香菇菌多糖在炎性肠病—炎癌转化中的治疗作用研究

《香菇菌多糖在炎性肠病—炎癌转化中的治疗作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

中图分类号：学校代码：10055UDC：密级：公开硕士学位论文香菇菌多糖在炎性肠病-炎癌转化中的治疗作用研究Thestudyofthetreatmenteffectsoflentinanoninflammatoryboweldiseaseandcolitis-associatedcancer论文作者赵亚丽指导教师杨诚教授申请学位理学硕士培养单位药学院学科专业微生物与生化药学研究方向生物医药答辩委员会主席李鲁远评阅人康毅刘祥南开大学研究生院二○一六年五月 南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：年月日非公开学位论文标注说明(本页表中填写内容须打印)根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目申请密级□限制(≤2年)□秘密(≤10年)□机密(≤20年)保密期限20年月日至20年月日审批表编号批准日期20年月日南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效)注：限制★2年(可少于2年);秘密★10年(可少于10年);机密★20年(可少于20年) 南开大学研究生学位论文作者信息论文题目香菇菌多糖在炎性肠病-炎癌转化中的治疗作用研究姓名赵亚丽学号2120133146答辩日期2016年5月24日论文类别博士□学历硕士专业学位硕士□同等学力硕士□划√选择学院(单位)药学院学科/专业(专业学位)名称微生物与生化药学联系电话电子邮箱通信地址(邮编)：非公开论文编号备注注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一份并签字后交校图书馆，如已批准为非公开学位论文，须附批准通过的《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》和“非公开学位论文标注说明”页。 摘要摘要炎性肠病（inflammatoryboweldisease,IBD）是一种特殊的慢性非特异性肠道炎症，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。炎性肠病的发病机制目前并没有研究清楚，但有证据显示IBD的发生与免疫、遗传、环境等因素有关。近年来，炎性肠病的发病率迅速增长，并且患有炎性肠病的人群比普通人群更易发展成结肠癌，其生命健康受到严重威胁。现今，对炎性肠病的药物治疗均疗效欠佳，而且经常会引发较大的毒副作用。因此，迫切需要针对炎性肠病开发一种具有确切治疗效果而且毒副作用低的新型药物。香菇菌多糖（lentinan），提取自特殊香菇菌种的菌丝体发酵液，是一种具有免疫调节功能的真菌多糖。目前，香菇菌多糖在临床广泛用于慢性病毒性肝炎治疗，也可作为肿瘤化疗辅助用药，主要通过提高患者的免疫力而发挥作用，这使得其有望开发成一种安全有效、低毒的治疗炎性肠病的药物。在体内药效学水平上，本研究基于三种炎性肠病动物模型，发现香菇菌多糖对疾病小鼠的体重、腹泻情况、结肠长度以及结肠组织溃疡和炎症细胞浸润情况有明显恢复作用，证实了香菇菌多糖能够显著地改善由葡聚糖硫酸钠（dextransodiumsulfate,DSS）诱导的溃疡性结肠炎急性期、慢性期以及由三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonicacid,TNBS）诱导的克罗恩病。此外，通过氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/DSS诱导建立的结肠炎相关结肠癌（colitis-associatedcancer,CAC）模型，发现香菇菌多糖明显抑制了由AOM/DSS诱导的结肠癌的肿瘤形成，证实了香菇菌多糖能够抑制炎症向癌的转化。体外研究中，通过钙流检测证实了香菇菌多糖能够干扰TLR4信号通路的激活，通过双荧光素酶报告基因检测、Westernblot以及免疫荧光和免疫组化分析证实了香菇菌多糖能够抑制NF-κB的激活和入核转运，通过细胞因子抗体芯片检测证实了香菇菌多糖能过抑制多种炎症因子的过量表达，进一步通过免疫组化证实了香菇菌多糖抑制炎症因子表达的同时也抑制了结肠癌肿瘤标志物的蛋白表达。以上结果表明，香菇菌多糖能够通过干扰配体与TLR4的结合而抑制下游钙流信号和NF-κB的激活，进而抑制炎症因子过量表达，以发挥肠道抗炎作用，从而为炎性肠病以及结肠炎相关结肠癌的治疗提供了一个新的思路。关键词：香菇菌多糖；炎性肠病；结肠癌；NF-κB；炎症因子I AbstractAbstractInflammatoryboweldisease(IBD),includingulcerativecolitis(UC)andCrohn’sdisease(CD),isachronicnon-specificcolitisinflammatorydisorder.ThepathogenesisofIBDisunclear,butevidenceshowedthattheoccurrenceofIBDwasrelatedtoimmunesystemdisorders,geneticandenvironmentfactors.IBDconstitutesasignificanthealthburdentomillionsofpeopleanditsincidenceisincreasingrapidly.Besides,UCismorelikelytodevelopintocolorectalcancer.However,effectsofdrugsforthetreatmentofIBDatpresentarenotsatisfactoryandmostofthedrugshaveserioussideeffects,sothereisademandforthediscoveryofnovelandeffectivedrugswithlowsideeffects.Lentinan,extractedfromthemyceliumofLentinusEdodes,isakindoffungalpolysaccharidewithimmunoregulatoryactivity.Basedonitsimmunomodulatoryeffect,lentinanisextensivelyusedforchronicviralhepatitisandadvancedmalignanttumorsinclinic,whichmakesitbecomeapotentialdrugforIBDtreatment.Inthisstudy,accordingtothetwomainformsofIBD,weestablishedthreeanimalmodels,includingacuteUCinducedbyhighdoseofdextransodiumsulfate(DSS),chronicUCinducedbylowdoseofDSSandCDinducedbyTNBS.Resultsshowedthatlentinansignificantlyimprovedbodyweightloss,diarrhea,shortenedcolonlength,andhistologicalscoresoftheabove-mentionedthreemodels.Inaddition,lentinansignificantlyattenuatedthetumorigenesisinazoxymethane(AOM)/DSSinducedcolitis-associatedcancer(CAC)throughinhibitingtheinflammation-cancertransformation．Invitro,calciumassayshowedthatlentinaninhibitedthecalciumsignalsmediatedbyTLR4.DualluciferasereportergeneassayandWesternblotshowedlentinaninhibitedtheNF-κBactiviation,andnucleartranslocationofNF-κBwasalsoinhibitedascanbeseeninimmunofluorescenceandimmunohistochemistry.Thedetectionofcytokineantibodyarraysshowedthatlentinansignificantlydecreasedtheexpressionlevelofkindsofinflammatorycytokines,togetherwithadecreasedexpressionofcoloncancermarkersshowedintheimmunohistochemicalstainingofCACmice.II AbstractTheseresultssuggestthatlentinanexhibitsintestinalanti-inflammatoryactivitythroughinhibitionofinflammatorycytokinesexpressionassociatedwiththeinhibitionofcalciumsignalsandNF-κBpathwayrelatedtoTLR4,whichprovidepotentialnewtreatmentsforIBDandCAC.KeyWords:Lentinan;IBD;CAC;NF-κB;inflammatorycytokinesIII 目录目录摘要........................................................................................................IAbstract................................................................................................II第一章引言..........................................................................................1第一节炎性肠病的研究进展...........................................................................11.1.1炎性肠病概述........................................................................................................11.1.2炎性肠病发病机制的研究现状.............................................................................11.1.3炎性肠病的药物治疗现状.....................................................................................2第二节NF-κB与炎性肠病...............................................................................31.2.1NF-κB的结构........................................................................................................41.2.2NF-κB的活化途径................................................................................................41.2.3NF-κB与炎性肠病................................................................................................4第三节香菇菌多糖的研究进展.......................................................................51.3.1香菇菌多糖概述....................................................................................................51.3.2香菇菌多糖的功能研究.........................................................................................5第四节课题立论依据......................................................................................6第二章实验材料和方法......................................................................7第一节香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠治疗作用的研究方法...........72.1.1实验材料...............................................................................................................72.1.2实验方法...............................................................................................................8第二节香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠治疗作用的研究方法.........112.2.1实验材料..............................................................................................................112.2.2实验方法..............................................................................................................12第三节香菇菌多糖对克罗恩病小鼠治疗作用的研究方法............................132.3.1实验材料..............................................................................................................132.3.2实验方法..............................................................................................................13第四节香菇菌多糖对炎性肠病预防作用的研究方法....................................152.4.1实验材料..............................................................................................................152.4.2实验方法..............................................................................................................15IV 目录第五节香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌作用的研究方法............................162.5.1实验材料..............................................................................................................162.5.2实验方法..............................................................................................................16第六节香菇菌多糖治疗炎性肠病的作用机制研究方法................................172.6.1实验材料..............................................................................................................172.6.2实验方法..............................................................................................................202.6.3统计方法..............................................................................................................28第三章实验结果..............................................................................29第一节香菇菌多糖对炎性肠病治疗作用研究的实验结果..........................293.1.1香菇菌多糖对炎性肠病小鼠体重的影响.............................................................293.1.2香菇菌多糖对炎性肠病小鼠疾病活动指数的影响..............................................303.1.3香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠长度的影响..................................................313.1.4香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠大体形态的影响...........................................323.1.5香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠组织损伤的影响...........................................34第二节香菇菌多糖对炎性肠病预防作用研究的实验结果..........................353.2.1香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠体重的影响........................353.2.2香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠一般状况和疾病活动指数的影响...............................................................................................................................363.2.3香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠长度的影响.............373.2.4香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠大体形态的影响.....373.2.5香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠组织损伤的影响.....38第三节香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌作用研究的实验结果...................393.3.1香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠一般状况和体重的影响............................393.3.2香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠肿瘤形成的影响.......................................393.3.3香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠结肠组织病理变化的影响........................40第四节香菇菌多糖治疗炎性肠病作用机制研究的实验结果......................403.4.1钙流检测香菇菌多糖对炎症因子激活的TLR4信号通路的抑制作用.................403.4.2香菇菌多糖对NF-κB活性的抑制作用.................................................................413.4.3香菇菌多糖对细胞因子表达水平的抑制作用.......................................................44第四章讨论......................................................................................46参考文献..............................................................................................49V 目录致谢......................................................................................................53个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果..............................54VI 第一章引言第一章引言第一节炎性肠病的研究进展1.1.1炎性肠病概述炎性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)是一种慢性非特异性的肠道炎症疾病，其病程反复，在临床上主要表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便以及里急后重等症状，病理特点为结肠黏膜慢性炎症、肠黏膜溃疡或有透壁性肉芽肿形[1,2]成。IBD原在欧美国家发病率较高，近年来，由于社会压力增加以及饮食结[3]构与生活习惯的改变，该病在我国的发病率也呈迅速增长趋势。溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)是IBD的两种主要类型，它们的发病机制相同或相近。CD可发生于整个消化道，常见于末端回肠和右半结肠，病变累及肠壁全层，呈现出节段性、鹅口疮样溃疡，出现坏死性肉芽肿。UC多发于直肠和乙状结肠，病变累及黏膜层和黏膜下层，呈现出连续性、[4]弥漫性溃疡，伴有充血和水肿，复发性高。此外，UC患者发生结直肠癌[5,6](colorectalcancer,CRC)的几率明显增加，高于普通人群近20倍。CRC是全世界仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见恶性肿瘤，居于恶性肿瘤[7,8]死因的第四位。结肠炎相关结肠癌(colitis-associatedcancer,CAC)是CRC的一种亚型，难治愈，且死亡率很高。超过20%的UC患者在确诊30年内会发展[9]成CAC，其死亡率高达50%以上。1.1.2炎性肠病发病机制的研究现状目前，IBD的发病原因不明，发病机制仍未阐明，使得IBD难以彻底地治愈。研究显示，IBD的发生与免疫、遗传及环境因素有关，免疫因素在其中发挥[10]着重要作用。1.1.2.1环境因素[11]过去，IBD在西方发达国家如美国、英国的发病率很高，但在我国发病率较低。然而随着社会工业化、城市化，生活水平提高，饮食结构和生活方式改变，IBD在我国的发病率呈迅速上升趋势，表明环境的改变增加了IBD发生1 第一章引言的危险。另外，高脂饮食与IBD的发生密切相关，而多食蔬菜、水果可以防止IBD。吸烟和阑尾切除手术可以降低UC患者的复发率，但是会提高CD患者复发的可能性。长期服用非甾体类抗炎药、口服避孕药以及维生素D不足会增加[12]IBD发生的危险。此外，环境污染、睡眠障碍等也会影响IBD的病程。1.1.2.2遗传因素流行病学调查发现，UC和CD的患者具有明显的家族聚集性和种族差异性[13]，提示遗传易感性是IBD发病的一个重要原因。有研究表明，遗传因素在CD中发挥着更显著的作用，同卵双胞胎中，UC发病率是6~14%，而CD发病率是[14]44~50%。CD患者第16条染色体上的NOD2/CARD15是首先发现的一个CD[15]易感基因，它能识别细菌细胞壁中的脂多糖而启动免疫反应，其基因突变或功能缺陷导致肠道免疫屏障受损，使肠道处于致病菌易感状态，产生局部炎症，[16,17]引起肠道组织损伤。1.1.2.3免疫因素[2]目前普遍认为IBD的发病与异常的自身免疫调节具有密切关系。肠黏膜免疫系统在正常情况下既能对致病因子的入侵产生抵制作用，又具有对肠道非致病共生菌群的耐受性。当肠道免疫屏障受损，大量致病因子侵入，机体对肠[18,19]道共生菌的耐受遭到破坏，导致自身免疫激活不可控，从而引起肠道炎症。此外，细胞因子群在肠黏膜免疫系统中也发挥着重要的调节作用，促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的比例失调会导致肠道免疫紊乱，引起肠炎发生。巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞向肠黏膜组织的迁移，也会引起炎症和肠组织的[20]损伤。这些过程可由Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）介导，通过下游信号传递，诱导核因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)的活化，从而导致炎[21]性肠病的发生。总而言之，IBD的可能发病机制是遗传易感个体受到环境因素的影响，同时又有肠道菌群的参与，从而启动肠道免疫，促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子间失去平衡，导致异常的免疫应答，从而造成肠道的持续性炎症。1.1.3炎性肠病的药物治疗现状目前，对IBD的治疗主要是基于炎症控制、免疫功能调节以及控制发作和维持缓解。现今对炎性肠病的治疗尚无特异性强而毒副作用小的药物，传统的2 第一章引言[22,23]治疗药物主要包括氨基水杨酸、糖皮质激素及免疫抑制剂三大类。1.1.3.1氨基水杨酸类氨基水杨酸类主要包括5-氨基水杨酸（5-ASA）和柳氮磺胺吡啶（SASP），其中以SASP应用最广，是用于UC治疗的主要用药，其有效成分是5-ASA。但是SASP副作用较大，发生率较高，常会引起胃肠道反应、头痛、皮疹、粒细胞降低、贫血等不良反应，剂量须严格把控。1.1.3.2皮质类固醇皮质类固醇如泼尼松、地塞米松等，主要用于UC的急性发作，对维持缓解无效，而且其副作用明显，可使病人皮肤改变、失眠、精神异常、抗感染能力降低，可诱发糖尿病、白内障和骨质疏松等，所以用量不能过大，也限制了其长期使用。1.1.3.3免疫抑制剂免疫抑制剂包括硫代嘌呤、环孢素A等，当有患者使用氨基水杨酸类和皮质类固醇不起作用时，或者对皮质类固酮产生依赖性时，可以使用免疫抑制剂治疗。这类药起效缓慢，且毒性大，最主要的副作用是骨髓抑制，还可以引起急性胰腺炎、肝损伤、恶心、发热和过敏反应。总之，对于炎性肠病的治疗，氨基水杨酸类、皮质类固醇和免疫抑制剂类药物虽有一定疗效，但患者仍不甚满意，且均有较大副作用，限制了其长期使用。所以，针对炎性肠病开发具有确切治疗效果而且毒副作用低的新型药物具有重要意义。第二节NF-κB与炎性肠病大多研究认为IBD与免疫反应的异常密切相关，肠黏膜免疫紊乱，各种细[24]胞因子相互作用，引起强烈的炎症反应，导致黏膜损伤。其中细胞因子TNF-α、[25,26,27]IL-1β、IL-8等在IBD发生发展中所起的重要作用已经得到了证实，而这些细胞因子的调控和释放与NF-κB存在着重要关系。NF-κB几乎存在于所有的真核细胞中，它可以特异性结合多种基因的启动子和增强子序列位点，从而调节基因的转录和表达，与免疫、炎症、应激等反应的发生密切相关，同时也参3 第一章引言[28,29]与调控细胞分化、增殖、凋亡等过程。所以，以抑制NF-κB和促炎性细胞因子为切入点来研究IBD从而寻求新型治疗药物是现如今该领域的研究热点，具有深远的临床应用前景。1.2.1NF-κB的结构[30]在哺乳动物细胞中有五种Rel/NF-κB家族成员，即NF-κB1（p50），NF-κB（p52），c-Rel，Rel（p65）和RelB。这些蛋白通常以同源或异源二聚体的形式存在，它们共同拥有一个同源结构域，以确保其二聚化以及与DNA的结合，核定位信号（NLS）也位于该同源结构域内。最常见的二聚体是p65/p50异源二聚体，也就是常说的NF-κB。NF-κB二聚体在细胞浆中与一种被称为IκB(1nhibitoryproteinofNF-κB，IκB)的抑制蛋白结合成为三聚体，以无活性的状态存在。IκB与NF-κB的同源结构域结合，掩盖了其中的NLS，从而导致NF-κB不能入核。1.2.2NF-κB的活化途径对于NF-κB活化的信号通路研究已经很清楚：当细胞受到各种外界信号刺激时，相应的受体将信号传递到细胞浆，胞质中的IκB激酶（IKK）上游激酶被激活，进而激活IKK复合物；后者磷酸化IκB抑制物N端的两个特定的丝氨2223酸残基Lys和Lys，磷酸化的IκB再被多聚泛素化，继而被泛素依赖性蛋白酶体降解，受其抑制的NF-κB则得已释放，脱离NF-κB-IκB三聚体，并暴露出NLS，由胞浆转位进入核内，最后与特定的靶基因κB位点结合，诱导基因转[31]录。1.2.3NF-κB与炎性肠病NF-κB能调节多种与炎症反应和免疫反应相关的基因的表达，与IBD的发[32,33]生和发展密切相关。IBD患者肠黏膜巨噬细胞和上皮细胞中NF-κB水平显著升高且呈激活状态，其通过促进多种炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-8等的基因表达，而这些炎症因子在某种程度上直接参与了肠道黏膜炎症反应，使中性粒细胞迁移至炎症部位，引起黏膜损伤。而且，NF-κB水平越高，肠道炎症越[34]严重。早期研究表明，采用p65反义寡聚核苷酸局部给药成功治疗了由TNBS诱导的结肠炎，自此NF-κB逐渐成为了治疗IBD新药物研究和开发的靶标。[35,36]实际上，SASP和糖皮质激素的作用机制就是与抑制NF-κB激活有关。4 第一章引言第三节香菇菌多糖的研究进展1.3.1香菇菌多糖概述真菌多糖是一种具有多种生理活性的“生物反应调节剂”，而且其毒性小或无毒。1968年日本学者在香菇的子实体中分离出一种具有抗肿瘤活性的β-葡聚糖，此后，多糖的研究工作全面展开。研究发现，真菌多糖最主要的生物活性体现在对机体免疫系统功能的调节上。其对机体免疫调节作用机制包括：激活巨噬细胞和自然杀伤细胞使其产生相关的细胞因子；活化B淋巴细胞和T淋巴[37,38]细胞；激活补体系统。香菇菌多糖（lentinan）是采用特殊香菇菌种的菌丝体经深层液体发酵培养后提取制得的，不同于提取自香菇子实体的香菇多糖的扶正、固本作用，其生物活性更显著且毒副作用更低。香菇菌多糖的主要成分为甘露聚糖肽，也就是α键合的甘露糖与肽的结合体。其多糖部分以甘露糖为主，其次为半乳糖、葡萄糖、木糖和岩藻糖；肽链部分则是由天门冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸等18种L型氨基酸组成的。目前在临床上主要用于因自身免疫功能低下而引起的多种疾病，并用于慢性病毒性肝炎、保肝治疗；也可以作为肿瘤化疗的辅助用药，增效减毒，疗效确切。其工艺简单、质量可控，临床有效性和安全性良好。目前在国内有片剂上市，是应用非常成熟的多糖类产品。1.3.2香菇菌多糖的功能研究香菇菌多糖对免疫功能的调节作用已有大量研究，它能够激活巨噬细胞，增强B淋巴细胞合成IgG和IgM的能力，提高巨噬细胞的吞噬功能，增强自然杀伤细胞的活性，促进干扰素和白介素等的生成，从而恢复和提高机体免疫功能；研究也表明，香菇菌多糖可促进亢进的机体免疫状态恢复稳态，对由自身免疫亢进引起的自身免疫性甲状腺疾病发挥抗炎和治疗作用。香菇菌多糖的抗肿瘤作用主要是激活T淋巴细胞并分泌一些活化因子，增强巨噬细胞的吞噬能力，增强杀伤肿瘤细胞的效果；促进脾细胞的生长并产生大量浆细胞，促进抗体生成能力，增强体液免疫作用，促使因化疗导致减少的白细胞得到恢复。此外，香菇菌多糖能降低肝损伤导致的谷丙转氨酶的升高，促进肝糖原的合成，增加匀浆细胞色素P450的含量，进而调节体内某些活性物质，对肝脏起5 第一章引言保护作用。香菇菌多糖目前并未有用于炎性肠病相关治疗的产品上市，且鲜有相关文[39,40]献报道。但它具有的免疫调节功能、抗炎作用和调节肠道菌群的功能提示我们，香菇菌多糖可能对免疫紊乱、肠道菌群失调等引起的炎性肠病有一定作用。[41]近年来，Nishitani等人的研究显示，香菇多糖可以通过诱导TNFR1内吞，抑制NF-κB的核转位，进而抑制IL-8的表达，从而达到治疗溃疡性结肠炎急性期小鼠的效果。而香菇菌多糖作为香菇多糖的替代用药，是否在炎性肠病的治疗上有着更广泛的应用是值得研究的。第四节课题立论依据IBD目前在临床上尚无有效的治疗药物，而天然多糖在抗炎和免疫调节方面具有低毒的优势。香菇多糖已被证实可以治疗急性期UC，然而对其他类型的IBD如慢性期UC和CD及CAC的作用以及确切分子机制研究并不清楚。本研究通过不同诱导剂建立三种IBD疾病模型，即UC急性期、UC慢性期和CD模型，并建立CAC模型，以评价香菇菌多糖对UC和CD两种IBD类型以及UC急性期和慢性期不同发病期的治疗作用，同时评价香菇菌多糖在抑制CAC模型炎-癌转化过程的作用，并进一步通过钙流检测、荧光素酶报告基因检测、Westernblot、免疫荧光、免疫组化、细胞因子抗体芯片检测的方法深入探讨香菇菌多糖治疗炎性肠病的作用机制，从而将香菇菌多糖开发成一种可长期服用，且有效治疗炎性肠病的安全有效的临床药物。6 第二章实验材料和方法第二章实验材料和方法第一节香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠治疗作用的研究方法2.1.1实验材料2.1.1.1实验仪器与耗材仪器名称生产厂家电子天平梅特勒-托利多体视荧光显微镜Nikon全自动封闭组织脱水机LEICA石蜡包埋机LEICA半自动石蜡切片机LEICA全自动组织染色机LEICA全自动组织封片机LEICA正置荧光显微镜OLYMPUS载玻片江苏世泰试验器材有限公司盖玻片江苏世泰试验器材有限公司包埋盒北京蓝富德医疗设备有限公司2.1.1.2实验动物本试验选用动物品系为C57BL/6小鼠，雌性，18~22g，SPF级别，共60只，由中国食品药品检定研究院提供，合格证号：11400500005679。2.1.1.3实验药品和试剂供试药品：香菇菌多糖。灰黄色粉末，开封制药（集团）有限公司赠予，批号：201309014，总糖：64.3%，多糖：60%（符合国家药品标准WS1-XG-026-2002）。阳性对照药：柳氮磺胺吡啶。暗黄色至棕黄色粉末，购自于SigmaAldrich公司，货号为：S0883，批号：#BCBL8915V，纯度：≥98.0%。造模诱导剂：葡聚糖硫酸钠（DSS）。白色粉末，购自于美国MP公司，货号：9011-18-1，批号：M8667，分子量：36000~50000。7 第二章实验材料和方法2.1.1.4药品及试剂的配制香菇菌多糖溶液的配制：称取香菇菌多糖28mg，溶于7mL的双蒸水中，制成4mg/mL的香菇菌多糖溶液，待其充分溶解后，用0.22μm滤膜抽滤。在超净台内用灭菌后的双蒸水再分别稀释至2mg/mL和1mg/mL。柳氮磺胺吡啶溶液的配制：称取柳氮磺胺吡啶160mg，溶于4mL0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，制成40mg/mL的柳氮磺胺吡啶混悬液。葡聚糖硫酸钠的配制：称取葡聚糖硫酸钠粉末50g，溶于1L无菌蒸馏水中，制成5%（w/v）的葡聚糖硫酸钠溶液。2.1.2实验方法2.1.2.1实验分组及给药剂量设置小鼠按体重随机分组，每组10只。实验设正常对照组（Normal）、模型对照组（Model）、阳性对照组（SASP）以及香菇菌多糖高（High）、中（Medium）、低（Low）剂量组，剂量按4:2:1设置。根据临床最大使用剂量，制备三种不同浓度的香菇菌多糖溶液，浓度分别为：4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL，剂量分别为20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg。阳性对照组使用柳氮磺胺吡啶(40mg/mL)，剂量为200mg/kg。正常对照组以及模型对照组使用双蒸水。2.1.2.2模型建立及给药采用5%DSS诱导溃疡性结肠炎急性期模型。在适应期时，给予小鼠自由进食和饮水，实验开始即将饮用水换成5%的DSS溶液（正常对照组除外），给小鼠自由饮用。每只小鼠日饮水量按6mL计算，次日再补充足量DSS溶液，DSS溶液共给予8天。初次给予DSS24h后，发现小鼠出现软便、腹泻或血便现象，即对小鼠进行灌胃给药，正常对照组以及模型对照组小鼠每天给予0.1mL双蒸水，阳性对照组小鼠每天给予0.1mL柳氮磺胺吡啶(40mg/mL)，高剂量组、中剂量组、低剂量组每天分别给予0.1mL不同浓度(4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL)的香菇菌多糖。每天观察小鼠的一般生活状态、粪便性状及腹泻和血便情况，并称量体重。给药7天后颈椎脱臼法处死全部小鼠，暴露小鼠腹腔，剖取结直肠并测量长度；沿肠系膜方向将结直肠纵向剪开，生理盐水清洗粪便，用10%中性福尔马林溶液进行固定。体视显微镜观察大体损伤并进行评分后，取严重溃疡处作病理检查，依次进行脱水、石蜡包埋、切片、苏木素—伊红(hematoxylin8 第二章实验材料和方法andeosin，HE)染色，显微镜下观察组织病变情况并进行评分。2.1.2.3结直肠组织HE染色结直肠组织固定至少24h后，流水冲洗2~4h，然后依次进行如下操作：（1）组织脱水、透明、浸蜡一般脱水剂为乙醇，浓度从低到高，来逐步脱掉组织中的水份，再经二甲苯透明，浸蜡，使组织变硬。将固定好的组织置于Leica全自动全封闭组织脱水机中，启动相关程序进行脱水。脱水程序如下：50%乙醇45min，70%乙醇45min，80%乙醇1h，90%乙醇1h，95%乙醇1h，100%乙醇I50min，100%乙醇II45min；1/2二甲苯（V乙醇：V二甲苯=1：1）30min，二甲苯I25min，二甲苯II20min；石蜡I1h，石蜡II1h，石蜡III1h。（2）包埋先将石蜡包埋机预热使石蜡融化，自脱水机中取出脱水盒放入包埋机储存槽。将石蜡注入包埋模具，取组织置于其中央，切面向下放平整，用镊子轻轻压平，使最大切面贴附到模具上，盖上脱水盒，待蜡稍凝，再加足量石蜡，移至冷台。当石蜡完全凝固即可卸下蜡块，用于切片。（3）切片把蜡块放在半自动轮转式切片机上固定好，先进行粗切（10μm），直到组织最大切面露出，再进行细切（4μm），将切出的蜡带放入加热的捞片机水槽中（水温45℃左右），使蜡带平整。选好蜡片，用镊子分开相邻的蜡带，捞在作好标记的载玻片上，把水控干后放入染色架中，置于70℃恒温烤箱中烘烤1h。（4）染色将染色架置于全自动组织染色机中进行苏木素-伊红染色，设置程序如下：二甲苯I20min，二甲苯II5min，二甲苯III1min；无水乙醇I5min，无水乙醇II2min，95%乙醇1min，90%乙醇1min，85%乙醇1min；自来水洗5min，苏木素染液10min；自来水洗5min，1%盐酸乙醇1min；自来水洗30min，0.5％醇溶伊红2min；无水乙醇I2min，无水乙醇II2min，无水乙醇III2min；二甲苯I2min，二甲苯II2min。（5）封片将已染色的切片放于全自动封片机设定程序后启动封片，封片完毕后将片子取出晾干保存。9 第二章实验材料和方法2.1.2.4评价方法（1）疾病活动情况的评分：从造模开始至给药结束，对各组小鼠的体重变化、粪便性状和血便情况，参照如下标准进行评分，将各指标评分进行相加，作为疾病活动指数(DAI)。具体评分标准如表2.1：表2.1DAI评分标准评分体重下降（%）粪便性状0无正常11~5轻度松软26~10松软311~15腹泻4>15血便（2）结直肠长度：通过测量小鼠的结直肠长度来评价结直肠病变情况。（3）结直肠大体形态评分：通过体视显微镜观察小鼠结直肠黏膜的病变情况并进行评分。具体评分标准如表2.2：表2.2大体形态评分标准评分肉眼观察的大体形态改变表现0黏膜无损伤1局部充血水肿但没有糜烂、溃疡形成2有线形溃疡形成但没有明显炎症3有溃疡，且仅有一处出现炎症4沿结肠长轴2个或2个以上的部位有溃疡形成和炎症，但溃疡<1cm5有多处溃疡和炎症形成，且结肠纵轴>1cm（4）结直肠组织学评分：通过显微镜下观察结直肠组织溃疡、炎症细胞浸润等情况并进行评分。评分标准如表2.3：10 第二章实验材料和方法表2.3镜下组织学评分标准评分黏膜损伤炎症细胞浸润0无黏膜损伤黏膜固有层内无或有极少量炎症细胞黏膜固有层内有较多的炎症细胞或黏膜固1非连续的黏膜上皮损坏有层内的炎症细胞增多2表层黏膜糜烂炎症细胞扩散至黏膜下层广泛的黏膜破损并向肠壁深层扩3全层均有炎症细胞渗出展将黏膜损伤和炎症细胞浸润情况计分相加，计算出结、直肠组织学评分（0~6分）。2.1.2.5统计方法所有统计学数据均用SPSS17.0软件进行分析，用GraphPadPrism5软件绘图，各指标用均值±标准差来表示。所有数据通过单因素方差分析比较组间差异的显著性，以P<0.05为差异有统计学意义。第二节香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠治疗作用的研究方法2.2.1实验材料2.2.1.1实验仪器详见2.1.1.1。2.2.1.2实验动物本试验选用动物品系为C57BL/6小鼠，雌性，18~22g，SPF级别，共60只，由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心提供，合格证号：0037204。2.2.1.3实验药品和试剂详见2.1.1.3。2.2.1.4药品及试剂的配制香菇菌多糖和柳氮磺胺吡啶溶液的配制见2.1.1.4。11 第二章实验材料和方法葡聚糖硫酸钠溶液的配制：称取葡聚糖硫酸钠粉末10g，溶于1L无菌蒸馏水中，制成1%（w/v）的葡聚糖硫酸钠溶液。2.2.2实验方法2.2.2.1实验分组及给药剂量设置详见2.1.2.1。2.2.2.2模型建立及给药采用1%DSS诱导溃疡性结肠炎急性期模型。在适应期时，给予小鼠自由进食和饮水，实验开始即将饮用水换成1%的DSS溶液（正常对照组除外），给小鼠自由饮用。每只小鼠日饮水量按6mL计算，次日补充足量DSS溶液至日饮水量，DSS溶液共给予21天。初次给予DSS24h后，发现小鼠出现软便、腹泻或血便现象，即对小鼠进行灌胃给药，正常对照组以及模型对照组小鼠每天给予0.1mL双蒸水，阳性对照组小鼠每天给予0.1mL柳氮磺胺吡啶(40mg/mL)，高剂量组、中剂量组、低剂量组每天分别给予0.1mL不同浓度(4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL)的香菇菌多糖。每天观察小鼠的一般生活状态、粪便性状及腹泻和血便情况，并称量体重。给药20天后颈椎脱臼法处死全部小鼠，暴露小鼠腹腔，剖取结直肠并测量长度；沿肠系膜方向将结、直肠纵向剪开，生理盐水清洗粪便，使用10%中性福尔马林溶液进行固定。体视显微镜观察大体损伤并进行评分后，取严重溃疡处作病理检查，依次进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察组织的病变情况并进行评分。2.2.2.3结直肠组织HE染色详见2.1.2.3。2.2.2.4评价方法详见2.1.2.4。2.1.2.5统计方法详见2.1.2.5。12 第二章实验材料和方法第三节香菇菌多糖对克罗恩病小鼠治疗作用的研究方法2.3.1实验材料2.3.1.1实验仪器详见2.1.1.1。2.3.1.2实验动物本试验选用动物品系为BALB/c小鼠，雌性，18~22g，SPF级别，共70只，由中国食品药品检定研究院提供，合格证号：11400500007142。2.3.1.3实验药品和试剂供试药品和阳性对照药，详见2.1.1.3。造模诱导剂：三硝基苯磺酸(TNBS)，5%（w/v）水溶液，购自SigmaAldrich公司，货号：P2297。2.3.1.4药品及试剂的配制香菇菌多糖和柳氮磺胺吡啶溶液的配制，详见2.1.1.4。TNBS的配制：称取3.84mL5%（w/v，即50mg/mL）TNBS水溶液，4mL无水乙醇溶液和0.16mL蒸馏水，配制成24mg/mLTNBS的50%乙醇溶液。2.3.2实验方法2.3.2.1实验分组及给药剂量设置小鼠按体重随机分组，每组10只。实验设正常对照组（Normal）、溶剂对照组（Ethanol）、模型对照组（Model）、阳性对照组（SASP）以及香菇菌多糖高（High）、中（Medium）、低（Low）剂量组，剂量按4:2:1设置。根据临床最大使用剂量，制备三种不同浓度的香菇菌多糖溶液，浓度分别为：4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL，剂量分别为20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg。阳性对照组使用柳氮磺胺吡啶(40mg/mL)，剂量为200mg/kg。正常对照组、溶剂对照组和模型对照组使用双蒸水。2.3.2.2模型建立及给药采用TNBS诱导克罗恩病模型。在适应期时，给予小鼠自由进食和饮水。13 第二章实验材料和方法实验开始前24h，将BALB/c小鼠禁食，但给予自由饮水。首先腹腔注射适量10%水合氯醛轻度麻醉小鼠，用直径约为2mm的导管经润滑后从肛门插入结肠约4cm。正常对照组每只小鼠注入0.1mL生理盐水，溶剂对照组每只小鼠注入0.1mL50%乙醇溶液，模型对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组每只小鼠均注入等体积的24mg/mLTNBS的50%乙醇溶液(120mg/kg)。执鼠尾末端倒置5min，待药物完全吸收后放入笼中继续饲养。灌肠24h后，小鼠即出现软便、腹泻或血便现象，对小鼠进行分组灌胃给药，正常对照组、乙醇对照组和模型对照组小鼠每天给予0.1mL双蒸水，阳性对照组小鼠每天给予0.1mL柳氮磺胺吡啶(40mg/mL)，高剂量组、中剂量组、低剂量组每天分别给予0.1mL不同浓度(4mg/mL、2mg/mL和1mg/mL)的香菇菌多糖。每天观察小鼠的一般生活状态、粪便性状及腹泻和血便情况，并称量体重。给药7天后颈椎脱臼法处死全部小鼠，暴露小鼠腹腔，剖取结肠和直肠并测量长度；沿肠系膜方向将结、直肠纵向剪开，生理盐水清洗粪便，并固定于10%中性福尔马林溶液中；体视显微镜观察大体损伤并进行评分后，取溃疡最严重处做病理检查，依次进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察病变情况并进行评分。2.3.2.3结直肠组织HE染色详见2.1.2.3。2.3.2.4评价方法疾病活动情况的评分、结直肠长度和结直肠组织学评分，详见2.1.2.4。结直肠大体形态的评分，具体评分标准如表2.4：表2.4克罗恩病模型结直肠大体形态评分标准参数粘连穿孔坏死溃疡水肿无小中大重无有无轻重严正点溃溃溃无有部度部度度度重常状疡疡疡分分外充无伴伴表血充一两血处处炎以症上炎症分值01234010123012340114 第二章实验材料和方法将结直肠粘连、穿孔、坏死、溃疡和水肿的计分相加，计算出结直肠大体形态评分（0~13分）。2.3.2.5统计方法详见2.1.2.5。第四节香菇菌多糖对炎性肠病预防作用的研究方法2.4.1实验材料2.4.1.1实验仪器及耗材详见2.1.1.1。2.4.1.2实验动物C57BL/6小鼠，雌性，18~22g，SPF级别，12只，由中国食品药品检定研究院提供。2.4.1.3实验药品和试剂香菇菌多糖、葡聚糖硫酸钠，详见2.1.1.3。2.4.1.4药品及试剂的配制香菇菌多糖溶液的配制：称取香菇菌多糖8mg，溶于4mL的双蒸水中，制成4mg/mL的香菇菌多糖溶液，待其充分溶解后，用0.22μm滤膜抽滤。葡聚糖硫酸钠的配制，详见2.1.1.4。2.4.2实验方法小鼠在初期适应阶段后，按体重随机分成3组，每组4只，分别为正常对照组（Normal）、模型对照组（Model）和香菇菌多糖组（Lentinan）。在疾病模型建立前对香菇菌多糖组小鼠进行预防性给药，每天灌胃给予4mg/mL香菇菌多糖，0.1mL/只，正常对照组以及模型对照组小鼠给予等量双蒸水。给药7天后，开始用5%DSS诱导溃疡性结肠炎急性期，持续7天。每天观察小鼠的一般生活状态、粪便性状及腹泻和血便情况，并称量体重。7天后处死小鼠，取结直肠测量长度，观察大体损伤并进行HE切片病理检查。具体方法详见2.1.2。15 第二章实验材料和方法第五节香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌作用的研究方法2.5.1实验材料2.5.1.1实验仪器详见2.1.1.1。2.5.1.2实验动物本试验选用动物品系为BALB/c小鼠，雌性，18~22g，SPF级别，共15只，由中国食品药品检定研究院提供。2.5.1.3实验药品和试剂香菇菌多糖、葡聚糖硫酸钠，详见2.1.1.3。氧化偶氮甲烷（AOM）：购自SigmaAldrich公司，货号：A5486。2.5.1.4药品及试剂的配制香菇菌多糖溶液的配制，详见2.4.1.4。AOM的配制：以2.5mL生理盐水溶解25mgAOM，制成10mg/mL的AOM母液，4℃避光保存，用时再用生理盐水稀释成需要的浓度2mg/mL。DSS的配制：称取葡聚糖硫酸钠粉末20g，溶于1L无菌蒸馏水中，制成2%（w/v）的葡聚糖硫酸钠溶液。2.5.2实验方法2.5.2.1模型建立及给药采用AOM加以DSS诱导建立小鼠结肠炎相关结肠癌模型。小鼠在初期适应阶段后，按体重随机分成3组，每组5只，分别为正常对照组（Normal）、模型对照组（Model）和香菇菌多糖组（Lentinan）。实验开始时，正常对照组小鼠腹腔注射0.1mL生理盐水，随后不再给予处理。模型对照组和香菇菌多糖组每只小鼠单次腹腔注射0.1mL2mg/mLAOM（10mg/kg）；5天后，给予小鼠2%DSS水溶液自由饮用，连续7天后改为正常饮水14天，如此视为一个循环，反复进行3个循环后即可成功建立CAC模型。在第3个循环开始给予DSS时，开始对香菇菌多糖组小鼠进行给药，香菇菌多糖给药剂量为炎性肠病模型中高剂量组给药量，即20mg/kg，每只小鼠灌胃给予0.1mL4mg/mL的香菇菌多糖，正常16 第二章实验材料和方法对照组以及模型对照组小鼠给予等量双蒸水。观察小鼠的一般生活状态、腹泻和血便情况，并称量体重。第3个循环结束后，颈椎脱臼处死全部小鼠，暴露小鼠腹腔，剖取结直肠；沿肠系膜方向将结直肠纵向剪开，生理盐水清洗粪便，观察结直肠内膜肿瘤形成情况，并记录肿瘤数量，之后固定于10%中性福尔马林溶液中；取病变部位做病理检查，依次进行脱水、石蜡包埋和切片，切片一部分用作HE染色，显微镜下观察结直肠组织肿瘤形成情况，另一部分用作免疫组化分析。2.5.2.2结直肠组织HE染色详见2.1.2.3。第六节香菇菌多糖治疗炎性肠病的作用机制研究方法2.6.1实验材料2.6.1.1实验仪器及耗材仪器名称和型号生产厂家生物安全柜AzbilTelstar显微镜CKX41OlympusCentrifuge5702离心机eppendorfCO2恒温培养箱IL-161HI施都凯仪器设备（上海）有限公司电热水浴锅上海精宏实验设备有限公司酶标仪FlexStation3MolecularDevices台式冷冻离心机Thermofisherscientific恒温培养振荡器天津欧诺仪器有限公司FluoroskanAscent荧光酶标仪ThermofisherscientificJY-SPDT型水平电泳槽北京君意东方电泳设备有限公司JY600C通用型电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司共聚焦显微镜Nikon细胞培养皿NUNC离心管NUNC384孔细胞培养板NUNC17 第二章实验材料和方法仪器名称和型号生产厂家96孔细胞培养板NUNC24孔细胞培养板NUNC12孔细胞培养板NUNC2.6.1.2实验细胞、动物巨噬细胞RAW264.7，购自南京凯基公司；昆明小鼠，雌性，18~22g，SPF级，由中国食品药品检定研究院提供；2.6.1.3实验试剂试剂名称生产厂家RPMI1640细胞培养基Hyclone胎牛血清Hyclone胰蛋白酶上海生工生物工程有限公司二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichFLIPRCalcium6AssayKitsMolecularDevices脂多糖（LPS）Sigma-Aldrich转染试剂X-tremeGENEHPRocheDual-LuciferaseReporterPromegaassaysystemNF-κB-lucplasmid碧云天生物技术研究所大肠杆菌Trans5α感受态北京全式金生物技术有限公司无内毒素质粒大提试剂盒天根生化科技有限公司细胞核和细胞蛋白抽提试剂盒ThermopNF-κBantibodyCellSignalingNF-κBantibodyAffinityFITC-goatanti-rabbitIgGEARTHOX即用型免疫组化Elivisionplus福州迈新生物技术开发有限公司试剂盒（鼠/兔）CEAantibodyAffinityCK8antibodyAffinity18 第二章实验材料和方法试剂名称生产厂家CK18antibodyAffinityP53antibodyAffinityIL-13antibodySantaCruzCD30LantibodySantaCruz碱磷酶标记兔抗山羊IgG北京中杉金桥生物科技有限公司碱磷酶底物AP-Red试剂盒北京中杉金桥生物科技有限公司DABAmresco苏木素南京凯基生物科技发展有限公司ClearmountTM水溶性封片剂北京中杉金桥生物科技有限公司2.6.1.4药品和试剂的配制香菇菌多糖：称取0.06g香菇菌多糖，溶于3mLPBS中，制成20mg/mL的香菇菌多糖母液，待其充分溶解后，用0.22μm滤膜抽滤，保存于-20℃。临用时稀释至所需浓度。脂多糖（LPS）:将10mgLPS溶于10mLPBS中，制成1mg/mL的LPS母液，分装后保存于-20℃。临用时稀释至工作浓度。胰酶：称取0.25g胰蛋白酶，0.02gEDTA（终浓度为0.25%胰酶和0.02%2+2+EDTA），加入100mL1×PBS溶液（不含Ca、Mg），4℃低速搅拌，混合均匀，直至完全溶解。将pH调至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌,分装后保存于-20℃，短期内使用可保存于4℃。LB液体培养基：称取蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，溶解于950mLddH2O中，调pH至7.0，最后用ddH2O定容至1L。分装至小试管后，密封，于高压蒸汽锅内中高温121℃灭菌20min，室温保存备用。LB固体培养基：称取一定量的琼脂加至配好的LB液体培养基中，使琼脂终浓度为1%（w/v），高温121℃灭菌20min，室温冷却至其温度为55℃左右时倒入平板内（根据需要加入相应的抗生素，终浓度为100mg/L，直至全部溶解，静置，待培养基凝固后，进行密封、标记，保存至4℃备用。Westernblot所用试剂：30%丙烯酰胺溶液：称取30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加ddH2O定容至至100mL，使用棕色试剂瓶保存备用。19 第二章实验材料和方法1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)：称取181.71gTris，用HCl调pH至8.8，用ddH2O水定容至1L。1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)：称取12.1gTris，用HCl调pH至6.8，用ddH2O水定容至200mL。10%SDS：称取SDS10g，溶于80mLddH2O中，微波炉加热至68℃，直至完全溶解，然后用HCl调pH至7.2，用ddH2O水定容至100mL。10%过硫酸胺（AP）：称取APs1g，加ddH2O至10mL，混匀后分装为1mL每支，-20℃保存备用。四甲基乙二胺(TEMED)：分装成1mL，4℃避光保存备用。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(1L)：称取15.1gTris，5.0gSDS，94g甘氨酸，用纯水定容至1L，轻轻搅拌混合均匀后常温保存备用。5×Loading缓冲液：pH6.8Tris-HCl250mM，溴酚蓝0.5%，SDS10%，甘油50%，β-巯基乙醇5%，-20℃保存备用。12%分离胶(10mL)：ddH2O4.9mL，30%丙烯酰胺4mL，Tris-HCl1.5mol/L（pH8.8）2.5mL，10%SDS0.1mL，10%过硫酸铵0.1mL，TEMED4μL，混匀，加入制胶器后，再加入一定体积的异丙醇，使胶面保持平整，室温下静置约30min凝固。5%浓缩胶(3mL)：ddH2O2.1mL，30%丙烯酰胺0.5mL，Tris-HCl1.0mol/L（pH6.8）0.38mL，10%SDS0.03mL，10%过硫酸铵0.03mL，TEMED3μL，混匀后立即加到分离胶上，并插入相应梳子。转膜液：称取SDS0.37g、Tris5.8g、甘氨酸2.9g，加入甲醇200mL，加入双蒸水定容至1L，将pH调为8.3，室温保存。10×TBS缓冲液：称取NaCl88g、Tris12.1g，将pH调至7.4，用双蒸水定容至1L，常温保存。TBST溶液：用双蒸水将10×TBS稀释成1×TBS，加入1mLTween20，混匀即可使用。封闭液：称取5g脱脂奶粉，溶解于100mLTBST，混匀后储存于4℃短期内使用。2.6.2实验方法2.6.2.1细胞培养20 第二章实验材料和方法（1）细胞复苏将冻存细胞自液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中解冻，晃动冻存管使其在1min内全部融化，然后将细胞悬液加入到含10%FBS完全的培养基中，800rpm，离心5min，弃去上清，以完全培养基重悬细胞，缓缓加入含完全培养基的培养皿中，混匀，放入CO2培养箱37℃培养。（2）细胞传代复苏细胞生长至80%~90%汇合度时进行传代。弃去旧培养液，用PBS洗2涤细胞一次，加适量胰酶消化（1mL/25cm），显微镜下观察至细胞变圆时轻拍培养皿使细胞脱落，加入2倍体积完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心5min，弃去上清液，加少量培养基重悬细胞并轻轻吹打混匀，按照一定稀释比例传代至新的培养皿中，放入CO2培养箱37℃培养。（3）细胞冻存按培养基：胎牛血清：DMSO为5：4：1的配制冻存液，混合均匀，备用。状态良好的细胞长至80%~90%汇合度时，按照细胞传代的操作，收集细胞，离心，去上清，加入适量冻存液，混合均匀，每只冻存管中加入1mL细胞悬液，密封后作好标记，将冻存管放于冻存盒中，置于4℃10min，-20℃30min，再于-80℃冰箱过夜后放于液氮罐长期保存。2.6.2.2小鼠腹腔炎症因子获得及钙流检测（1）小鼠腹腔炎症因子获取通过大肠杆菌刺激小鼠建立急性腹膜炎模型，使之产生大量的炎症因子，具体方法如下：昆明小鼠5只，实验前禁食12h，但给予自由饮水。取摇过夜的大肠杆菌菌液，给予每只小鼠腹腔注射0.2mL，轻揉小鼠腹部使菌液分布均匀，建立小鼠急性腹膜炎模型。1h后颈椎脱臼法处死小鼠，打开小鼠腹腔，用PBS冲洗腹腔，收集腹腔灌洗液，置于冰上。腹腔液于冷冻离心机中离心，收集上清，在生物安全柜中用0.22μm滤膜抽滤，分装后保存于-20℃冰箱备用。（2）钙流检测2＋抗原刺激能够导致细胞内的Ca从钙库中释放至胞浆，诱导胞浆中钙流的2＋上升。细胞内Ca的浓度的变化可以用特异性荧光染料来检测，在细胞中载入对钙离子敏感的荧光染料，如Fura2-AM，在细胞内水解其酯基后即将Fura2留21 第二章实验材料和方法2+2+在胞内，然后特异性结合胞浆内游离的Ca，其发射的荧光强度与胞内的Ca浓度成正比，因此通过监测荧光值变化，可准确的反应胞内钙流的变化，并间接地反映出药物对相关受体如Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）的激动或抑制作用。钙流检测具体方法如下：4生长状态良好的RAW264.7细胞，以10/孔的密度接种于384孔细胞培养板中，每孔25μL，置于CO2培养箱37℃培养过夜，使细胞贴壁。次日，弃去旧培养基，换成含不同浓度香菇菌多糖（0.5mg/mL和1mg/mL））的培养基，每一药物浓度设置3个重复，37℃孵育2h。2h后加入荧光染料，每孔25μL，再继续37℃孵育2h。使用酶标仪FlexStation3检测在加入腹腔炎症因子刺激后RAW264.7细胞产生的瞬时钙流信号。2.6.2.3双荧光素酶报告基因检测NF-κB转录活性一、质粒扩增由于细胞转染要求较高浓度的质粒，故需对质粒进行扩增，步骤如下：（1）转化①取出-80℃保存的E.coli.Trans5α感受态细胞，室温下迅速解冻后冰上放置5min，于超净台内加入2μL质粒，手指轻弹EP管底使其混匀，冰上放置30min；②将转化管转入42℃水浴锅内热激90s，迅速转移至冰上，冰置3~5min；③在超净工作台内加入200μL不含氨苄青霉素的LB液体培养基，轻轻混合均匀，37℃恒温摇床震荡复苏培养1h；④取适当体积已复苏的菌液加入到含氨苄青霉素的固体LB平板上，涂布均匀，先于37℃培养箱中正置培养30min，待菌液被完全吸收，再倒置平板继续培养12~16h。（2）单克隆挑取挑取固体LB平板上生长的单个菌落，加入到含100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基小试管中，置于37℃摇床培养6~7h后转入200mLLB培养基（含氨苄青霉素100mg/mL）的锥形瓶，置于37℃恒温摇床扩大培养。（3）质粒提取①将菌液转入离心管内，4℃8000rpm离心3min，收集细菌，尽量除去上清；22 第二章实验材料和方法②向菌体沉淀中加入8mL含RNaseA的bufferP1溶液，充分悬浮细菌沉淀；然后加入8mLbufferP2，轻轻混匀，使菌体充分裂解，室温静置5min；待溶液变清后加入8mLbufferP4，轻轻混匀，溶液出现白色絮状沉淀，室温静置10min，8000rpm离心10min；③将全部上清溶液转入过滤器CS1中除去沉淀，在滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，再转移至与已经过平衡液BL处理的吸附柱CP6中，4℃8000rpm离心2min，弃去废液；④向CP6中加入10mL漂洗液PW，8000rpm离心2min。弃去废液，重复漂洗一次；⑤向CP6中加入3mL无水乙醇沉淀DNA，8000rpm离心2min。弃去废液，再离心一次将残余漂洗液去除；⑥将灭菌的ddH2O加入到CP6中洗脱DNA，室温静置5min。8000rpm离心2min，收集洗脱液分装于无菌Ep管中；⑦测定DNA浓度，保存于-20℃备用。二、细胞准备与处理（1）细胞铺板4生长状态良好的RAW264.7细胞消化后，接种于96孔板中，10个细胞/孔，每孔100μL，置于CO2培养箱37℃培养过夜，待细胞达到70~80%汇合度时可以进行细胞转染。（2）细胞转染①转染试剂的配制：每孔0.3μL罗氏转染试剂，溶解于25μL无血清RPMI1640培养基中，轻轻吹打使之分散均匀后，静置5min；②质粒的配制：每孔0.1μgNF-κB-luc质粒和0.02μgPRL-TK质粒，溶解于25μL无血清RPMI1640培养基中，轻轻吹打使之混合均匀；③将混匀的报告基因质粒加入到溶解的转染试剂中，混合均匀，静置20min；④吸弃96孔板内旧培养基，换成新鲜的含20%血清的RPMI1640培养基，每孔50μL；⑤将质粒和转染试剂的混合物加入96孔板中，每孔50μL，置于CO2培养箱37℃培养。（3）加刺激物、加药23 第二章实验材料和方法细胞转染24h后，加入新鲜的含有LPS（终浓度1μg/mL）和不同浓度香菇菌多糖（终浓度0.5mg/mL、1mg/mL）的培养基，每组设3个复孔，置于CO2培养箱37℃培养24h后进行荧光检测。三、荧光检测（1）弃去旧培养基，PBS清洗细胞一次，控干。（2）每孔加入20μL1×PLB裂解液，设置酶标仪程序，将96孔板放于酶标仪内，660rpm震荡15min，使细胞充分裂解。（3）将96孔板内的细胞裂解液全部转移至白色不透明96孔板相应的孔中，于每孔内加入50μL萤火虫荧光素酶底物LARII，660rpm震荡10s，酶标仪检测光吸收值，该数据即为萤火虫荧光素酶的荧光值，反映NF-κB转录调控水平。（4）取出96孔白板，迅速加入现配的海肾荧光素酶底物Stop＆Glo，每孔50μL，660rpm震荡10s后酶标仪检测光吸收值，该数据为海肾荧光素酶的荧光值，作为内参。（5）将每孔所测得的萤火虫荧光值均除以相对应的海肾荧光值，所得数值为相对荧光强度即RLU。2.6.2.4Westernblot检测NF-κB的核表达量（1）细胞处理生长状态良好的RAW264.7细胞接种至12孔细胞培养板中，置于CO2培养箱37℃培养。次日，待细胞达到70~80%汇合度时，进行加药处理，将原培养基换成含不同浓度香菇菌多糖的培养基。本试验分4组，即对照组，LPS刺激组，LPS+0.5mg/mL香菇菌多糖组和LPS+1mg/mL香菇菌多糖组。加药后将培养板放回培养箱37℃培养。24h后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激，37℃孵育1h后进行核蛋白提取。（2）核蛋白的提取核蛋白提取依照细胞核和细胞蛋白抽提试剂盒说明书进行：细胞进行胰酶消化后，收集悬液，500×g离心5min；PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清；细胞沉淀中加入预冷CERI重悬，涡旋15s，冰浴10min；加入预冷CERII，涡旋5s，冰上孵育1min，涡旋5s，1600×g离心5min，弃上清；加入预冷NER悬起细胞沉淀，冰上孵育；每隔10min涡旋15s，共40min后1600×g离心10min，24 第二章实验材料和方法收集上清即为核蛋白。按1:1加入2×loadingbuffer，100℃煮样5min，进行Westernblot检测。（3）Westernblot检测①SDS-PAGE电泳：配制12%分离胶和4%浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶电压180V，分离胶电压220V，至溴酚蓝跑到下缘1cm处停止。②转膜：将蛋白胶根据预染Marker条带切下含有目的条带的部分，并按照胶块大小剪出同等大小PVDF膜和滤纸，PVDF膜甲醇活化后同滤纸、海绵一起用转膜液浸湿。在转膜夹负极一侧依次铺上：海绵、四层滤纸、胶块、PVDF膜、四层滤纸、海绵，过程中尽量排尽气泡，然后置于印迹槽中，150mA恒流，在冰浴中转膜1h。③封闭：PVDF膜转移至杂交袋中，加入封闭液，置于摇床上，室温封闭1h或4℃封闭过夜。④一抗孵育：用封闭液配制pNF-κB一抗，室温振摇孵育1h或4℃过夜。⑤洗膜：1×TBST洗膜，5min/次，洗5次。⑥二抗孵育：封闭液配制相应种属的二抗，室温振摇孵育1h。⑦洗膜：1×TBST洗膜，5min/次，洗5次。⑧曝光：将辣根过氧物酶A、B底物按1:1混合，在暗盒内平铺一层保鲜膜，加上发光底物，覆上PVDF膜，膜上再滴加发光底物，盖上上层保鲜膜，于PVDF膜的位置覆盖上相应大小胶片，关闭暗盒曝光数分钟，取出胶片置于显影液内显影，清水冲洗，再置于定影液，最后用清水冲洗胶片晾干。2.6.2.5免疫荧光检测NF-κB的入核情况（1）细胞处理生长状态良好的RAW264.7细胞接种至12孔板中明胶包被的盖玻片上，于CO2培养箱37℃培养。次日，待细胞达到70~80%汇合度时，进行加药处理，将原培养基换成含1mg/mL香菇菌多糖的培养基。本试验分3组，即对照组，LPS刺激组和LPS+香菇菌多糖组。加药后将培养板放回培养箱继续培养。24h后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激，37℃孵育1h后进行免疫荧光分析。（2）免疫荧光分析①弃去培养基，PBS清洗细胞2~3次。②用适量-20℃的冷甲醇室温固定细胞5min。25 第二章实验材料和方法③弃去甲醇，PBS清洗细胞2~3次。④用PBS配制含5%FBS或BSA和0.1%Tritonx-100的封闭液，室温封闭30min。⑤用封闭液配制NF-κB一抗，室温下一抗孵育1h。⑥PBS清洗细胞4~5次。⑦用封闭液配制荧光二抗，室温下避光孵育30min。⑧PBS清洗细胞4~5次；取干净的载玻片滴加适量含DAPI的封片剂，将盖玻片倒扣于其上进行封片。⑨共聚焦显微镜观察并拍照，随机选取视野记录入核细胞数。2.6.2.6免疫组化检测NF-κB的入核情况选用溃疡性结肠炎急性期模型小鼠的结直肠组织切片进行NF-κB免疫组化染色，具体步骤如下：（1）石蜡切片脱蜡、水化：二甲苯I15min，二甲苯II15in，无水乙醇I5min，无水乙醇II5min；3%过氧化氢-甲醇溶液30min；95%乙醇5min，80%乙醇5min；自来水、蒸馏水先后各冲洗5min，PBS冲洗3次，3min/次。（2）抗原修复：将切片放入玻璃切片缸内，加入0.01M枸橼酸缓冲液使之全部浸没，置于微波炉中进行热抗原修复，首先预热10min左右，至沸腾后维持6~7min，随时观察，切忌液体流出造成切片干燥。抗原修复结束后切片室温冷却40min左右，先后用蒸馏水和PBS各洗3次，3min/次。（3）血清封闭：除去组织周围的PBS液体，10%血清封闭20min。（4）一抗孵育：除去组织周围血清，加相应浓度NF-κB一抗，湿盒中室温孵育30min后，4℃冰箱过夜。（5）增强剂孵育：次日取出湿盒，待恢复至室温后，PBS冲洗3次，3min/次；除去PBS液，加增强剂，室温孵育20min，PBS冲洗3次，3min/次。（6）二抗孵育：拭去PBS液，滴加HRP标记山羊抗兔IgG，室温孵育30min，PBS洗3次，3min/次。（7）显色剂显色：拭去PBS液，使用新鲜配制的DAB溶液显色3~5min，显微镜下随时观察。（8）复染核：自来水、蒸馏水依次冲洗各3min，苏木素复染核，自来水冲洗返蓝3min，蒸馏水冲洗3min。26 第二章实验材料和方法（9）脱水、透明：80%乙醇3min，95%乙醇3min，无水乙醇I5min，无水乙醇II5min；二甲苯I10min，二甲苯II10min，最后用中性树胶封片。2.6.2.7细胞因子抗体芯片检测多种细胞因子表达水平（1）细胞处理生长状态良好的RAW264.7细胞接种至12孔细胞培养板中，置于CO2培养箱37℃培养，使细胞贴壁。次日，加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激，37℃孵育1h后进行加药处理，将原培养基换成1mg/mL香菇菌多糖的培养基。本试验分3组，即对照组，LPS刺激组和LPS+香菇菌多糖组。加药后将培养板放回培养箱中继续培养。24h收集细胞培养上清，离心，取上清，保存于-20℃待进行细胞因子抗体芯片检测。（2）细胞因子抗体芯片检测细胞因子抗体芯片检测需要样品量少，且一次实验可同时检测多种细胞因子，检测可达pg级别，具有高通量、高特异性、高灵敏度的特点。该实验委托于Raybiotech公司针对40种细胞因子进行检测，即BLC，CD30L，Eotaxin，Eotaxin-2，FasL，G-CSF，GMCSF，ICAM-1，IFNγ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12p70，IL-13，IL-15，IL-17，IL-21，KC，Leptin，LIX，MCP-1，MCP-5，M-CSF，MIG，MIP-1α，MIP-1γ，PF-4，RANTES，TARC，TCA-3，TIMP-1，TNFα，TNFRI，TNFRII。主要步骤如下：①实验前准备：取出玻璃芯片室温平衡30min左右，再进行干燥处理1~2h；以样品稀释液对细胞因子标准品进行梯度稀释。②封闭：将100µL样品稀释液加入到芯片孔中，置于摇床上室温孵育1h，以封闭抗体芯片。③加样：弃去每个孔中液体，然后加入100µL的标准液和相应样品，4℃孵育过夜。④清洗。⑤抗体孵育：配制检测抗体混合物加入到每个孔中，80µL/孔，摇床上孵育1.5h。⑥清洗。⑦Cy3-链霉亲和素的孵育：将配制好的Cy3-链霉亲和素加入到每个孔中，80µL/孔，置于摇床上避光孵育1h。27 第二章实验材料和方法⑧清洗。⑨荧光检测：采用激光扫描仪GenePix4000BMicroarrayScanner扫描芯片信号。⑩采用数据分析软件QAM-INF-1对数据进行分析。2.6.2.8免疫组化分析结直肠组织中结肠癌肿瘤标志物和炎症因子表达水平免疫组化法检测结直肠组织中结肠癌肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白8（CK8）、细胞角蛋白18(CK18)、抑癌基因p53以及炎症因子白介素13（IL-13）和CD30配体（CD30L）的蛋白表达。其中，CEA、CK8、CK18和p53免疫组化染色同2.6.2.6，而IL-13和CD30L免疫组化染色由于显色底物不同而方法略有差异，其（1）、（2）、（3）、（4）、（5）步骤同2.6.2.6相应步骤，其余步骤详述如下：（6）二抗孵育：拭去PBS液，滴加碱性磷酸酶（AP）标记的兔抗山羊IgG，室温孵育30min，PBS洗3次，3min/次。（7）显色剂显色：拭去PBS液，使用新鲜配制的AP-Red溶液进行显色，显微镜下随时观察，显色5~30min。（8）复染核：自来水、蒸馏水依次各冲洗3min，苏木素复染核，自来水冲洗返蓝3min，蒸馏水冲洗3min。（9）除去组织周围多余水分，直接用水性封片剂封片。对免疫组化染色结果进行评价：凡细胞浆中出现棕黄色物且其染色强度高于背景非特异染色者或细胞呈现出棕黄色颗粒为阳性细胞染色。在高倍镜下随机选取5个视野，共计数约1000个细胞，免疫组化阳性细胞率＝阳性细胞数/总细胞数*100%。免疫组化染色强度评分（0分，无；1分，弱；2分，中；3分，强）和免疫组化阳性细胞率评分（0分，<5%；1分，5~9%；2分，10~19%；3分，20~50%；4分，>50%）之和为该病例评分值。2.6.3统计方法所有统计学数据均用SPSS17.0软件进行分析，用GrapHPadPrism5软件绘图，Westernblot胶片扫描后用ImageJ软件计算灰度值后再用SPSS对数据进行统计分析，各指标用均值±标准差来表示。所有数据通过单因素方差分析比较组间差异的显著性，以P<0.05为差异有统计学意义。28 第三章实验结果第三章实验结果第一节香菇菌多糖对炎性肠病治疗作用研究的实验结果3.1.1香菇菌多糖对炎性肠病小鼠体重的影响本试验所建立的三种炎性肠病小鼠模型，即5%DSS诱导的C57BL/6小鼠溃疡性结肠炎急性期模型、1%DSS诱导的C57BL/6小鼠溃疡性结肠炎慢性期模型和TNBS诱导的BALB/c小鼠克罗恩病模型。如图3.1.1所示，在开始建模后，模型对照组小鼠体重呈明显下降趋势，而阳性对照组和香菇菌多糖低、中、高剂量组小鼠体重均有所恢复；与模型对照组相比，香菇菌多糖各剂量组和阳性对照组体重均大于模型对照组；与阳性对照组相比，香菇菌多糖高剂量组体重大于阳性对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果表明，香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期、溃疡性结肠炎慢性期和克罗恩病小鼠的体重下降有明显恢复作用，且效果优于阳性药SASP。图3.1.1香菇菌多糖对炎性肠病小鼠体重的影响A．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠体重的影响；B．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠体重的影响；C．香菇菌多糖对克罗恩病小鼠体重的影响。*，P＜0.05；**，P＜0.01。29 第三章实验结果3.1.2香菇菌多糖对炎性肠病小鼠疾病活动指数的影响各模型中，正常对照组小鼠行为活跃，毛色发亮，皮毛光滑；模型对照组小鼠精神萎靡，懒动，皮毛粗糙无光泽，尤其克罗恩病模型小鼠呈现毛发竖立、身体蜷缩的情况，而阳性对照组以及香菇菌多糖低、中、高组小鼠一般活动状况良好，皮毛光滑，毛色发亮，食欲好转。溃疡性结肠炎急性期模型中，在给予DSS后的第2天发现，造模小鼠均有腹泻或软便情况出现，模型对照组小鼠从第3天开始持续性腹泻，且肉眼可见血便。给药3天起，阳性对照组和香菇菌多糖高、中剂量组小鼠脓血便和粘液便逐渐消失，大便成型，低剂量组小鼠粪便轻度松软。溃疡性结肠炎慢性期模型中，在给予DSS第2天后，造模小鼠有软便情况出现，给予DSS第5天，模型对照组小鼠为腹泻或软便情况，部分小鼠可见轻微血便。香菇菌多糖组和阳性对照组未见腹泻情况出现，大便成型。克罗恩病模型中，给予TNBS造模第2天即发现造模小鼠出现稀便、血便情况，给药3天后，模型组小鼠仍然持续腹泻，血便情况较为严重，乙醇对照组小鼠腹泻情况有所恢复，香菇菌多糖组小鼠腹泻、血便发生率与模型对照组相比明显降低，小鼠一般状态好，较为活跃。结果表明，香菇菌多糖可以改善溃疡性结肠炎急性期、慢性期以及克罗恩病小鼠的一般活动状况、腹泻情况和血便的发生。针对体重下降和粪便情况对小鼠疾病活动指数进行评分，结果如图3.1.2所示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠疾病活动指数评分明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组相比，香菇菌多糖各剂量组和阳性对照组疾病活动指数评分均明显降低；与阳性对照组相比，香菇菌多糖高剂量组疾病活动指数评分均低于阳性对照组，溃疡性结肠炎急性期和克罗恩病模型中香菇菌多糖中剂量组疾病活动指数也低于阳性对照组；与香菇菌多糖低剂量组相比，高剂量组疾病活动指数评分低于低剂量组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，香菇菌多糖可以明显降低溃疡性结肠炎急性期和慢性期以及克罗恩病小鼠的疾病活动指数评分，且效果优于阳性药SASP。30 第三章实验结果图3.1.2香菇菌多糖对炎性肠病小鼠疾病活动指数的影响A．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠疾病活动指数的影响；B．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠疾病活动指数的影响；C．香菇菌多糖对克罗恩病小鼠疾病活动指数的影响。*，P＜0.05；**，P＜0.01。3.1.3香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠长度的影响如图3.1.3所示，各模型中，与正常对照组相比，模型对照组结直肠明显缩短；与模型对照组相比，香菇菌多糖低、中、高剂量组结直肠长度均明显长于对模型对照组，此外，阳性对照组小鼠结直肠也明显长于模型对照组，但明显短于香菇菌多糖高剂量组结直肠长度；香菇菌多糖各剂量之间结直肠长度进行比较，各模型中高剂量组结直肠明显长于低剂量组，溃疡性结肠炎急性期模型中香菇菌多糖中剂量组结直肠明显也长于低剂量组，克罗恩病模型中高剂量组结直肠明显长于中剂量组（P<0.05）。结果表明，香菇菌多糖可明显恢复溃疡性结肠炎急性期和慢性期以及克罗恩病小鼠的结直肠长度，高剂量组效果明显优于阳性药SASP。31 第三章实验结果图3.1.3香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠长度的影响A．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠长度的影响；B．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠结直肠长度的影响；C．香菇菌多糖对克罗恩病小鼠结直肠长度的影响。*，P＜0.05；**，P＜0.01。3.1.4香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠大体形态的影响结肠黏膜大体形态观察如图3.1.4左图所示，正常对照组小鼠黏膜皱壁整齐光滑。溃疡性结肠炎急性期模型中，模型对照组小鼠黏膜皱襞消失，黏膜弥漫性充血、水肿，血管纹理紊乱，肠腔中有大量粘液或脓血分泌物，可见糜烂和溃疡形成，溃疡面较大，界限清楚，炎症反应明显，有些小鼠肠壁出现增厚，并与周围组织粘连；溃疡性结肠炎慢性期模型中，模型对照组小鼠黏膜苍白、粗糙有颗粒感，有浅表溃疡形成，部分黏膜充血、水肿；克罗恩病模型中，模型对照组小鼠结肠可见明显的节段性溃疡伴充血、水肿，黏膜糜烂，甚者出现黑褐色坏死组织，更严重的则出现肠道穿孔，偶见巨结肠出现，肠壁增厚，远端肠管变狭窄。阳性对照组和香菇菌多糖各剂量组小鼠结直肠大体病变明显轻于模型组，尤其香菇菌多糖中、高剂量组恢复作用更明显。大体形态评分结果如图3.1.4右图所示，模型对照组评分值明显升高；阳性对照组和香菇菌多糖低、中、高剂量组评分值明显低于模型对照组；高剂量组病变评分明显低于阳性对照组，克罗恩病模型中中剂量组评分也明显低于阳性对照组；香菇菌多糖各剂量组之间比较，溃疡性结肠炎急性期和慢性期模型中高剂量组评分明显低于低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结果表明，32 第三章实验结果香菇菌多糖可明显恢复溃疡性结肠炎急性期、溃疡性结肠炎慢性期和克罗恩病小鼠结直肠组织的黏膜溃疡情况，从而发挥抗炎作用。图3.1.4香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠大体形态的影响及评分A．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠大体形态的影响及评分；B．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠结直肠大体形态的影响及评分；C．香菇菌多糖对克罗恩病小鼠结直肠大体形态的影响及评分。*，P＜0.05；**，P＜0.01。33 第三章实验结果3.1.5香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠组织损伤的影响显微镜下观察小鼠结肠黏膜组织，如图3.1.5左图所示，正常对照组小鼠结肠组织结构规则，黏膜层、黏膜下层和肌层及浆膜层均完整，结肠各层结构清晰，腺体排列整齐，可见较少炎细胞浸润。模型对照组小鼠结肠黏膜损坏较为严重，黏膜上皮细胞脱落，黏膜内腺体排列紊乱、变形甚至缺失，隐窝脓肿形成，伴有充血、水肿，可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，其中溃疡性结肠炎急性期和克罗恩病模型以中性粒细胞浸润为主，溃疡性结肠炎慢性期以淋巴细胞浸润为主，克罗恩病模型小鼠结肠组织出现肉芽肿形成。阳性对照组和香菇菌多糖低剂量组局部黏膜上皮脱落，轻度充血、水肿，可见少量炎性细胞浸润；香菇菌多糖中、高剂量组小鼠病变明显减轻，溃疡愈合，黏膜完整，炎性细胞浸润较模型组明显减少。组织损伤评分结果如图3.1.5右图所示，模型对照组结直肠组织损伤评分值明显高于正常对照组；与模型对照组相比，香菇菌多糖低、中、高剂量和阳性对照组的组织损伤评分均明显降低；与阳性对照组相比，香菇菌多糖高剂量组评分明显降低；香菇菌多糖各剂量组之间比较，高剂量组评分明显低于低剂量组，差异具有统计学意义（P<0.05，参考图3.1.5右图）。结果表明，香菇菌多糖可明显减轻溃疡性结肠炎急性期和慢性期以及克罗恩病小鼠结直肠组织损伤，减少黏膜脱落坏死和炎细胞浸润程度，效果优于阳性药SASP。34 第三章实验结果图3.1.5香菇菌多糖对炎性肠病小鼠结直肠组织损伤的影响及评分A．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠组织损伤的影响及评分；B．香菇菌多糖对溃疡性结肠炎慢性期小鼠结直肠组织损伤的影响及评分；C．香菇菌多糖对克罗恩病小鼠结直肠组织损伤的影响及评分。*，P＜0.05；**，P＜0.01。第二节香菇菌多糖对炎性肠病预防作用研究的实验结果3.2.1香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠体重的影响在DSS诱导建模前，对小鼠进行香菇菌多糖预防性给药，结果如图3.2.1所35 第三章实验结果示，可见香菇菌多糖组小鼠体重略高于未给药组。给药7天后开始给予DSS自由饮用，建立溃疡性结肠炎急性期模型，发现模型组小鼠体重下降明显，显著低于正常对照组体重；而香菇菌多糖预防性给药组体重下降不明显，体重明显高于模型组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖预防性给药可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻。图3.2.1香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠体重的影响**，P＜0.01。3.2.2香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠一般状况和疾病活动指数的影响从开始给予DSS诱导建模起，模型组小鼠表现出精神萎靡，少食懒动，皮毛粗糙的状态，逐渐出现腹泻、血便情况；而香菇菌多糖预防性给药组小鼠相对活跃，皮毛光滑，仅出现轻微软便情况，未见明显血便。对小鼠进行疾病活动指数评分，如图3.2.2所示，模型组小鼠评分值明显升高，而香菇菌多糖预防性给药组疾病活动指数评分与模型组相比明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖预防性给药可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的一般活动状况，降低疾病活动指数评分。36 第三章实验结果图3.2.2香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠疾病活动指数的影响**，P＜0.01。3.2.3香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠长度的影响剖取小鼠结、直肠进行测量比较，结果如图3.2.3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠结直肠长度明显缩短，而香菇菌多糖预防性给药组小鼠结直肠长度明显长于模型组，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠长度的缩短有显著的改善作用。图3.2.3香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠长度的影响**，P＜0.01。3.2.4香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠大体形态的影响结直肠组织大体形态观察如图3.2.4所示，正常对照组小鼠的结肠黏膜皱壁整齐光滑；模型组小鼠肠腔内有大量粘液或脓血分泌物，黏膜皱襞消失，有糜烂和溃疡形成，溃疡面较大，界限清楚，黏膜弥漫性充血、水肿，并与周围组织粘连；而香菇菌多糖预防性给药组小鼠结肠黏膜皱襞完整，多数无明显溃疡形成，个别仅存在浅表溃疡，且溃疡面小。结直肠大体形态评分结果显示，模37 第三章实验结果型组评分明显高于正常对照组，而香菇菌多糖预防性给药组评分与模型组相比明显降低。表明香菇菌多糖预防性给药可以明显改善溃疡性结肠炎小鼠的结肠黏膜溃疡情况，减轻炎症，降低损伤评分。图3.2.4香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠大体形态的影响及评分**，P＜0.01。3.2.5香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠组织损伤的影响显微镜下观察小鼠结肠黏膜组织，结果如图3.2.5所示，正常对照组小鼠结肠组织各层结构均完好，黏膜层腺体排列整齐；模型组小鼠结肠黏膜损坏较为严重，黏膜上皮细胞严重脱落，黏膜内腺体结构变形、排列杂乱，溃疡伴有充血、水肿，可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，以中性粒细胞浸润为主；香菇菌多糖预防性给药组小鼠病变明显减轻，溃疡愈合，局部黏膜上皮细胞脱落，炎性细胞浸润较模型组明显减少。组织损伤评分结果显示，模型组结直肠组织损伤评分值明显比正常对照组升高，香菇菌多糖预防性给药组的组织损伤评分明显低于模型组，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖预防性给药可明显减轻溃疡性结肠炎小鼠结直肠组织损伤，减少黏膜脱落坏死和炎细胞浸润程度。图3.2.5香菇菌多糖预防性给药对溃疡性结肠炎急性期小鼠结直肠大体形态的影响及评分**，P＜0.01。38 第三章实验结果第三节香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌作用研究的实验结果3.3.1香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠一般状况和体重的影响结肠炎相关结肠癌模型中，小鼠自AOM/DSS诱导建模起体重即呈明显下降趋势，DSS饮用期间模型小鼠精神不振，活动减少，皮毛粗糙无光泽，出现腹泻、血便情况；撤去DSS后，腹泻情况逐渐恢复，便血逐渐消失；从建模第3周期开始给药后，模型组小鼠体重持续下降，腹泻、血便情况日渐严重，部分小鼠出现脱肛现象，而香菇菌多糖组小鼠体重逐渐开始有所恢复，一般活动状况明显优于模型组。终末点体重变化统计结果如图3.3.1所示，模型组小鼠体重降低，明显低于正常对照组小鼠，而香菇菌多糖组体重恢复，明显高于模型组小鼠，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖可以明显改善小鼠在炎性肠病向结肠癌转变过程中的一般活动状况及体重下降情况。图3.3.1香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠体重变化的影响**，P＜0.01。3.3.2香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠肿瘤形成的影响剖取小鼠结、直肠组织发现，正常对照组小鼠的结直肠黏膜完整且光滑；模型组小鼠肠腔有大量粘性分泌物，从肛门处肠黏膜增厚，形成大量肿瘤，且瘤体积较大，分布密集，面积较大；香菇菌多糖组小鼠诱发的肿瘤主要分布在距肛门3~6cm处，且肿瘤数目明显减少，瘤体积较小，肿瘤较分散，分布面积小（参考图3.3.2）。结果表明，香菇菌多糖可以明显抑制小鼠在炎性肠病向结肠癌转变过程中的肿瘤形成。39 第三章实验结果图3.3.2香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠肿瘤形成的影响**，P＜0.01。3.3.3香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠结肠组织病理变化的影响显微镜下观察小鼠结肠组织HE切片，如图3.3.3所示，正常对照组小鼠的结肠组织结构规则，腺体排列整齐；模型组小鼠结肠黏膜非典型增生，正常组织结构消失，形成大量的肿瘤，腺腔扩大，内含较多坏死性分泌物，核体积变大，深染，核异型分裂，大量中性粒细胞浸润；香菇菌多糖组小鼠仍存在正常的结肠组织结构，局部有腺瘤形成，面积较小，中性粒细胞浸润程度明显减轻。图3.3.3香菇菌多糖对结肠炎相关结肠癌小鼠结肠组织病理变化的影响第四节香菇菌多糖治疗炎性肠病作用机制研究的实验结果3.4.1钙流检测香菇菌多糖对炎症因子激活的TLR4信号通路的抑制作用基于抗原刺激能够引起胞内钙流与TLR4信号通路有关，通过急性腹膜炎小鼠腹腔总炎症因子刺激巨噬细胞RAW264.7产生钙流信号，检测香菇菌多糖是否对TLR4信号通路活化存在抑制作用。结果如图3.4.1所示，腹腔炎症因子刺激RAW264.7细胞可以激发其产生较高的瞬时钙流信号，而与香菇菌多糖孵育过的细胞则在腹腔炎症因子的刺激下产生的钙流信号明显降低。因此推测，香40 第三章实验结果菇菌多糖可以抑制TLR4信号通路的活化。图3.4.1香菇菌多糖对RAW264.7细胞钙流信号的影响**，P＜0.01。3.4.2香菇菌多糖对NF-κB活性的抑制作用3.4.2.1双荧光素酶报告基因检测香菇菌多糖对NF-κB转录活性的抑制作用NF-κB作为一种TLR下游信号分子，在炎症及免疫反应的发生过程中具有重要作用。香菇菌多糖对NF-κB转录调控的作用结果如图3.4.2.1所示，LPS刺激RAW264.7细胞可以明显激活NF-κB的转录活性，转录活性升高约2.7倍；与香菇菌多糖（0.5、1mg/mL）共同孵育的细胞NF-κB转录活性明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖可以明显降低由LPS诱导的NF-κB转录活性。图3.4.2.1香菇菌多糖对RAW264.7细胞NF-κB转录活性的影响**，P＜0.01。41 第三章实验结果3.4.2.2Westernblot检测香菇菌多糖对NF-κB核转位的抑制作用由于NF-κB需磷酸化后转运入核才能调控相应的基因表达，因此通过Westernblot方法检测核内磷酸化NF-κB的含量变化，来验证香菇菌多糖对NF-κB激活的抑制作用。结果如图3.4.2.2所示，LPS刺激后，核内pNF-κB的表达水平明显升高；经香菇菌多糖（0.5、1mg/mL）处理的细胞pNF-κB核表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖明显抑制了磷酸化NF-κB的入核转运。图3.4.2.2Westernblot检测香菇菌多糖对RAW264.7细胞pNF-κB核转位的影响**，P＜0.01。3.4.2.3免疫荧光检测香菇菌多糖对NF-κB核转位的抑制作用通过免疫荧光的方法，可以更直接的观察到NF-κB在细胞核内外的分布情况。结果如图3.4.2.3所示，不作任何处理时，NF-κB基本在胞浆表达；经LPS刺激后，NF-κB在核内的表达明显升高，胞浆表达减少；经香菇菌多糖（1mg/mL）处理的细胞与单加LPS刺激组相比，NF-κB核表达明显降低，而胞浆表达量升高。对镜下视野中细胞NF-κB的入核率进行统计，结果显示，LPS刺激后NF-κB入核率明显升高，而给药香菇菌多糖组NF-κB入核率明显下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖明显抑制了NF-κB从胞浆到胞核的转运，进一步验证了Westernblot检测结果。42 第三章实验结果图3.4.2.3免疫荧光检测香菇菌多糖对RAW264.7细胞NF-κB核转位的影响**，P＜0.01。3.4.2.4免疫组化分析香菇菌多糖对NF-κB核转位的抑制作用对溃疡性结肠炎急性期小鼠结肠组织进行NF-κB免疫组化染色，结果如图3.4.2.4所示，正常对照组结肠组织中NF-κB表达较少，仅少量在胞浆表达；模型对照组结肠组织中NF-κB表达量明显升高，且多在细胞核内表达；香菇菌多糖各剂量组和阳性对照组NF-κB表达量降低，尤其以香菇菌多糖高剂量组作用最为明显。对镜下视野中NF-κB的核阳性率进行统计，结果显示，模型对照组NF-κB核阳性率明显升高，而香菇菌多糖高、中、低剂量组和阳性对照组NF-κB核阳性率明显下降，且香菇菌多糖中、高剂量组核阳性率明显低于阳性对照组和香菇菌多糖低剂量组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，香菇菌多糖明显抑制了溃疡性结肠炎急性期小鼠结肠组织中NF-κB的入核转运，进一步从组织学水平上验证了香菇菌多糖对NF-κB信号通路的抑制作用，且其效果优于阳性药SASP。图3.4.2.4免疫组化分析香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急性期小鼠结肠组织中NF-κB核转位的影响*，P＜0.05；**，P＜0.01。43 第三章实验结果3.4.3香菇菌多糖对细胞因子表达水平的抑制作用3.4.3.1抗体芯片检测香菇菌多糖对多种细胞因子表达水平的抑制作用对40种细胞因子进行细胞因子抗体芯片定量检测，荧光扫描图如图3.4.3.1A所示，香菇菌多糖处理组中多种细胞因子荧光强度相对于LPS刺激组明显减弱。对数据进行统计分析，结果显示香菇菌多糖对其中20种细胞因子的表达水平有明显抑制作用，尤其以IL-13和CD30L作用最为显著，如图3.4.3.1B所示。针对这20种细胞因子进行聚类分析，聚类图如图3.4.3.1C所示，对照组和香菇菌多糖组聚成一类，而和LPS刺激组明显区分开，说明香菇菌多糖作用后这些细胞因子表达水平趋于正常。结果表明，香菇菌多糖可以抑制多种细胞因子的过量表达，从而降低炎症反应，减轻组织损伤。图3.4.3.1抗体芯片检测香菇菌多糖对多种细胞因子表达水平的抑制作用44 第三章实验结果3.4.3.2免疫组化分析香菇菌多糖结肠炎相关结肠癌小鼠肿瘤标志物和炎症因子表达的抑制作用通过免疫组化的方法，分析香菇菌多糖对结肠癌肿瘤标志物CEA、CK8、CK18、p53和炎症因子IL-13、CD30L在结肠组织中表达情况的影响。结果如图3.4.3.2所示，正常对照组结肠粘膜组织中可见CEA、CK8、CK18、p53、IL-13和CD30L少量表达或几乎不表达；与模型组小鼠相比，香菇菌多糖组小鼠结肠粘膜组织中可见结肠癌肿瘤标志物CEA、CK8、CK18、p53表达量明显降低，蛋白染色强度下降，同时炎症因子IL-13和CD30L表达量也明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，香菇菌多糖可以降低结肠癌肿瘤标志物CEA、CK8、CK18、p53的表达，与其对炎症因子IL-13和CD30L表达的抑制作用呈正相关，提示香菇菌多糖可能通过抑制炎症因子产生而进一步抑制肿瘤的形成。图3.4.3.2免疫组化分析香菇菌多糖结肠炎相关结肠癌小鼠肿瘤标志物和炎症因子表达的抑制作用**，P<0.01。45 第四章讨论第四章讨论炎性肠病已逐渐成为我国消化科常见的难治性疾病，目前尚无有效治疗手段，临床上常用柳氮磺胺吡啶和糖皮质激素进行治疗，但其毒副作用较大而且容易复发。因此，减轻或避免治疗炎性肠病药物的副作用，使得抗炎性肠病药物的开发非常迫切。天然多糖具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等重要生理活性，其与化疗药物联用可以发挥增效减毒的作用。香菇菌多糖作为一种重要的真菌多糖，是CFDA批准上市的抗肿瘤药物，目前在临床上广泛用于各型急、慢性肝炎治疗，恶性肿瘤辅助治疗，以及其他因免疫功能低下引起的各种疾病。近[41]年来，香菇菌多糖已被证实可以治疗炎性肠病，然而研究仅限于其对溃疡性结肠炎急性期的治疗作用，而对其他类型的炎性肠病，如溃疡性结肠炎慢性期和克罗恩病以及结肠炎相关的结肠癌的作用及确切分子机制并不清楚。本课题从体内和体外水平上，全面研究了香菇菌多糖对炎性肠病的不同类型、不同病程以及相关结肠癌的治疗作用，并深入探讨其作用机制。[42]炎性肠病的特点是病程反复，急性期、慢性期交替发作，迁延不愈，而[43,44]且容易引起多种并发症并诱发结肠癌。关于炎性肠病动物模型的建模方法有多种，如乙酸诱导法、二硝基氯苯诱导法、角叉菜胶诱导法、DSS诱导法、TNBS诱导法、基因敲除和转基因诱导等，其中DSS自由饮用及TNBS和乙醇灌肠致炎作为经典方法广泛用于两种炎性肠病类型的药物筛选。DSS模型方法简单，可操作性强，且成功率高，重复性好，通过其自身负电荷影响了DNA的合成，抑制上皮细胞增生，破坏肠黏膜屏障，导致巨噬细胞功能障碍和肠道菌群失调。[45]该模型病理特点与人类溃疡性结肠炎极为相似，已报道可通过不同浓度或不[46]同饮用周期的DSS分别模拟急性和慢性溃疡性结肠炎。而TNBS联合乙醇灌[47]肠诱导的结肠炎模型与人类克罗恩病的病理学特征相近，利用乙醇破坏肠黏膜屏障，而TNBS作为一种半抗原，与肠黏膜中的有关组织蛋白结合形成全抗原，引起免疫反应，导致炎症的发生。本研究通过5%DSS自由饮用8天诱导溃疡性结肠炎急性期，1%DSS自由饮用21天诱导溃疡性结肠炎慢性期，120mg/kgTNBS、50%乙醇溶液一次性灌肠诱导克罗恩病，证实了香菇菌多糖对溃疡性结肠炎急、慢性期和克罗恩病的治疗作用，且其效果明显优于阳性药柳氮磺胺吡啶，可以明显改善疾病小鼠的体重减轻和腹泻情况，恢复小鼠结直肠长度，减少肠黏膜溃疡和炎细胞浸润程46 第四章讨论度，降低肠道炎症损伤。通过香菇菌多糖预防性给药再进行DSS诱导溃疡性结肠炎，证实了香菇菌多糖对溃疡性结肠炎的发生有预防作用。此外，长期的炎症刺激会导致肿瘤的形成与生长，炎性肠病患者结肠癌发病率升高就是一个最典型的例子。本研究通过致癌剂AOM诱导突变损伤，再加以DSS持续性炎症刺激，建立结肠炎相关结肠癌模型，证实了香菇菌多糖可以抑制炎性肠病向结直肠癌的发展，减少结直肠组织的不典型增生以及肿瘤的形成。以上研究表明，香菇菌多糖可开发为临床上疗效确切、毒副作用低的治疗和炎性肠病以及结肠炎相关结肠癌的药物。炎性肠病的发生通常与免疫异常有着密切的关系，而TLR4/NF-κB是免疫反应和炎症反应中的一个重要信号通路。研究显示，在IBD患者和实验性炎性肠[48]病动物的结直肠黏膜细胞中均可发现NF-κB被激活，因此NF-κB成为了IBD相关药物治疗的研究热点。由于NF-κB的激活被认为是香菇多糖治疗炎性肠病[49]的原因，而NF-κB又是TLR4的下游信号分子，所以我们推测，香菇菌多糖作为一种高分子量的多糖，可能通过其糖链干扰TLR4胞外糖链与配体的识别与结合，进而影响下游信号的传导及NF-κB的激活。由于TLR4激活可导致下游[50,51]钙离子通道开放，导致细胞钙离子内流。因此，我们以腹膜炎小鼠的腹腔液模拟炎症因子配体群刺激细胞产生钙离子内流，通过钙流检测证实了香菇菌多糖可以抑制炎症因子激活的钙流信号，说明香菇菌多糖对TLR4信号通路有干扰作用。进一步研究通过Westernblot、细胞水平免疫荧光和组织水平免疫组化染色，证实了香菇菌多糖抑制了NF-κB的核转位；通过双荧光素酶报告基因检测，证实了香菇菌多糖抑制了NF-κB的转录活性，表明香菇菌多糖可以抑制TLR4/NF-κB信号通路。NF-κB通过促进多种细胞因子的基因表达进而影响炎性肠病的病变，而这些细胞因子或直接参与肠道黏膜炎症反应，或激活其他细胞因子参与炎症反应，或破坏肠上皮细胞，损害肠黏膜屏障，进一步放大炎症反应，或募集炎性细胞[43]如巨噬细胞、中性粒细胞迁移至炎症部位，引起黏膜损伤。以往研究一般仅针对一个或几个细胞因子作ELISA检测，难以全面评价多种细胞因子之间复杂的作用。本研究采用细胞因子抗体芯片的方法，一次实验可检测40种细胞因子，以明确香菇菌多糖在炎性肠病治疗中所影响的细胞因子群。结果显示，香菇菌多糖明显降低了多种细胞因子的表达水平，尤其对IL-13和CD30L的作用最为明显。其中，IL-13可以通过影响肠上皮细胞凋亡，破坏上皮细胞紧密连接，损47 第四章讨论害肠黏膜屏障而引发炎性肠病，且由于它具有基因多态性，导致发生炎性肠病[52,53]和相关结肠癌的风险更高。而CD30L是肿瘤坏死因子家族的成员之一，它[54]对炎性肠病的控制有着重要作用。此外，对结肠炎相关结肠癌小鼠结肠组织切片的免疫组化结果显示，给药香菇菌多糖后，几种重要的结肠癌肿瘤标志物CEA、CK8、CK18、p53表达量明显降低，同时细胞因子IL-13和CD30L表达量也明显降低，提示香菇菌多糖通过对以IL-13和CD30L为主的细胞因子群蛋白表达的抑制作用而发挥治疗炎性肠病的作用，并可进一步抑制炎症向肿瘤的转化。总之，本研究证实了香菇菌多糖可通过干扰TLR4信号通路，抑制下游钙流产生和NF-κB激活，进一步抑制以IL-13和CD30L为主的细胞因子群表达，即香菇菌多糖通过抑制“TLR4—钙流、NF-κB—炎症因子”的途径从而预防和治疗炎性肠病，并抑制炎性肠病向结肠癌的转化，为炎性肠病以及结肠炎相关结肠癌的治疗提供了一个新的依据。香菇菌多糖片在抗肿瘤治疗和增强免疫功能等方面已经拥有多年的临床应用历史，无明显毒性和副作用产生，安全性明确；本研究表明香菇菌多糖对两种炎性肠病类型，即溃疡性结肠炎和克罗恩病，及其不同发病期，均有明显的治疗作用，并可抑制炎性肠病向肿瘤的转化，适应证较广泛；而且香菇菌多糖提取方便，生产工艺成熟，可快速的投入生产并获得高效制剂。所以，将香菇菌多糖开发成治疗炎性肠病的药物有着非常重要的临床意义和应用前景。48 参考文献参考文献[1]IngersollSA,AyyaduraiS,CharaniaMA,etal.(2012)TheroleandpathopHysiologicalrelevanceofmembranetransporterPepT1inintestinalinflammationandinflammatoryboweldisease.AmJPHysiolGastrointestLiverPHysiol302:G484-492.[2]BoumaG,StroberW.(2003)Theimmunologicalandgeneticbasisofinflammatoryboweldisease.NatRevImmunol3:521-533.[3]LoftusEV,Jr.(2004)Clinicalepidemiologyofinflammatoryboweldisease:Incidence,prevalence,andenvironmentalinfluences.Gastroenterology126:1504-1517.[4]LiuTC,StappenbeckTS.(2016)GeneticsandPathogenesisofInflammatoryBowelDisease.AnnuRevPathol.[5]CoussensLM,WerbZ.(2002)Inflammationandcancer.Nature420:860-867.[6]KaserA,ZeissigS,BlumbergRS.(2010)Inflammatoryboweldisease.AnnuRevImmunol28:573-621.[7]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.(2011)Globalcancerstatistics.CACancerJClin61:69-90.[8]TenesaA,DunlopMG.(2009)Newinsightsintotheaetiologyofcolorectalcancerfromgenome-wideassociationstudies.NatRevGenet10:353-358.[9]TerzicJ,GrivennikovS,KarinE,etal.(2010)Inflammationandcoloncancer.Gastroenterology138:2101-2114e2105.[10]BaumgartDC,CardingSR.(2007)Inflammatoryboweldisease:causeandimmunobiology.Lancet369:1627-1640.[11]LoftusEV,Jr.,SandbornWJ.(2002)Epidemiologyofinflammatoryboweldisease.GastroenterolClinNorthAm31:1-20.[12]LegakiE,GazouliM.(2016)Influenceofenvironmentalfactorsinthedevelopmentofinflammatoryboweldiseases.WorldJGastrointestPHarmacolTher7:112-125.[13]HalfvarsonJ,BodinL,TyskC,etal.(2003)InflammatoryboweldiseaseinaSwedishtwincohort:along-termfollow-upofconcordanceandclinicalcharacteristics.Gastroenterology124:1767-1773.[14]FarrellRJ,PeppercornMA.(2002)Ulcerativecolitis.Lancet359:331-340.[15]OguraY,BonenDK,InoharaN,NicolaeDL,ChenFF,etal.(2001)AframeshiftmutationinNOD2associatedwithsusceptibilitytoCrohn'sdisease.Nature411:603-606.[16]MaedaS,HsuLC,LiuH,etal.(2005)Nod2mutationinCrohn'sdiseasepotentiatesNF-kappaBactivityandIL-1betaprocessing.Science307:734-738.[17]WehkampJ,HarderJ,WeichenthalM,etal.(2004)NOD2(CARD15)mutationsinCrohn'sdiseaseareassociatedwithdiminishedmucosalalpHa-defensinexpression.Gut53:1658-1664.49 参考文献[18]BoudeauJ,BarnichN,Darfeuille-MichaudA.(2001)Type1pili-mediatedadherenceofEscherichiacolistrainLF82isolatedfromCrohn'sdiseaseisinvolvedinbacterialinvasionofintestinalepithelialcells.MolMicrobiol39:1272-1284.[19]WuHJ,WuE.(2012)Theroleofgutmicrobiotainimmunehomeostasisandautoimmunity.GutMicrobes3:4-14.[20]Darfeuille-MichaudA.(2002)Adherent-invasiveEscherichiacoli:aputativenewE.colipathotypeassociatedwithCrohn'sdisease.IntJMedMicrobiol292:185-193.[21]LabbeC,GoyetteP,LefebvreC,etal.(2008)MAST3:anovelIBDriskfactorthatmodulatesTLR4signaling.GenesImmun9:602-612.[22]HibiT,InoueN,OgataH,NaganumaM.(2003)Introductionandoverview:recentadvancesintheimmunotherapyofinflammatoryboweldisease.JGastroenterol38Suppl15:36-42.[23]TriantafillidisJK,MerikasE,GeorgopoulosF.(2011)Currentandemergingdrugsforthetreatmentofinflammatoryboweldisease.DrugDesDevelTher5:185-210.[24]NeumanMG.(2007)Immunedysfunctionininflammatoryboweldisease.TranslRes149:173-186.[25]ReddyKP,MarkowitzJE,RuchelliED,etal.(2007)Laminapropriaandcirculatinginterleukin-8innewlyandpreviouslydiagnosedpediatricinflammatoryboweldiseasepatients.DigDisSci52:365-372.[26]Lacruz-GuzmanD,Torres-MorenoD,PedreroF,etal.(2013)InfluenceofpolymorpHismsandTNFandIL1betaserumconcentrationontheinfliximabresponseinCrohn'sdiseaseandulcerativecolitis.EurJClinPHarmacol69:431-438.[27]LiangWD,LiJS,LiKS,etal.(2011)[AssociationofIL-8genepolymorpHismswithinflammatoryboweldiseaseinChinesepatients].ZhonghuaYiXueZaZhi91:1825-1829.[28]AbdullahM,RaniAA,SudoyoAW,etal.(2013)ExpressionofNF-kBandCOX2incolorectalcanceramongnativeIndonesians:theroleofinflammationincolorectalcarcinogenesis.ActaMedIndones45:187-192.[29]YuanS,ZhangJ,ZhangL,etal.(2013)ThearchaicrolesoftheampHioxusNF-kappaB/IkappaBcomplexininnateimmuneresponses.JImmunol191:1220-1230.[30]HaydenMS,GhoshS.(2004)SignalingtoNF-kappaB.GenesDev18:2195-2224.[31]BonizziG,KarinM.(2004)ThetwoNF-kappaBactivationpathwaysandtheirroleininnateandadaptiveimmunity.TrendsImmunol25:280-288.[32]RoglerG,BrandK,VoglD,etal.(1998)NuclearfactorkappaBisactivatedinmacropHagesandepithelialcellsofinflamedintestinalmucosa.Gastroenterology115:357-369.[33]AtreyaI,AtreyaR,NeurathMF.(2008)NF-kappaBininflammatoryboweldisease.JInternMed263:591-596.[34]NeurathMF.(1998)Pathogenesisofinflammatoryboweldisease:transcriptionfactorsinthespotlight.Gut42:458-459.[35]ChavezE,Castro-SanchezL,ShibayamaM,etal.(2012)SulfasalazinepreventstheincreaseinTGF-beta,COX-2,nuclearNFkappaBtranslocationandfibrosisinCCl4-inducedliver50 参考文献cirrhosisintherat.HumExpToxicol31:913-920.[36]SunilY,RamadoriG,RaddatzcD.(2010)InfluenceofNFkappaBinhibitorsonIL-1beta-inducedchemokineCXCL8and-10expressionlevelsinintestinalepithelialcelllines:glucocorticoidineffectivenessandparadoxicaleffectofPDTC.IntJColorectalDis25:323-333.[37]TzianabosAO.(2000)Polysaccharideimmunomodulatorsastherapeuticagents:structuralaspectsandbiologicfunction.ClinMicrobiolRev13:523-533.[38]VolmanJJ,RamakersJD,PlatJ.(2008)Dietarymodulationofimmunefunctionbybeta-glucans.PHysiolBehav94:276-284.[39]HaoT,WangYM,LiJJ,etal.(2012)EffectoflentinanagainstimmunosuppressionoflympHocytesculturedinsimulatedmicrogravityenvironment.ZhongguoShiYanXueYeXueZaZhi20:182-186.[40]MizunoM,NishitaniY,HashimotoT,etal.(2009)DifferentsuppressiveeffectsoffucoidanandlentinanonIL-8mRNAexpressionininvitrogutinflammation.BiosciBiotechnolBiochem73:2324-2325.[41]NishitaniY,ZhangL,YoshidaM,etal.(2013)Intestinalanti-inflammatoryactivityoflentinan:influenceonIL-8andTNFR1expressioninintestinalepithelialcells.PLoSOne8:e62441.[42]LiveraniE,ScaioliE,DigbyRJ,etal.(2016)Howtopredictclinicalrelapseininflammatoryboweldiseasepatients.WorldJGastroenterol22:1017-1033.[43]KlampferL.(2011)Cytokines,inflammationandcoloncancer.CurrCancerDrugTargets11:451-464.[44]FeaginsLA,SouzaRF,SpechlerSJ.(2009)CarcinogenesisinIBD:potentialtargetsforthepreventionofcolorectalcancer.NatRevGastroenterolHepatol6:297-305.[45]TaghipourN,MolaeiM,MosaffaN,etal.(2016)AnexperimentalmodelofcolitisinducedbydextransulfatesodiumfromacuteprogressestochronicityinC57BL/6:correlationbetweenconditionsofmiceandtheenvironment.GastroenterolHepatolBedBench9:45-52.[46]PerseM,CerarA.(2012)DextransodiumsulpHatecolitismousemodel:trapsandtricks.JBiomedBiotechnol2012:718617.[47]LvQK,LiuJX,LiSN,etal.(2015)MycopHenolateMofetilModulatesDifferentiationofTh1/Th2andtheSecretionofCytokinesinanActiveCrohn'sDiseaseMouseModel.IntJMolSci16:26654-26666.[48]YanH,WangH,ZhangX,etal.(2015)Ascorbicacidamelioratesoxidativestressandinflammationindextransulfatesodium-inducedulcerativecolitisinmice.IntJClinExpMed8:20245-20253.[49]YangSF,ZhuangTF,SiYM,etal.(2015)CoriolusversicolormushroompolysaccharidesexertimmunoregulatoryeffectsonmouseBcellsviamembraneIgandTLR-4toactivatetheMAPKandNF-kappaBsignalingpathways.MolImmunol64:144-151.[50]LetariO,NicosiaS,ChiavaroliC,etal.(1991)Activationbybacteriallipopolysaccharide51 参考文献causeschangesinthecytosolicfreecalciumconcentrationinsingleperitonealmacropHages.JImmunol147:980-983.[51]MartinL,PingleSC,HallamDM,etal.(2006)ActivationoftheadenosineA3receptorinRAW264.7cellsinhibitslipopolysaccharide-stimulatedtumornecrosisfactor-alpHareleasebyreducingcalcium-dependentactivationofnuclearfactor-kappaBandextracellularsignal-regulatedkinase1/2.JPHarmacolExpTher316:71-78.[52]WalczakA,PrzybylowskaK,DzikiL,etal.(2012)ThelL-8andIL-13genepolymorpHismsininflammatoryboweldiseaseandcolorectalcancer.DNACellBiol31:1431-1438.[53]EndoY,MarusawaH,KouT,etal.(2008)Activation-inducedcytidinedeaminaselinksbetweeninflammationandthedevelopmentofcolitis-associatedcolorectalcancers.Gastroenterology135:889-898,898e881-883.[54]SunX,SomadaS,ShibataK,etal.(2008)AcriticalroleofCD30ligand/CD30incontrollinginflammatoryboweldiseasesinmice.Gastroenterology134:447-458.52 致谢致谢时光飞逝，转眼间，三年紧张而又充实的研究生生活即将结束，百般不舍，倍感珍惜。三年的科研生活，我不仅拓宽了专业基本知识，掌握了一定科研技能，也培养了科研思路，更产生了浓厚的科研兴趣。此刻，在论文完成之际，我谨向给予我教导和帮助的所有老师以及同学们致以最衷心的感谢！感谢南开大学及天津国际生物医药联合研究院对我的培养，给我们提供良好的实验学习环境，使我们顺利完成实验。感谢我的导师杨诚教授，为我们提供良好的实验条件，对我们科研的指引，对我们学习的鼓励，对我们生活的关心。感谢我的指导老师刘艳荣老师，在科研思维上给予我正确引导，在科研学习上对我耐心指导，细心把关，甚至亲身示范教学，以及在生活上对我的无私关怀，您的知遇之恩和教导之情，我将永记于心。感谢孙涛老师对我课题思路的指导，给予我启发，避免我在科研上走弯路，您广博的科学文化知识以及不断迸发的科研灵感让我敬服，也感谢您为我们营造温馨的学习环境来更好地进行科研。感谢周红刚老师给我提供更多学习机会，让我在新药申报方面了解更多知识，并对我的科研思路进行指导。另外感谢荆学双老师在工作之余对我实验的帮助，感谢刘慧娟老师、陈双老师、许灿老师在实验和生活上不辞辛苦的帮助与支持，感谢实验室各位师兄、师姐的悉心指导。感谢我亲爱的小伙伴张敏、朱国红、任姣姣等对我实验的帮助以及生活上的关心，是你们与我一起分享了研究生生活的酸甜苦辣。感谢苑杰、闫雪琴和魏俊杰师妹对我的帮助，感谢实验室所有的兄弟姐妹们，谢谢你们的帮助。感谢我的父母，谢谢你们多年来对我学习及生活上最无私的关心与支持。最后，感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，感谢你们百忙之中抽出时间为我审阅论文，并提出宝贵意见。53 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果姓名：赵亚丽性别：女学历：硕士政治面貌：共青团员专业：微生物与生化药学导师：杨诚教授籍贯：河北省张家口市教育背景：2013.09-2016.07理学硕士南开大学微生物与生化药学2009.09-2013.06理学学士廊坊师范学院生物科学学术研究：1、香菇菌多糖用于炎性肠病治疗的研究。2、多西环素和香菇菌多糖复方制剂抗肿瘤作用的研究。学术成果1、申请国家专利一篇。香菇菌多糖的应用2、申请临床批件一项。香菇菌多糖治疗炎性肠病作用研究54