨桥3骨折线由较高密度骨痂代替6外骨痂轻度吸收4骨髓腔处密度开始减低8外骨痂明显吸收5骨髓腔处密度减低明显10外骨痂几乎彻底吸收6骨髓腔完全再通122.4.4骨折处骨密度检测三组动物于细胞移植后第2、4、7周对骨折处行骨密度值检测。处死动物，分离并取出左侧股骨，生理盐水清洗并除去附着于骨质表面的多余软组织，用无菌纱布包裹后送检，骨折处骨密度数据由深圳帕安诺科技公司收集，骨密度值采用InAlyzer动物用双能X线骨密度仪进行检测。2.4.5数据统计、分析所得数据均以X±S表示，于SPSS20.0软件中行统计分析，数据经方差齐性检验，P>0.05表示方差有齐次性，再采用单因素方差分析比较3组治疗方式是否有差异；P≤0.05为有统计学意义，不同组之间两两比较则采用q检验（Student-Newman-Keuls，SNK）方式进行比较。16 遵义医学院硕士学位论文闵巍3结果3.1脂肪干细胞的提取及鉴定3.1.1无酶法分离、提取兔ADSCs脂肪组织经72h孵育后，可见有少数成纤维样细胞析出并贴壁生长。随培养时间的延长（第4天）及规律换液，显微镜下可见到有更多的细胞析出，细胞形态呈多样ABCDEF图2无酶法提取ADSCs（×200）A：脂肪组织培养24h；B：脂肪组织培养72h；C：脂肪组织培养第4天；D：原代细胞培养第6天；E：P3细胞培养第4天；F：P3细胞培养第7日17 遵义医学院硕士学位论文闵巍化，贴壁生长并逐渐铺开。当培养至第6天时，显微镜下观察见P0细胞达80%融合度，且贴壁细胞形态大小不一，细胞生长迅速呈簇状，且数目明显增多，细胞为长梭形，较密，与成纤维细胞外观相似，细胞多有2～3个突起，核形态扁圆且较大（见图2）。P0代细胞按1:2比例行传代培养，细胞倍增时间为3～5d，1w时融合度可至70%左右。利用无酶分离、提取法，显微镜下未见红细胞、脂肪细胞等杂质细胞，P0～P3代细胞形态未见明显差异。3.1.2流式细胞技术鉴定表面抗原流式细胞技术检测P3细胞特异性表面抗原，结果显示：其中CD44、CD49d呈阳性，M2%Gated分别为：91.83%、96.05%；CD34、CD106阴性，M2%Gated分别为：0.35%、0.56%。结果表明所提取的细胞为纯度较高的ADSCs（详见图3）。ABCD图3ADSCs表面抗原鉴定A：CD44M2阳性峰；B：CD49dM2阳性峰；C：CD34M1阴性对照峰；D：CD106M1阴性对照峰18 遵义医学院硕士学位论文闵巍3.1.3ADSCs成骨特性检测P0细胞经传代后，取融合度达80%的P3细胞行成骨诱导培养，诱导至第3d时，细胞形态增大、稍圆，整体依然呈梭形；1周后，细胞形态由梭形变为不规则,显微镜下观察可见细胞胞质中颗粒物质增多；2周后观察见，细胞胞质内颗粒物进一步增多；3周后钙结节大量形成，行茜红素染色后观察显示清晰（见图4）。AAABB••CC•••图4P3代细胞成骨诱导及茜红素染色A成骨诱导1w（×400）；B成骨诱导2w（×100）；C成骨诱导3w（×100）3.2Ad-hBMP-2/GFP转染兔ADSCs3.2.1载有目的基因腺病毒载体的扩增培养HEK293细胞达到60％单层融合后感染Ad-hBMP-2/GFP。倒置显微镜下观察可见：24h后观察，些许细胞变圆，细胞间空隙增加。48h后，约半量细胞变圆，变圆的细胞漂起并聚集成团块状。72h后，更多量的细胞成圆形并漂起，以葡萄串状聚合，其中可见少量细胞裂解所形成的碎片(图5)。19B 遵义医学院硕士学位论文闵巍3.2.2扩增后Ad-hBMP-2/GFP滴度检测将HEK293细胞按每孔104的密度接种腺病毒后，孵育至约40h时,观察到在10-2、10-3稀释度的样本中出现完全CPE现象:90%细胞变圆,60%细胞浮起。按公式：PFU/ml=（接种细胞数×病毒稀释倍数×10Ad/cell）/加入病毒体积，计算扩增所得腺病毒的滴度约为5×108PFU/ml。3.2.3Ad-hBMP-2/GFP转染ADSCs效率荧光显微镜下观察见感染后的ADSCs显绿色荧光，各个细胞荧光强弱不等。转染后培养24h可见少量的绿色荧光，培养72h时，细胞荧光效果增强。6d后，转染率达85%左右(图6)。未感染病毒的ADSCs荧光显微镜下未见明显绿色荧光。ABB图5HEK293感染Ad-hBMP-2/GFP后培养各时段情况（×200）A：24hB：72h3.3hBMP-2mRNA及hBMP-2蛋白的表达3.3.1RT-PCR检测hBMP-2mRNA表达琼脂糖凝胶电泳检测显示：ADSCs成功转染后10d，转染组于440bp处出现特异性条带，即表示hBMP-2mRNA的表达呈阳性。未转染组于该处未见明显特异性条带显影，即hBMP-2mRNA表达阴性（图7）。20 遵义医学院硕士学位论文闵巍AB图6Ad-hBMP-2/GFP转染ADSCs转染效率（200倍）A：转染后72hB：转染后6d3.3.2hBMP-2蛋白表达免疫荧光检测免疫荧光检测hBMP-2蛋白表达结果：转染组培养至5d后镜下观察见细胞胞浆荧光显色浅，7d和12d时该组细胞胞浆内均可观察到丰富的荧光显色，且荧光显影情况与培养时间呈正相关性，未转染组未见明显荧光显影。以上结果说明hBMP-2蛋白于Ad-hBMP-2转染成功后的ADSCs中呈较高表达状态（见图8）500bp400bp200bp100bp1234图7RT-PCR检测hBMP-2mRNA表达1：marker，2：转染组，3：未转染组，4：β-actin21 遵义医学院硕士学位论文闵巍ABCD图8hBMP-2蛋白于ADSCs中的表达情况（×200）A：ADSCs转染后7dB：空白对照组7dC：ADSCs转染后12dD：空白对照组12d3.4Ad-hBMP-2转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折效果3.4.1骨质疏松骨折造模后大体观察造模后各组兔模型均未死亡。建模完成后初期（1-3天内），喂养过程中三组兔均表现出：精神欠佳，活动量、进食量减少，手术切口处稍红肿，渗出少量新鲜血液，无明显感染征象。7天时，部分兔开始尝试活动，左后肢跛行明显，运动量及进食量较前增加。喂养7-14天，各组动物精神逐渐恢复，进食量增加较明显，左后肢跛行依旧较重，局部伤口未见明显炎症反应及免疫排斥反应表现，组间无明显差异。3.4.2动物模型X线检查及评分细胞移植2周后3组动物X光检查结果：转染组左股骨骨折处周围见明显骨痂生长，骨折间隙处可见稍高密度显影；未转染组骨折处同样见外骨痂生长，骨痂密度显影较转染组浅，骨折线变模糊；空白对照组骨折端未见明显骨痂，可见清晰骨折线22 遵义医学院硕士学位论文闵巍（见图9）。X线半定量评分：各组方差具有齐次性（P>0.05），单因素方差分析差异具有统计学意义（P<0.05）转染组（3.20±0.69）与未转染组（1.80±0.89）的评分较空白对照组（0.60±0.28）高，组间两两比较差异具有统计学意义（P<0.05）。ABC图9局部注射2w后X线检查A：转染组；B：未转染组；C：空白对照组细胞移植第4周，转染组较多的外骨痂包裹骨折断端，骨折缝隙间有高密度的骨痂填充，骨折线不清；未转染组见外骨痂，骨折断端处出现高密度影；空白对照组仅观察到少量外骨痂，骨折间隙处骨密度开始增高（见图10）。X线评分：各组方差AAAAABC图10局部注射4w后X线检查A：转染组；B：未转染组；C：空白对照组23 遵义医学院硕士学位论文闵巍具有齐次性（P>0.05），单因素方差分析差异具有统计学意义（P<0.05）转染组（6.40±1.14）高于未转染组（3.20±0.64）而空白对照组（2.00±0.92）低于其他两组，组间差异有统计学意义（P<0.05）。ABBBBBBBC图11局部注射7w后X线检查A：转染组；B：未转染组；C：空白对照组第7周时，转染组外骨痂已明显吸收，骨折线消失；未转染组有一定量外骨痂，大部分骨折端呈较牢固的连接迹象，骨折线模糊；空白对照组，出现较多的外骨痂，部分骨折线呈较牢固的连接迹象（图11）。各组方差齐，单因素方差分析存在差异（P<0.05）及转染组评分（14.25±1.65）高于未转染组（12.90±0.85），前两组高于空白对照组（5.70±1.34），P<0.05。（见表2）。表2经注射治疗后骨折各个时间段愈合情况X线评分组别2周4周7周＃※A＃※＃※转染ADSCs组3.20±0.696.40±1.1414.25±1.65※※※未转染ADSCs组1.80±0.893.20±0.6412.90±0.85空白对照组0.60±0.282.00±0.925.70±1.34注：＃转染组与未转染组对比，P<0.05；※转染组、未转染组分别与空白对照组对比，P<0.0524 遵义医学院硕士学位论文闵巍3.4.3骨密度仪检测骨痂密度细胞移植2周后，转染组及未转染组骨折处骨密度值分别为：0.431±0.062g/cm2，0.312±0.071g/cm2，转染组高于未转染组，空白对照组为0.209±0.051g/cm2，较前两组低，各组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）；第4周三组骨折处骨密度均进一步增高，组间两两比较，趋势延续第2周（P<0.05）；第7周转染组骨痂骨密度（0.354±0.054g/cm2）较另外两组明显降低（P<0.05），空白对照组高于未转染组（0.487±0.043g/cm2VS0.452±0.087g/cm2），P<0.05（见表3）。表3经注射治疗后骨折各个时间段骨痂密度检测情况组别2周4周7周＃※＃※＃※转染ADSCs组0.431±0.0620.578±0.0910.354±0.054※※※未转染ADSCs组0.312±0.0710.411±0.0860.452±0.087空白对照组0.209±0.0510.321±0.0750.487±0.043注：骨密度测量值单位：g/cm2；＃转染组与未转染组对比，P<0.05；※转染组、未转染组分别与空白对照组对比，P<0.0525 遵义医学院硕士学位论文闵巍4讨论OP患者的骨骼强度下降，在无创伤或受到轻到中度创伤情况下即可引起骨折。OPF的修复是一个缓慢的过程，需同时兼顾骨折修复与骨骼质量的提高才能使骨骼恢复应有的机械强度。本课题中我们设想利用hBMP-2基因转染ADSCs以增加OPF局部成骨生长因子的表达水平及局部干细胞含量从而达到兼顾骨折修复与增强骨骼密度的目的。4.1ADSCs的特性及提取方法类似于其他组织来源的间充质干细胞如：骨髓，脐带血等，在脂肪组织的基质中[24、25]也含有能够分化成骨细胞和成软骨细胞的间充质干细胞，这种脂肪源性干细胞是一种具有高度增殖能力的成纤维样细胞，其多向分化性使得它们在组织再生或修复[26、27、28]的相关研究当中备受青睐。根据国际细胞治疗学会组织干细胞委员会规定，间充质干细胞应具备：贴壁生长及多向分化性，并且能表达间充质细胞特异性表面抗体，而不表达造血干细胞和内皮细胞表面标志物的特性[29]。ADSCs除能贴壁生长和多向分化性外，其表面还特征性地表达CD44和CD49d，而不表达CD34、CD106[30]。相较于其他类型的干细胞，其优势见于皮下脂肪组织为提取间充质干细胞提供了丰富的来源，并且容易获取。这也是本实验选择ADSCs作为基因治疗种子细胞的原因。目前，酶消化法是一种广泛使用的ADSCs提取法，该方法通过吸脂术或手术切取的方式获得脂肪组织，并将其经组织胶原酶消化、离心、洗涤以去除分化成熟的脂肪细胞，收集到的剩余间质血管部分（Stromavascularfraction，SVF）再经氯化铵溶解，尼龙网过滤等步骤后，方可对获取的细胞行扩增、鉴定[31]。该方法提取干细胞的过程较为繁复费时，且非目的细胞时常混入降低了ADSCs的纯度并影响干细胞的增殖和分化。此外，使用酶消化法提取ADSCs时，培养基受到污染导致培养细胞死亡的事件亦并不少见[32]。在实验研究中如实验动物需制备为癌症或其他慢性病模型时，往往由于慢性消耗及恶病质体质导致体脂含量降低，酶消化法经常容易导致SVF中ADSCs流失影响实验效果[33]。本实验中所选择的“无酶”法是得到组织干细胞委员会认可并推荐的一种新的ADSCs提取方法[34]，利用该方法所获得的细胞经显微镜下形态观察可见：脂肪组织经72h孵育后，有少数成纤维样细胞析出并贴壁生长，培养至第6天时，P0细胞达80%融合度，未见红细胞、脂肪细胞等杂质细胞。P3细胞26 遵义医学院硕士学位论文闵巍行表面特异性抗原检测：表达CD44、CD49d的细胞比例分别为：91.83%、96.05%，而几乎不表达CD34及CD106，成骨诱导培养至21d时，茜红素染色可见大量钙结节形成。本实验所提取的细胞特征与ADSCs特征吻合且符合上述干细胞标准，证明无酶法能以快速，相对简便的方式分离出脂肪间充质干细胞。从游离脂肪块中析出的干细胞具有很高的同质性，杂质细胞少这也降低了ADSCs纯化的难度。4.2hBMP-2基因转染ADSCs骨质疏松性骨折基因治疗的目的主要在于促进骨骼的再生与骨质质量的提高，兼顾这两方面才能获得较好的治疗效果[35]。自体移植BMP-2基因转染的干细胞在脊柱[36、37]椎体融合中的优势已得到验证，尽管这些前瞻性或回顾性研究的结果或许会受到样本量及证据等级的限制，但却为我们的研究提供了理论支持。通常，将目的基因传递到种子细胞中可以通过病毒和非病毒载体实现[38]。非病毒载体在组织工程研究中通常用于外源基因的过表达，这种载体受限于持续表达周期短，低转染率等因素[39]。HIV慢病毒载体是一种应用广泛的病毒载体，该载体可将目的基因并入宿主细胞基因组中从而使宿主基因组发生改变，这样可能潜在地影响位于染色体上插入位点或其附近位置的基因的功能[40]。相比而言，腺病毒的一些天然特性使其成为更具吸引力的基因载体，在本研究中使用的基因治疗载体是复制缺陷型腺病毒载体即：第一代腺病毒。转染后的腺病毒通常不会整合到宿主基因组中，它们虽然以异物形式留在细胞核中，但会随细胞分裂逐渐退化[41]。尽管实验所用的腺病毒载体已被去掉复制所必需的基因，但它们仍然含有大部分病毒基因组，包括编码外壳蛋白的基因，因此受感染的细胞会分泌病毒蛋白并引发免疫反应，最终导致受到机体的清除。由于细胞分裂退化及免疫排斥等原因，目的基因通常在体内表达较短，有报道表明[42]：干细胞经Ad-BMP-2转染成功后，其在体内表达的持续时间少于2周，这样短时间的表达有利的一面在于：防止骨形成超过所需的程度，而相反的一面则是达不到治疗的预期效果。本实验中我们以Ad-hBMP-2/GFP转染ADSCs，于荧光显微镜下观察到：在感染6d时，Ad-hBMP-2转染率达85%左右，且感染后的ADSCs未见大量裂解凋亡。在行局部移植第2、4周时，转染组骨痂处骨密度值分别为0.431±0.062g/cm2及0.579±0.091g/cm2，呈增加趋势，未见成骨停滞的现象。X线检查未见过量或异位成骨发生。本实验结果中，转染组外骨痂生长时间大于2周且骨痂27 遵义医学院硕士学位论文闵巍密度高于未转染组与空白对照组，这可能是由于Ad-hBMP-2随ADSCs退化前已分泌足量hBMP-2蛋白，使得诱导成骨的信号通路持续激活，从而促进成骨。迄今已鉴定和表征的BMP基因家族成员约20个[43]。BMPs诱导异位软骨和骨形成的过程类似胚胎软骨内骨的形成[44]。具有诱导成骨能力的BMPs有BMP-2，-4，-5，-6，-7和-9[45]。有研究发现[46]，BMP-2基因在骨骼及广泛的骨外组织发育方面具有重要的意义。在骨形成中，BMP-2信号经以异二聚体形式存在的I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合而转导,激活已易位至细胞核的Smads复合物而调节靶基因[47]。BMP-2与其受体经Smads相互作用正性调节Cbfα1[48]。BMP-2诱导信号受R-Smads(Smad1、Smad5、Smad8)和Co-Smads(Smad4)调节，R-Smad-Co-Smads复合物与靶基因特异性增强序列相互作用并激活基因表达[49]。鉴于BMP-2基因在成骨诱导方面的重要地位，本实验选择其为目的基因并成功建立转染hBMP-2的兔ADSCs细胞模型，免疫荧光检测第7、12天ADSCs的hBMP-2蛋白表达，结果显示：转染后的ADSCs于第7天时胞质内异染颜色开始逐步增加，到第12天时胞质内的荧光异染颜色已达到富集。本实验中我们将感染6d后的ADSCs按1×107个剂量注射入转染组动物模型骨折处，结果提示：注射2周后的转染组外骨痂骨密度增加趋势与hBMP-2蛋白表达时间相吻合，外骨痂骨密度值增加稍迟于转染后ADSCs的hBMP-2蛋白的表达。相较于空白对照组，我们可以推测转染组OPF修复与hBMP-2表达的量呈正相关。4.3hBMP-2转染ADSCs对兔骨质疏松性骨折的影响基因增强干细胞促进骨再生及修复是目前组织工程应用的前沿，通过查阅文献我们得知，ADSCs作为基因工程细胞已用于治疗动物模型OP的实验中，陶晖[50]等利用细胞归巢原理将ADSCs沿OP小鼠尾静脉注入其体内，并以注射PBS作为对照干预措施，对比结果显示：ADSCs注射组小鼠OP恢复情况优于对照组。参照该类研究结果我们可以推断出ADSCs可以改善动物OP。然而，近年来骨组织工程的研究更d多的则是利用目的基因转染干细胞来治疗动物骨折或骨缺损，例如汪明星[51]等将hBMP-2转染后的ADSCs制作成干细胞明胶海绵复合体来修复兔桡骨巨大骨缺损。尽管该类研究的结果良好，但应用于治疗OPF的研究却十分少见，赵铭[52]等构建了hBMP-2质粒载体并使其转染ADSCs以治疗大鼠OP骨缺损，在基因载体选择方面，28 遵义医学院硕士学位论文闵巍较之于质粒载体，本实验选取了腺病毒作为目的基因载体，主要原因在于前者转染效率较低且转染成功后目的基因表达时间短，对本实验结果存在一定影响[53]。基于以上原因，本实验选择利用Ad-hBMP-2转染ADSCs注射于兔OPF模型，并以注射未修饰ADSCs及生理盐水的OPF模型兔为对照，结果显示：注射后的第2、4、7周，转染组与未转染组的X线评分均较空白对照组高，且转染组高于未转染组（P<0.05），外骨痂骨密度检测转染组从骨痂形成到塑形的时间段较其余两组短（P<0.05），根据该组间比较结果我们可以推测：Ad-hBMP-2转染后的ADSCs具有修复兔OPF的能力，且较优于其余两种干预措施。4.4结语与展望利用干细胞移植的方式来治疗骨、关节损伤相关疾病的研究有从动物实验逐步向临床试验过渡的趋势，然而有研究表明[54]：利用自体间充质干细胞移植的方式治疗膝关节软骨缺损，在长期随访过程中提示有肿瘤形成的可能。该研究表明干细胞移植应用于临床仍存在一定隐忧。然而随着骨组织工程领域的研究不断深入及探索范围的不断拓展，大量的理论基础与数据使我们相信组织工程细胞在治疗骨、关节损伤方面依然有很好的前景。在本实验中我们选择基因增强组织工程细胞治疗动物模型骨质疏松性骨折，不仅因为该治疗方式在骨质疏松性骨折研究方面鲜有报道，更注重该治疗方式的巨大潜力及临床治疗骨质疏松性骨折的难度，尝试将两者相结合，我们希望能为骨质疏松性骨折的治疗提供一种新思路。29 遵义医学院硕士学位论文闵巍5结论(1)利用“无酶”法可获得纯度较高的ADSCs。(2)Ad-hBMP-2成功转染的ADSCs可较很好地表达hBMP-2蛋白。(3)hBMP-2转染后的ADSCs有较好的成骨潜能，经局部移植于骨折处后能改善兔骨质疏松性骨折的愈合情况。30 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遵义医学院硕士学位论文闵巍综述多能干细胞治疗骨质疏松症的研究进展摘要干细胞在组织再生中的应用对各医学研究领域，包括骨骼疾病，都产生了巨大的影响。干细胞或基因转染干细胞可能以分泌生长因子及成骨分化的形式来恢复骨质强度并潜在性地降低骨质疏松症易感性。背景骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种系统性骨骼疾病，其特征在于骨量降低和骨组织的微结构退化[1]。干细胞治疗骨质疏松症的目的主要是降低骨折的发病率，尤其是在脊柱，髋部和腕部等骨折好发部位[2]。当骨质疏松相关骨折发生时（Osteoporoticfracture，OPF），刺激并加速骨折愈合将产生巨大的健康及经济益处[3]。如何有效治疗OP、减少OPF的发病率以及在OPF发生时如何加快骨折愈合，增强骨折断端间的骨质联合在骨科领域中依然是研究的热点[4]。在健康个体中，成骨细胞祖细胞即间充质干细胞（Marrowmesenchymalstem[5]cells，MSCs）在骨髓中以非常低的速率（0.01％-0.001％）发生。在老年群体中，[6]MSCs的数量进一步减少，从而导致骨形成显著减少，最终导致OP发生。虽然双膦酸盐等抗骨吸收药物能有效降低OPF的发病风险，但临床上将其作为干预因素治疗OP时常存在一定严重并发症的发病风险（如颌骨坏死等）。通过从骨髓，脂肪和脐带血等组织中获得并引入外源性MSCs或通过内源性干细胞募集的方式来治疗OP是一种创新的方法，且正在被各国学者不断地研究中，为此本文将对MSCs治疗OP方面作一简要综述。细胞修复骨折的方式至今各国学者为发现并鉴定骨折处分化为骨痂组织的前体细胞及其来源已付出了相当大的努力，然而在关于骨折愈合组织发育所需的细胞是来源于循环系统还是衍生自驻留在骨膜和骨髓中的细胞这一问题上依然存在争议。36 遵义医学院硕士学位论文闵巍[7]Meyers等人的研究支持间充质干细胞是由循环系统归巢到有CXCR4表达的骨[8]折部位，并且这些细胞有助于骨折愈合这一观点。然而，Colnot等人的研究结果表明骨折处骨痂组织的成骨能力起源于骨折局部并且支持骨膜作为骨折处骨痂中骨和软骨形成的细胞的主要来源。经证实骨内膜与外骨膜中均存在具有成骨或成软骨潜能的细胞群，这些证据表明骨形成潜力是局部起源的，而部分非骨膜来源的细胞群也是骨折修复所必需的，最值得注意的是来自造血系统的炎症细胞和破骨细胞，它们是通[9、10]过骨髓或重组的骨膜循环到达骨折部位的。尽管该研究结论或许并不支持利用多能干细胞作为修复骨组织的细胞经循环系统到达骨折部位并对其进行修复的理论，但进一步的认识调控细胞向骨折部位靶向转移的分子机制及多能干细胞功能的缺陷是基于干细胞治疗OP方式的关键。不同来源的MSCs在OP模型上的应用近年来，骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells，BMSCs）在治疗骨质疏松症的实验研究上得到了广泛的应用。Wang等人[11]将BMSCs嵌入藻酸钙凝胶内，并将其注射到去势大兔远端股骨。8周后，结果显示治疗组大兔的股骨远端骨附着、小梁厚度和总体骨骼硬度较对照组增加。Ocarino等[12]将BMSCs注射入去势大鼠的骨髓空腔中，2个月后，实验组大鼠骨髓空腔部位的骨小梁密度达到正常大鼠水平。Tang等[13]在其实验研究中表明：将用hBMP-2转染后的BMSCs植入珊瑚羟基磷灰石支架并填入去势大鼠的下颌骨骨缺损处，8周后，在骨质修复效果上转染组较对照组良好。值的注意的是，由于原发性骨质疏松性骨折是一种全身性疾病，单一地治疗骨折只能缓解骨折处局部的症状。为了能够在更大范围内治疗骨质疏松症，组织工程细胞通过静脉注射后达到适当的需要修复的部位并进行成骨修复是更加理想的治疗方式。Hsiao等[14]通过静脉注射的方式将用GFP标记的BMSCs注入去势小鼠体内，两个月后，观察到荧光标记的BMSCs归巢到骨髓并有较高密度的小梁骨形成。然而有研究指出，BMSCs在静脉输注后不会自动植入相关部位并成骨分化。这个缺陷促使研究者对BMSCs进行基因改造以便改善归巢效果。Lien等[15]对糖皮质激素诱导的骨质疏松的小鼠模型行静脉注射MSC样细胞（C3H10T1/2），这些MSC样细胞是经转染37 遵义医学院硕士学位论文闵巍并共表达骨髓归巢和成骨分化的CXCR-4和Cbfa-1基因的细胞，注射一个月后，观察到模型小鼠的股骨骨密度的显着增加，骨强度和刚度完全恢复。Kim等[16]将经RANK-Fc基因（通过与RANK相互作用抑制破骨细胞形成和存活的融合蛋白）转染后的BMSCs行腹腔内注射进入去势小鼠体内，4和8周后，与仅接受PBS注射的小鼠相比，注入表达RANK-Fc的MSC的组中观察到BMD的显着增加。相同的动物模型静脉注射入RANK-Fc和CXCR4（参与MSC运输，归巢和植入骨髓的受体基因）共转染的BMSCs，4周后，与仅注射RANK-Fc转染的BMSCs小鼠相比，共表达BMSCs组的小鼠BMD显着增加。脂肪来源的间充质干细胞（Adipose-derivedmesenchymalstemcells，ADSCs）与BMSCs相比更易分离并且产生更大，这使其亦被广泛地应用于骨科实验研究中。例如，Cho等[17]人将ADSCs沿尾静脉注射入去势小鼠体内，并将结果与接受雌激素治疗及注射PBS的小鼠进行比较，4到8周后，在注射ADSC的小鼠中观察到BMD的显著增加。由于骨质疏松症中的骨丢失与MSCs向脂肪细胞（而不是成骨细胞）的分化增加相关。You等[18]发现抑制Zfp467（锌指蛋白467）活性可促进ADSCs对成骨细胞的分化。对静脉移注射到去势小鼠中的ADSCs进行RNA干扰以沉默Zfp467基因（si-Zfp467）在输注后的4周，小鼠胫骨的CT分析结果显示在si-Zfp467-ADSC组中骨体积分数，小梁数目和BMD恢复到正常水平。ADSCs的高可用性，安全性使它们成为基于干细胞治疗方式的具有吸引力的干细胞来源，而今各国学者已开始尝试确定从不同年龄段小鼠脂肪组织中分离的ADSC的功能[19]。从骨质疏松小鼠体内分离出的ADSCs在体外评估显示其增殖和成骨分化能力受年龄因素的影响很小。相反，有不同的研究报道表示[20]：从老年鼠中提取的ADSCs，其增殖率和成骨分化的潜力明显下降。这一结论是通过向骨质疏松模型小鼠行骨髓移植得到证实的，当然向骨髓中移植的ADSCs是取材于不同年龄段的小鼠，结果显示，接受年轻ADSCs的骨质疏松小鼠比接受老化ADSCs的，其BMD显着增高。内源性干细胞募集治疗OP除了直接使用干细胞治疗OP外，一些学者则采用了多种小分子药物引发内源性干细胞募集于骨质疏松部位的治疗方式。当以间歇方式给予甲状旁腺激素（Parathyroidhormone，PTH）时，其可在早期诱导骨形成。早在1994年，Nishida等38 遵义医学院硕士学位论文闵巍[21]就已证明给予PTH治疗1周之内，其功效是刺激骨髓中的干细胞向成骨细胞增殖和分化。Chambers等人[22]通过体外和体内实验来证明PTH可促进内源性BMSCs向小梁骨表面粘附，且该反应可于PTH干预后的第2个小时开始。除了PTH，Mukherjee等[23]研究发现低剂量的硼替佐米可通过Runx-2信号通路在小鼠体内诱导MSCs向成骨细胞分化。另一种被提出具有控制MSCs分化的小分子物质是催产素，有研究表明其在维持骨稳态上起关键作用，特别是在骨质疏松患者中。基因治疗中的目的基因载体病毒载体：因为病毒载体有几个显着的优点，使得它们成为迄今为止研究最广泛的基因治疗载体。病毒载体具有将其DNA转导到多种细胞中的能力。它们相对容易获取且生产成本较低。用于体内骨折修复基因治疗的两种主要类型的病毒载体是腺病[24-26]毒和逆转录病毒腺病毒载体是一种双链DNA病毒载体，以它作为载体转导目的基因通常不会影响宿主细胞的原有基因组，但其会保留在宿主染色体外。以腺病毒为载体可向多种细胞（处于细胞分裂不同时期的细胞）转染目的基因，且转染后的宿主细胞能较快速的表达目的基因。由于这种载体并不整合入基因组DNA所以其仅提供短暂地基因表达，[27、28]所以当以它作为目的基因载体时，通常选择直接注入骨折部位的方式进行试验。当直接注射在骨折部位时，腺病毒介导的BMP-2，BMP-4和BMP-6基因均被报道有[29]刺激骨形成的能力。但亦有报道称：在一些模型中，腺病毒介导的BMP基因使骨折延迟愈合，或加速骨折愈合的同时时常伴随着肌肉中的异位骨形成，然而这并不是我们所期望的。运用腺病毒载体在一些临床试验结果中表明该载体能刺激免疫应答，并且这个特征阻碍了修复过程。因此，腺病毒载体于临床中用以加速骨折修复，还需要更进一步的研究来证实其安全性。腺相关载体（Adeno-associatedvectors，AAV）是单链DNA病毒载体，其转染特性与腺病毒载体相似。但由于其病毒扩增速度较快，较小的转基因携带能力限制了该载体用于基因治疗的用途。然而，AAV已成功并入基因活化基质（GeneActivatedMatrices，GAMs）中以降低其免疫原性并且有效地将目的基因传递至骨缺损处。载39 遵义医学院硕士学位论文闵巍有由AAV介导转染细胞的GAM（胶原植入物）能有效帮助同种异体移植物的重塑[25]及骨替换。逆转录病毒是RNA病毒，因此为了复制，它们必须整合到宿主DNA中。逆转录病毒被在骨科研究领域一直被重视，因为它们具有转导成骨细胞，骨髓基质细胞，软骨细胞和肌肉干细胞的能力。逆转录病毒以高效率转导各种细胞;它们是高度稳定的;它们具有大的转基因能力（即，大于8kb的基因组信息可以整合到其中），容易构建，不引起免疫应答，并且由于整合入宿主DNA中，而使目的基因的表达稳健[30]且持久。然而，该载体存在插入诱变的风险。虽然逆转录病毒只能感染分裂细胞，但这种缺点可以使它们成为在伤口修复期间表达转基因的有效载体。非病毒载体：腺病毒，AAV，逆转录病毒和基于慢病毒的基因载体已经证明在骨折修复中是有效的，但是在临床试验中使用这些治疗剂所固有的安全性问题尚未解[31]决，基因治疗的当前焦点是非病毒质粒载体的开发。其受到重视的原因如下：首先，质粒载体不插入导入细胞的基因组中，且没有插入诱变的风险。其次，非病毒质粒载体为非免疫原性的，它引起宿主免疫反应的风险最小。最后，现在正在开发具有特定表达时间和具有细胞特异性（即，它们将仅在限制性靶细胞群中表达，即使转染到组织中）的质粒。非病毒载体例如质粒和线性DNA具有为基因治疗提供更加安全形式的潜力，但是它们尚未被优化到能提供达治疗水平的基因表达，至少在除肌肉之外的组织中。结语综合上文阐述，基于干细胞治疗OP的方法，其尚需攻克难点主要是：静脉注射干细胞后其靶向定位于骨质疏松部位的分子机制。另外未来的研究或许将集中在干细胞在期望的骨部位的长期植入和分化。多能干细胞（或基因工程细胞）对骨髓脂肪形成的特异性抑制和促进成骨细胞生成的能力，使其可以成为用于治疗骨质减少疾病及相关骨折的较为有前景的治疗工具。40 遵义医学院硕士学位论文闵巍参考文献[1].LingX,CummingsSR,etal.VertebralfracturesinBeijing,China:theBeijingOsteoporosisProject.[J]BoneMinerRes,2010,15:2019–2025.[2]GoldhahnJ,SuhmN,GoldhahnS,BlauthM,HansonB,etal.Influenceofosteoporosisonfracturefixation:asystemicliteraturereview[J].OsteoporosInt2014,19:761-772.[3]LingX,CummingsSR,etal.VertebralfracturesinBeijing,China:theBeijingOsteoporosisProject.[J]BoneMinerRes,2010,15:2019–2025.[4]BrauerCA,Coca-PerraillonM,etal.IncidenceandmortalityofhipfracturesintheUnitedStates.[J]JAMA,2009,302:1573–1579.[5].BetzOB,BetzVM,SchroderC,etal.Repairoflargesegmentalbonedefects:BMP-2geneactivatedmusclegraftsvs.autologousbonegrafting[J].BMCBiotechnol.2013.13(1):1-9[6].BenA,GadiP,DanG.StemCellTherapyforOsteoporosis[J].CurrOsteoporosRep.2014.12,41-47.[7]MyersTJ,GraneroM,LongobardiL,etal.Mesenchymalstemcellsattheintersectionofcellandgenetherapy[J].ExpertOpinBiolTher.2010.12,1663-1679.[8]ColnotC,HuangS,HelmsJA.Analyzingthecellularcontributionofbonemarrowtofracturehealingusingbonemarrowtransplantationinmice[J].BiochemBiophysResCommun.2006.350,557-561.[9].YuYY,LieuS,LuC.etal.Bonemorphogeneticprotein2stimulatesendochondralossificationbyregulatingperiostealcellfateduringbonerepair[J].Bone.2010,47(1):65-73.[10]TobenD,SchroederI,KhassawnaEl,etal.Fracturehealingisacceleratedintheabsenceoftheadaptiveimmunesystem[J].BoneMinerRes.2010,47(1):113–124.[11]WangZ,GohJ,DasDS,etal.Efficacyofbonemarrow-derivedstemcellsinstrengtheningosteoporoticboneinarabbitmodel[J].TissueEng.2006,12(7):1753-176141 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遵义医学院硕士学位论文闵巍致谢在遵义医学院研究生学习阶段，是辛苦、充实的三年，也是收获最多的三年。只言片语难以表达我对恩师，对父母，对同学以及老师的感激之情。首先感谢我的导师安荣泽教授这三年来对我的谆谆教导，他渊博的学识、严谨的治学态度、一丝不苟的工作作风，诲人不倦的育人态度，事实就是的道德品格，以及对科学研究的敏感性将成为我终生学习的好榜样！感谢我的恩师安荣泽教授三年来在学习、工作和生活方面所给予我的帮助，不管我将来身在何处，对恩师的感激之情我会永远铭记在心。感谢李松军主任，他在我课题的研究过程中给予的非常多的建议及教导，谨在此表示衷心感谢。其次，感谢遵医五院各位老师、师兄师姐们在我实习期间给予我的巨大帮助。最后，特别感谢家人对我的支持、理解与关心，感谢我的朋友、同学们对我的帮助。44 遵义医学院硕士学位论文闵巍作者简介姓名：闵巍性别：男出生日期：1988.07.07籍贯：四川省最后学历（学位）：硕士毕业院校：遵义医学院工作经历：2015年2月至今在遵义医学院第五附属（珠海）医院实习在学期间参加的研究项目：腺病毒介导hBMP-2基因转染ADSCs治疗兔骨质疏松性骨折的实验研究。发表论文、著作、申请专利*序号论文题目期刊名称期刊级别年、卷、期、页本人排名1《TheeffectsofBiomedicalSCI2017年第28卷第1/6properativesmokingResearch3期：970-975cessationonthehealingoffracturesandpostoperativecomplications:Asestematicreviewandmeta-analysis》*填写本人排名情况（格式如“1/5”）。45