新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响

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分类号：密级：学号：２０１３１００２单位代码：１００９２巧户方净蔽ＨＥＢＥＩＮＯＲＴＨＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕±学位论文＊Ｆ３－ＨＮ的生物信息学分析新城疫病毒、抗瘤Ｉ功能初探及Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂对Ｆ３诱导ＥＣＡ１０９细胞網ｔ的影响ｒ？一单位：河化北方学院生命科学研究中心专业：病原生物学研究生独名：李冠华姑為及职称：刘开扬教授，导师２０－研究起止日期：１４．６２０１６．３提交日＾祖３＇＾ＩＩＩＩＩＦ０ 分类号：密级：单位代码：10092学号：20131002新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响单位：河北北方学院生命科学研究中心专业：病原生物学研究生姓名：李冠华导师姓名及职称：刘开扬教授研究起止日期：2014.6-2016.3提交日期：2016.3 河北北方学院学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北北方学院所有。河北北方学院有权对本学位论文进行交流、公开和使用。导师签名：研究生签名：年月日河北北方学院研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。导师签名：研究生签名：年月日 目录中文摘要…………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………………………4英文缩写…………………………………………………………………8研究论文新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响前言………………………………………………………………10材料与方法…………………………………………………………12结果………………………………………………………………31附图………………………………………………………………36附表………………………………………………………………43讨论………………………………………………………………44结论………………………………………………………………49参考文献……………………………………………………………50综述应用于抗肿瘤中的重组新城疫病毒………………………56致谢…………………………………………………………………67个人简历…………………………………………………………………68 研究论文新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响摘要随着医疗水平的不断提高，癌症的治疗受到越来越多的关注，溶瘤病毒为肿瘤的治疗及治愈提供了一个新的视角。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是溶瘤病毒中的一员。研究发现，NDV[1]在人类肿瘤细胞中的复制效率是正常细胞中的10000倍，其对肿瘤细胞的选择性杀伤作用使其成为潜在的肿瘤生物治疗因子。NDV为不分节段的单负链RNA病毒，属于副黏病毒科副黏病毒亚科的腮腺炎病属。主要受其感染的是禽类，可引起禽类呼吸道炎症，感染人类的概率极小，表现为轻微的结膜炎或温和的呼吸道症状，且为自限性疾病。已有研究结果提示，NDV溶瘤谱广且不良反应轻微，不同的NDV株系其抗肿瘤谱不同其抗肿瘤效果也不尽相同。在NDV外壳上的HN蛋白不仅可以识别唾液酸受体，而且还可以水解唾液酸受体，即它是一种同时具备两种功能的病毒刺突蛋白，在病毒吸附和感染细胞时发挥着重要作用。近年来随着RNA病毒基因工程的反向遗传学技术的不断完善，使得人们可以在cDNA水平上对病毒基因组进行改造和探索，我们实验室保存着一株抗肿瘤新城疫病毒NDV-HBNU/LSRC/F3，是具有强毒株裂解位点的NDV弱毒株。其抗肿瘤效果已被初步探索和证实，且也已经测定了其全基因组序列。研究F3的HN蛋白的结构和功能可以促进更好的认识和解读全病毒抗肿瘤等功能，同时继续探索F3诱导人食管癌ECA109细胞凋亡的信号通路。对更好掌握F3抗肿瘤机制，及更好的改造和发挥其抗肿瘤特性有着重要意义。HN基因及其编码蛋白GenBank的登录号分别为KC246549.1和AGL94562.1，首先利用蛋白质分析专家系统（ExPASy）提供的ProtParam、protscale、TMpred、Coil、MotifyScan及SWISS-MODEL等，NCBI上的CONSERVEDOMON及SMART、SignalP4.0、Bepipred1.0及NetCTL等和Bcepred、ABCpred、SOPMA、SYFPEITHI等生物信息学在线分析程序，结合PSORTIIPrediction、rasmol等生物信息学1 研究论文软件，分析、预测HN蛋白的主要特性及T/B细胞抗原表位等。提取F3的总RNA。据HN基因全长编码序列（登录号为KC246549.1）的开放阅读框架和载体C-flagpcDNA3的多克隆位点，设计带酶切位点的HN引物，两步法RT-PCR行目的片段的扩增，并将扩增产物克隆至真核表达载体C-flagpcDNA3的多克隆位点上，构建C-flagpcDNA3-F3/HN真核表达系统，重组质粒经细菌PCR、重组质粒双酶切、测序鉴定，将测序正确的重组质粒C-flagpcDNA3-F3/HN转染人食管癌ECA109细胞，转染后通过间接免疫荧光法和RT-PCR鉴定转染后细胞内HN蛋白和基因的表达，流式细胞仪测被重组质粒转染后肿瘤细胞的凋亡率。课题组前期研究已经证实NDVF3在体外诱导食管癌细胞凋亡时有caspase-8的激活，提示死亡受体途径可能在其诱导食管癌细胞凋亡中发挥着重要作用，因此我们在F3感染ECA109细胞后的36h内每隔4h收集细胞总蛋白一次，运用Western-blot法检测ECA109细胞被感染后细胞内的cleavedCaspase-3、cleavedPARP、FASL、FAS、FADD等蛋白的动态表达变化情况，来研究NDVF3体外诱导肿瘤细胞凋亡的信号通路中死亡受体途径变化情况，同时我们还运用全Caspase抑制剂Z-VAD-FMK观察抑制剂对NDVF3在体外诱导食管癌细胞凋亡的影响，以此观察Caspase依赖性凋亡途径在NDVF3体外诱导食管癌细胞凋亡中的作用。结果显示，扩增的HN基因约为1716bp，经序列分析该蛋白由571个氨基酸组成，分子式为C2766H4316N752O852S24，分子质量单位为62.5kDa,等电点理论值为6.24，HN蛋白富含无规则卷曲（Cc）和α-螺旋(Hh)的跨膜蛋白其主要定位在线粒体和胞质中，共有12个亲水性较高区域（参数得分≥1.9）、17个表面可及性较高区域（参数得分≥1.9）、9个柔韧性较高区域（参数得分≥2.0），36个翻译后修饰位点，17个潜在的B细胞表位，12个CTL表位和辅助性T细胞联合表位。将其克隆到C-flagpcDNA3载体的多克隆位点上后，测序结果经比对与Genbank上报告的HBNU/LSRC/F3株HN基因序列比对测序结果完全一致，将测序正确的重组质粒转染ECA109细胞，36h后转染重组质粒组的ECA109细胞胞质内可见黄绿色荧光，RT-PCR扩增到了HN的mRNA，2 研究论文而对照组则无，证明构建的重组质粒能在体外真核细胞内表达目的蛋白。经初步探索，重组质粒C-flagpcDNA3-F3/HN具有一定的抗肿瘤特性，转染48h时重组质粒组的ECA109细胞的凋亡率高于空质粒对照组。F3感染后ECA109细胞中检测到Fas及Fasl蛋白的表达，证实了F3诱导ECA109细胞凋亡通路FAS-FASL-FADD的存在，FADD蛋白的表达在感染后4h时达最多，4h后有递减趋势，而活化的caspase-3、PARP的表达则随感染时间的延长有递增趋势，加上课题组前期研究证实的相同浓度的F3诱导ECA109细胞凋亡时，caspase-8和caspase-9被活化激活，证实F3抗肿瘤途径中内源性凋亡通路和外源性凋亡通路共同发挥诱导肿瘤细胞凋亡作用；又因显微镜下观察到在感染F324h后全caspase抑制剂Z-VAD-FMK不能抑制F3诱导的ECA109细胞病变，提示F3抗肿瘤机制通过半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartatespecificproteinase,caspase）依赖性途径，同时可能也通过半胱氨酸蛋白酶非依赖性途径。本课题主要完成内容如下：第一，获得F3株HN蛋白的主要特性，为后期研究HN的结构与功能做好了理论基础；第二，实现了F3株HN蛋白的真核表达并初步探索其抗肿瘤特性；第三，进一步证实F3诱导细胞凋亡通过内源性及外源性caspase依赖性途径，24h后细胞又开始继续发生细胞病变现象，提示F3株诱导ECA109细胞凋亡可能有半胱氨酸蛋白酶依赖性途径，同时可能也有半胱氨酸蛋白酶非依赖性的凋亡通路。为进一步研究新城疫病毒抗肿瘤的作用机制，从而更好的改造和发挥其抗肿瘤特性奠定了基础。关键词：新城疫病毒；血凝素-神经氨酸酶；抗肿瘤；凋亡通路；半胱氨酸蛋白酶依赖性3研究论文 研究论文BIOINFORMATICANALYSISANDANTITUMORFUNCTIONOFNDVF3-HNANDTHEEFFECTOFCASPASEINHIBITIORONNDVF3-INDUCEDAPOPTOSISINECA109CELLSABSTRACTWiththesustaineddeveolpmentofthemedicaltreatment,thetherapyofcancerismoreandmoreattented,theoncolyticviruesprovideanewperspectiveforthetreatmentofcancer.Newcastlediseasevirus(NDV)isamemberoftheoncolyticvirues.ItshowsthatthereplicationofNDVin[1]humantumorcellsis10,000timesmoreeffectivethanthatinnormalcells.NDVbecomesapotentialagentincancerbiotherapyduetoitscidaleffectontumorcellsinrecentreseaches.NDVisansingle-strandednon-segmentednegative-senseRNAvirus,andbelongstoparamyxovirusfamily,paramyxovirussubfamily,avulavirusgenus.Itmainlyinfectspoultry,itcancausepoultryrespiratorydisease,anditinfectshumanonlyinrarecases,justaslightconjunctivitisormildrespiratorysymptomsanditisaself-limitingdisease.Itisreportedthat,NDVisabroadspectrumofoncolyticviruswithlittledamageandslightcomplicationsonhumanbody,SincedifferentNDVstrainshavedifferentantitumorspectrumandtheiranti-tumoreffectsarenotthesame.HNglycoproteinwhichonthesurfaceofvirus,notonlymediatestherecognitionofsialicacidconainingreceptors,butpossessesneuraminidaseactivity(NA)whichcancleavethesialicacidonthosereceptors.ThatistosaybothreceptorrecognitionandNAactivitiespossessedbythesameprotein,itisveryimportantforNDVtopossessthosetwoactivitiessoastobindandtoinfect.WiththesustainedimprovementofRNAvirusreversegenetistechniquesofgeneticengineeringinrecentyears.PeoplecantransformandexplorethevirusgenomeonthelevelofcDNA.NDVHBNU/LSRC/F3strainhasbeenstoredinourlaboratory,theantitumoreffectandmechanismhasbeenconfirmedandexploredinitially,andthewholegenomesequencehasbeensequenced.ItbelongstolowvirulentstrainsofNDVwithstrongcleavagesite.InordertounderstandandinterprettheantitumorfunctionofNDVF3better,wechoosetostudythestructureandfunctionofHNproteinofNDVF3,ItissignificanttoexploretheapoptosissignalpathwaysofesophagealECA109cellsinducedbyNDVF3,soastograsptheanti-tumormechanismofNDVF3better,andtoreconstandexertitsantitumorpropertiesbetter.4 研究论文TheaccessionNoofHNgeneanditsproteinontheGenBankareKC246549.1andAGL94562.1.Bytheuseofexpertsystemofproteinanalysis(ExPASy)providedbyProtParam,protscale,TMpred,Coil,MotifyScanandSWISS-MODEL,etc,andCONSERVEDOMONontheNCBIandSMART,SignalP4.0,Bepipred1.0andNetCTL,etc.andBcepred,ABCpred,SOPMA,SYFPEITHIonlinebioinformaticsanalysisprogram,combinedwiththePSORTIIPrediction,rasmolandotherbioinformaticssoftware,soastoanalyseandforecastthemajorcharacteristicandT/BcellepitopesoftheHNprotein.ThetotalRNAwasextractedfromNDVF3,accordingtothetheopenreadingframeoffull-lengthcodingsequenceofHNgene(AccessionNo.KC246549.1)andthemultiplecloningsitesofthec-flagpcDNA3vector,theprimersweredesignedwithrestrinctionsites.TheHNgenewasamplifiedbythetwostepreversetranscriptionPCR,theamplifiedproductswereclonedintothemultiplecloningsitesoftheeukaryoticc-flagpcDNA3vector,c-flagpcDNA3-NDVF3/HNeukaryoticexpressionsystemwasconstructedsuccessfully,therecombinantplasmidwasvalidatedbybacterialPCR,doubleenzymesrestrictionoftherecombinantplasmidandsequencing,Therecombinantplasmidc-flagpcDNA3NDVF3/HNwhichsequencedexactlyrightweretransfectedintoECA109cellswithlipofecterliposomaltransfectionregent.TheexpressionofproteinandthemRNAofNDVF3/HNweretestedviatheindirectimmunofluorescenceandRT-PCR,Theapoptosisrateoftumorcellstransfectedbytherecombinantplasmidwasmeasuredbymeansofflowcytometry.Sincewehavedemonstratedthatcaspase-8hasbeenactivatedinECA109cellsinfectedbyNDVF3invitroinourpreviousstudy,itwassuggestedthatthepathwayofdeathreceptormayplayaimportantroleintheapoptosisinECA109cellsinducedbyNDVF3.InordertostudytheroleofdeathreceptorpathwayinECA109cellsinfectedbyNDVF3invitro,wecollectedthetotalproteinofECA109cellsonceevery4hourwithin36hoursinfectedbyNDVF3,thedynamicexpressionofcleavedcasepase-3,cleavedPARP,FASL,FAS,FADDproteinsweredetectedbywesternblot.WealsoobservedtheeffctsofthecaspaseinhibitorontheapoptosisinECA109cellsinfectedbyNDVF3invitro,soastoobservetheeffectofcaspasedependentapoptosispathwayinECA109cellsinducedbyNDVF3invitro.TheresultshowedthattheRT-PCRproductofHNwas1716bp.Sequenceanalysisshowedthattheproteinconsistedof571aminoacids,themolecularformulawasC2766H4316N752O852S24,Theputativeproteinmolecularweightwas62.5kDa,thetheoreticalisoelectricpointwas6.24.HNproteinisatransmembraneproteinwhichrichedinrandomcurl(Cc)andalphahelix(Hh),5 研究论文anditmainlylocalizedinthemitochondriaandcytosol.Therewere12relativelyhighlyhydrophilicregion(Parameterscore≥1.9),17relativelyhighlysurfaceaccessibilityregion(Parameterscore≥1.9),9relativelyhighlyflexibilityregion(Parameterscore≥2.0).36modificationsitesofpost-translational.17potentialB-cellepitopes.12CTLepitopesandhelperTcellscombinedepitopes.Thenitwasclonedintothemultiplecloningsitesofc-flagpcDNA3eukaryoticexpressionvector,therewasnotamutationalnucleobasesinthesequencingresultcomparedwiththesequenceofHNgeneofNDVF3inGenBank;Therecombinantplansmidsc-flagpcDNA3-F3/HNwhichhasbeensequencedexactllyrightweretransfectedintoECA109cells.Theyellow-greenfluorescencewasobservedincellcytoplasmofrecombinatplasmidgroup36hoursaftertransfectedbythefluorescencemicroscope.ThemRNAofHNoftherecombinatplasmidgroupwasamplifiedbythereversetranscriptionPCRintheECA109cells48hoursaftertransfected,butnoneintheemptyplasmidsgroup,whichmeanedthattherecombinatplasmidwasabletoexpressthetargetproteininenkaryoticcells.Wealsoexploredtheantitumorpropertiesofc-flagpcDNA3-NDVF3/HN,theapoptosisrateofECA109cellsintherecomantplasmidgroupwashigherthanthatinthenullvectorgroup48hoursaftertransfected.SincetheproteinofFASandFASLhadbeendetectedinECA109cellsafterNDVF3infected,weconfirmedthatthepresenceofextrinsicapoptoticpathwayFAS-FASL-FADDinducedbyNDVF3.TheexpressionofFADDproteinreachedthemaximum4hoursafterinfected,therewasadescendingtrend4hoursafterinfected,whiletherewasarisingtrendintheexpressionofactivatedcaspase-3,PARPprotein,ourpreviousstudyshowedthatcaspase-8andcaspase-9hadbeenactivatedinECA109cellsinducedbythesameconcentrationofNDVF3.WeconfirmedthattheapoptosisinECA109cellsinducedbyNDVF3weremediatedthroughintrinsicandextrinsicapoptoticpathwaystogether.SincethecaspaseinhibitorZ-VAD-FMKdidnotinhibitthecytopathyeffectinECA109cellsinducedbyNDVF3completly24hoursafterinfectedundermicroscope,itwassuggestedthattheapoptoticpathwayofECA109cellsinducedbyNDVF3weremediatedthroughthecaspasedependentpathway,andmayalsothroughthecasepase-independentpathway.Themaincompletedcontentsofthisstudyareasfollow:firstly,wegotthemaincharachtersofHNproteinofNDVF3,layingthefundationoflatterunderstandthestructureandfunctionofHNprotein;sceondly,weachievedtheexpressionofHNproteinofNDVF3ineukaryoticexpressionsystermandexploreditsantitumorpropertiespreliminarily;thirdly,We6 研究论文confirmedthepresenceofextrinsicapoptoticpathwayofFAS-FASL-FADDinducedbyNDVF3andsincethecaspaseinhibitordidn’tinhibitethecytopathiceffectofECA109cells24hafterinducedbyNDVF3,itisprobablysuggestedthattherewillbecaspase-independentpathwayinducedbyNDVF3,whichwouldlaythefoundationoffullyunderstandingtheantitumormechanismofNDVF3,thustoreconstandexertitsantitumorpropertiesbetter.Keywords:Newcastlediseasevirus;Hemagglutinin-neuraminidase;Antitumor;Apoptoticpathway;Caspase-dependent7 英文缩写英文缩写ACRONYMNAMEINENGLISH中文全称NDVnewcastlediseasevirus新城疫病毒APMV-1avianparamyxovirustype1禽1型副黏病毒HNhaemagglutinin-neuraminidase血凝素-神经氨酸酶HAhemagglutinin红细胞吸附活性NAneuraminidase神经氨酸酶CDScodingsequence编码序列DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯BSAalbuminfrombovineserum牛血清白蛋白RT-PCRreversetranscription反转录聚合酶链式反应polymerasechainreactiondNTPsdeoxynucleosidetriphosphates脱氧核苷三磷酸Trishydroxymethylisothiocyanate三羟甲基氨基甲烷SPFspecificpathogenfree无特定病原体Ampampicillin氨苄青霉素FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素EDTAethylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸PBSphosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PMSFphenylmethylsulfonyfluoride苯甲基磺酰氯RPMI1640rooseveltparkmemorialRPMI1640培养基institutemediumWBwesternblot蛋白印迹SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TEMEDtetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TAEtris-acetate-bufferTris-乙酸电泳缓冲液PARPpolyADP-ribosepolymerase聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶AIFapoptosisinducingfactor凋亡诱导因子8 英文缩写MOImultiplicityofinfection感染复数CPEcytopathiceffect细胞病变效应FADDfas-associateddeathdomainFas相关死亡结构域蛋白proteinCaspasecysteineaspartylspecific天冬氨酸特异性半胱氨proteases酸蛋白酶9 研究论文新城疫病毒F3-HN的生物信息学分析、抗瘤功能初探及Caspase抑制剂对F3诱导ECA109细胞凋亡的影响前言肿瘤治疗的传统方法如化疗和放疗的局限性在于它对健康细胞的毒副作用及治疗效果的局限性。这两种治疗方法也可能会激活抗凋亡[2]信号的传导通路，阻止肿瘤细胞的凋亡，最后限制了治疗的功效。因此肿瘤的治疗迫切需要寻找一种可以特异性靶向恶性肿瘤细胞但又不损伤正常细胞的新方法。溶瘤病毒的基因治疗与传统的治疗方法相比因它的高效和低毒性，展示了一个非常有前景的治疗途径。为控制肿瘤提供了一个新的视角。新城疫病毒（(Newcastlediseasevirus,NDV）是溶瘤病毒中的一员[3][4]。溶瘤病毒只在肿瘤的微环境下和肿瘤内部表达和扩增它的基因，其对肿瘤细胞的选择性杀伤作用使其成为肿瘤生物治疗的因子。溶瘤病毒NDV在临床上被看作是一个非常有前景的试验性治疗已有50年历史了，如今，几株NDV：MTH-68，NDV-HUJ和PV701已经被用于肿瘤治疗的一期、二期临床实验，提示NDV是一个安全有效的肿瘤治[5]疗生物制剂。新城疫病毒是副黏病毒科，副黏病毒亚科，腮腺炎病毒属禽副黏病毒1型（APMV-1）唯一成员，是一种具有包膜，单股，不分节段的负链RNA病毒全长15kb，NDV基因组由六个开放阅读框架构成，分别编码核蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白（matrixprotein，M）、融合蛋白（fusionprotein，F）、血凝素-神经氨酸酶（haemagglutinin-neuraminidase，HN）以及大分子蛋白[6]（largeprotein，L）。而P基因又编码V与W两种蛋白。其基因组RNA是由NP，P，L的核糖核苷酸蛋白复合物构成的，三个病毒糖蛋[7]白HN，F和M脂质包膜包围住构成完整病毒。文献显示，NDV对结肠癌、骨肉瘤、胶质瘤、人卵巢癌、急性单核细胞白血病、乳腺癌[8-12]及人肺腺癌A549等肿瘤细胞的生长，有明显的抑制作用。10 研究论文NDV抗肿瘤的作用主要表现在两方面；第一，NDV可直接对肿瘤细胞产生细胞毒作用，研究表明NDV可通过内源性线粒体途径及外源[13]性凋亡通路直接诱导肿瘤细胞凋亡，NDV瘤苗也可以诱导肿瘤细胞[14]发生凋亡；第二，NDV感染肿瘤细胞后可加强肿瘤细胞表面抗原的免疫原性，激活患瘤机体的免疫细胞，可促进宿主产生例如细胞因子[15][16]TNF，IL等，从而间接通过宿主免疫机制杀伤肿瘤细胞。研究发现，即使无复制活性的NDV也可以使人外周血单个核细胞分泌INF-α增加，并可使单个核细胞表面TRAIL(TNF-relatedApoptosis-inducingligand)表达上调，抗HN的单抗而非抗F蛋白的单抗可以阻断这种效应。新城疫病毒表达两种病毒包膜刺突蛋白，分别是血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）和融合(fusionprotein，F)蛋白。HN蛋白在诱导机体受病毒感染的保护性免疫中扮演着重要角色，因此[17]它对抗原变异的免疫压力是非常易感的。这个在NDV病毒外壳上的HN蛋白不仅在感染禽类中发挥重要作用，而且可能是NDV抗肿瘤的主功能性蛋白，HN蛋白有两种活性红细胞吸附活性（HA）和神经氨酸酶活性（NA），NA是一种能结合细胞表面唾液酸的酶，其是由溶瘤病毒特定副黏病毒包括新城疫病毒，麻疹病毒在内的病毒所编码并合成的。HN蛋白不仅可以识别唾液酸受体，而且还可以水解唾液酸受[18]体，即它是一种同时具备两种功能的病毒刺突蛋白。前一种功能可以使其吸附到细胞上，后一种功能又可以使其从细胞上释放下来，如此反复吸附释放使其可以不断的结合并感染新的细胞。细胞凋亡的机制是非常复杂，参与其中的分子及凋亡信号通路的较多，目前人们广泛接受的凋亡途径总的来说主要有两条，死亡受体[19,20]（外源性凋亡途径）与线粒体途径（内源性凋亡途径）。外源性凋亡途径中最为典型的要数Fas和FasL途径，关于此通路的研究也较多。即Fas/FasL-FADD-caspase途径。Caspase，属于半胱氨酸蛋白酶[21,22]家族，主要功能是作为控制细胞凋亡的主要执行者。[23][24-27]前期我们已经证实NDVF3其对食管癌、胃癌有很好的抗肿瘤效果，并且检测到外源性凋亡途径上的关键蛋白caspase8的激活，NDVF3诱导食管癌EC109细胞凋亡很可能与Fas和FasL介导的11 研究论文FADD-caspase途径有关。全caspase抑制剂，benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone(Z-VAD-FMK)作为一种有效的细胞渗透caspase抑制剂，能够抑制casepase所启动的凋亡途径。用其来检测casepase依赖性途径在NDVF3诱导ECA109细胞凋亡通路中的作用，以此来继续探索NDVF3诱导食管癌ECA109细胞凋亡信号通路，为其抗肿瘤机制提供更多线索和依据，从而更好的改造和发挥其抗肿瘤特性。材料与方法材料1病毒株、细胞株及序列NDVHBNU/LSRC/F3株及人食管癌细胞ECA109细胞株由河北北方学院生命科学研究中心BSL-2室保存；HN基因及蛋白GenBank的登录号分别为KC246549.1和AGL94562.1。2主要试剂9~10日龄SPF鸡胚河北北方学院农林科技学院Top10感受态细胞、BL21（DE3）感北京世纪康为生物科技有限公受态细胞司Trizol试剂Invitrogen公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒及质粒Axygen公司提取试剂盒哺乳细胞表达载体：c-FlagpcDNA3Invitrogen公司Z-VAD-FMK（Caspaes抑制剂）上海蓝木生物有限公司RPMI1640细胞培养基美国Gibco公司胎牛血清杭州四季青生物工程有限公司胰蛋白酶美国Gibco公司12 研究论文EDTA美国Gibco公司PARP抗体北京碧云天生物技术研究所激活性caspase3北京碧云天生物技术研究所Actin抗体北京碧云天生物技术研究所辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠北京碧云天生物技术研究所IgG(H+L)辣根过氧化物酶标记山羊抗兔北京碧云天生物技术研究所IgG(H+L)苯甲基磺酰氟（PMSF）北京碧云天生物技术研究所Western及IP细胞裂解液北京碧云天生物技术研究所BCA蛋白浓度测定试剂盒北京碧云天生物技术研究所BeyoECL化学发光液北京碧云天生物技术研究所脂质体转染试剂盒北京碧云天生物技术研究所细胞凋亡试剂盒美国BD公司预染蛋白质分子量标准北京碧云天生物技术研究所异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊镇江厚普生物科技有限公司抗鸡IgG抗体Fas抗体北京博奥森生物技术有限公司FADD抗体北京博奥森生物技术有限公司兔抗NDV阳性血清北京博奥森生物技术有限公司ReverseTranscriptaseM-MLV大连宝生物科技有限公司（RNaseH-）、ClonedRibonucleaseInhibitor、dNTPMixture（10uM和2.5uM）、Oligod(T)15Primers、ExTaq酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切13 研究论文酶以及DNAMarkerNaCl，葡萄糖，柠檬酸钠，柠檬酸，国产分析纯Na2EDTA•2H2O，无水乙醇，甲醇等3主要仪器pH计德国Sartorius公司电子天平北京赛多利斯科学仪器公司PCR仪美国Thermo公司NikonECLIPSE90i多功能显微镜日本尼康公司SCIENTZ-IID超声细胞破碎机宁波新芝仪器有限公司低温高速离心机德国Sigma公司DYY-8C电泳仪北京六一仪器厂流式细胞仪美国BD公司帕恩特超纯水机北京湘顺源科技公司美国GEAmershamImager600自北京德泉兴业商贸有限公司动化学发光凝胶成像分析多头磁力加热搅拌器金坛市金南仪器制造公司电泳仪美国BIO-RAD公司美国BIO-RAD伯乐凝胶成像分美国BIO-RAD公司析仪SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气技术有限公司高压锅合肥华泰医疗设备公司HZQ-F全温振荡培养箱哈尔滨市东联电子公司二氧化碳恒温培养箱美国Thermo公司三用电热恒温水箱北京市长风仪器仪表公司4主要试剂的配置4.150×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：242gTris-base，37.2gEDTA，57.1mL乙酸，溶于1000ml蒸馏水1；4.21.0%琼脂糖凝胶：14 研究论文在25mL1×TAE缓冲液中加入0.25g琼脂糖，加热至完全溶解稍冷却后，加入适量GelRed核酸染料摇匀后便可制胶；4.3Amp(100mg/mL)：称量1g氨苄青霉素置于10mL容量瓶中，加入少量灭菌去离子水，充分混合溶解后，定容至10mL，用0.22μm过滤膜过滤除菌，小份分装（1mL/份）后，-20℃保存备用；4.4LB液体培养基：在100ml去离子水中加入1g酪氨酸，0.5g酵母粉，1g氯化钠；制作固体培养基时需加入1.5%琼脂，115℃，20min湿热灭菌；4.5阿氏液（红细胞保存液）：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，去离子水定容至100mL，加热溶解后，115℃，15min湿热灭菌，4℃保存2周内有效；4.60.5%红细胞悬液：将新鲜采集活鸡全血与阿氏液按1：1比例抗凝采血，采集时轻轻晃动采血瓶采血，后离心弃上层血清，加入0.9%生理盐水洗2－3遍，离心弃上清，取0.05ml红细胞用生理盐水稀释成稀释至10ml，即为0.5%的鸡红细胞悬液，现用现配；4.7PBS（0.01M，PH=7.4）：Nacl8.00g，KCl0.20g，Na2HPO3•12H2O1.57g，KH2PO30.20g去离子水至1000ml。121℃20min高压灭菌，4℃保存备用；4.80.25%胰酶：在100mLPBS中加入0.02g的EDTA(0.02%)搅拌均匀后，称胰酶0.25g加入上述溶液中，4℃过夜溶解，0.22μm滤器过滤除菌，4℃短期内用完，-20℃长期保存；4.9RPMI1640细胞基础培养基：按RPMI1640培养基配方配置，并按每配置1L培养基加入约2g的NaHCO3并调PH值至7.4左右，过滤除菌后，4℃保存备用；4.10RPMI1640细胞完全培养基：15 研究论文基础培养基中加入10%胎牛血清。吸取5ml配好的培养基至无菌培养瓶内培养24h，无菌实验阴性以后方可使用；4.1130%丙稀酞胺(w/v)：丙稀酞胺29g、亚甲基双丙烯酰胺1g、去离子水定容至100mL，4℃于棕色玻璃瓶贮存；-14.121.5mol.LTsri-HcL(PH8.8)：Tsri-碱18.17g溶于80mL去离子水中,加入浓盐酸调pH8.8，去离子水定容至100mL；-14.131.0mol.LTris-Hcl(pH6.8)：Tsri-碱12.1g溶于80mL去离子水中,加入浓盐酸调pH6.8，去离子定容至100mL；4.1410%SDS：SDS10g加入100ml去离子水中，加热至68℃助溶；4.1510%过硫酸胺：过硫酸胺20mg，去离子水定容至200uL；4.165×Tsri-甘氨酸电泳缓冲液贮存液：在适量去离子水中溶解15.1gTris-碱，94g甘氨酸和5gSDS，调PH为7.4-7.6定容至I000mL，用时稀释成1×；4.17转膜缓冲液：Tris3.05g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，然后去离子水定容至1L；4.185×蛋白上样缓冲液：-11mol·LTirs-HCl(PH8.8)0.6ml，10%SDS2ml，50%甘油5ml，2-巯基乙醇0.5m，1%溴酚蓝1m，溶解于0.9ml去离子水；4.19考马斯亮蓝染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中，量取400mL的甲醇加入上述烧杯中，搅拌溶解，加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌，加入去离子水定容至1L，均匀搅拌。用滤纸过滤后，室温保存；4.20脱色液：按甲醇：冰乙酸：水(3：1：6)的体积配成脱色液；4.2110×TBS：16 研究论文Tris碱：24.4g，Nacl：80g溶于800ml去离子水，后HCL调PH值到7.6，去离子水定容至1L；4.22封闭液（5%脱脂奶粉）：5g脱脂奶粉溶解于0.05%TBST中，现用现配。方法1HN基因的生物信息学分析1.1理化性质预测利用蛋白质分析系统EXPASYProteomic(http://ca.espasy.org/)中的蛋白质在线分析软件Protparam(http://.expasy.org/tools/protparam.htm)对HN氨基酸序列进行理化性质预测。1.2亲（疏）水性分析利用protscale(http://www.Espasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析HN蛋白氨基酸序列的亲（疏）水性。1.3二级结构及表面可及性等参数预测采用SOPMA在线程序（http://npsa-pbil.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sapma.html）分析预测HN蛋白的二级结构；采用Bcepred(http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred))程序预测HN蛋白的表面可及性、柔韧性及亲（疏）水性。1.4卷曲螺旋（Coil）预测利用Expasy的coil软件预测HN蛋白的Coil。1.5亚细胞定位预测运用亚细胞定位软件PSORTIIPrediction（http://psort.Hgc.jp/form2.html）的K-NN方法（临近算法）预测HN的基因所编码蛋白的亚细胞定位。1.6跨膜结构域预测运用TMpred软件（http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）预测HN蛋白的跨膜结构域。1.7信号肽预测17 研究论文使用丹麦技术大学的生物序列分析中心开发的在线SignalP4.1程序(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测HN蛋白的信号肽。1.8翻译后修饰位点预测利用Motifyscan软件（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan#prf:ARG_RICH）结合ScanProsite软件预测HN蛋白翻译后修饰位点。1.9保守结构域和功能域预测在NCBI的ConservedDomains(http://www.Ncbi.Nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl）分析HN氨基酸序列的保守结构域和功能域。1.10蛋白质三级结构预测利用蛋白质分析系统EXPASYprotepmic(http://www.Expasy.org/tools/pattern)三维结构模型组装软件SWISS-MODEL预测HN的三级结构，参数默认，建模采用同源性模版为3t1e.1.A。预测蛋白质三级结构获取后下载PDB文件，并用蛋白质三级结构显示软件rasmol2.7处理并显示结果。1.11B细胞抗原表位预测将HN氨基酸序列经Bepipred1.0(http://www.Cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)和ABCpred(http://www.Imtech.Res.in/raghava/abcpred/)软件共同预测，后取两软件预测的进行核对比较，选取两者共同结果作为B细胞抗原表位。1.12T细胞抗原表位预测用SYFPETHI（http://www.Syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediCtion.htm）在线软件及NetCTL等生物信息学分析HN蛋白潜在的T细胞抗原表位。2NDVF3HN基因真核表达载体的构建2.1新城疫病毒的制备2.1.1病毒的准备取出的血凝效价较高的HBNU/LSRC/F3病毒的尿囊液（-80℃保存），用灭菌生理盐水稀释10倍，即可用于鸡胚接种。2.1.2病毒的接种和收集18 研究论文选取9~10日龄SPF健康鸡胚进行接种，接种病毒前在暗室中用检卵灯观察鸡胚活力，去除未受精鸡胚及死胚。①将提前一天放入37℃温箱中的鸡胚取出，在暗室中用检卵灯仔细观察鸡胚气室及胚胎位置，画出气室范围，避开大血管在尿囊腔血管较少的地方画点做标记；②在超净工作台中，用75%酒精消毒气室部位的蛋壳，用无菌钢针在标记处打孔；③将2.1中稀释好的病毒混匀，在打孔处进针，进针深度约0.5~1.0cm。用1mL注射器在尿囊腔中注入0.2mL病毒稀释液；④用无菌胶布封闭小孔，将鸡胚气室朝上放回37℃温箱中继续孵育培养48h；⑤孵育期间每隔4h左右翻动鸡胚一次，每隔24h观察鸡胚一次，发现死亡鸡胚立即放入冰箱。孵育48h后将剩余所有鸡胚放入4℃冰箱过夜，使鸡胚血管收缩以便次日收集尿囊液；⑥次日75%酒精消毒鸡胚标记气室部位的蛋壳，用无菌镊子轻敲除去蛋壳，挑开气室中鸡胚壳膜，吸取尿囊液至编号的EP管中，每管取出0.1ml直接用于病毒血凝效价的测定。2.1.3病毒血凝效价测定将2.2中收获的尿囊液0.1mL，每个标记的尿囊液取9个玻璃小试管按下表做倍比稀释。编号123456789病毒液0.10.250.250.250.250.250.250.250.25生理盐水0.90.250.250.250.250.250.250.250.25弃去0.5mL弃去0.25mL稀释度1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560稀释完成后，另取三个玻璃小管加入0.25mL生理盐水做阴性对照，然后依次每管加入0.25mL的新鲜的0.5%鸡红细胞悬液，摇匀后室温反应45min观察结果。19 研究论文结果判定：鸡红细胞凝集程度以“－”、“+”、“++”、“+++”、“++++”来表示。以出现“++”的最高病毒液稀释倍数即为该病毒的血凝效价。－：红细胞沉于管底形成一个完整的红细胞团，边缘圆滑，与四周液体界限清晰，即无凝集。+：多数不凝的红细胞于管底沉聚成小圆团，边缘圆滑，周围有小凝块，即25%红细胞凝集。++：红细胞凝集在管底铺成一个环状，四周有细颗粒小凝块，约50%红细胞凝集。+++：红细胞大部分凝集，大颗粒状疏松平铺于管底，边缘不整齐，约75%红细胞凝集。++++：凝集的红细胞以块状致密地平铺管底，即100%红细胞凝集。效价检测完毕后，我们选取将最高血凝稀释倍数为1：1280的病毒作为下一步实验的研究对象，即当病毒液稀释至1：1280时，0.25ml中含1个血凝单位，4℃，850g离心40min后，吸取上清液于0.22过滤器过滤除菌，即可用于下游实验。2.2病毒总RNA的提取及cDNA的形成2.2.1实验用品的准备1%DEPC水：1000mL去离子水中加入1mLDEPC浓缩液既成1%DEPC水，静置过夜。75%乙醇：用经高压灭菌的1%DEPC处理水稀释75ml无水乙醇至100ml。无RNA酶的EP管和枪头等塑料用品：先将塑料用品逐个浸泡在未经高压灭菌的1%DEPC水中过夜，其中小枪头需用吸管打入DEPC水，121℃高压灭菌20min，烘干备用。2.2.2Trizol法提取NDVF3的总RNA①将收获的血凝效价为1280的尿囊液4℃850g离心45min，取上清液，过滤除菌；20 研究论文②取上述样品200ul加入1mLTrizol试剂混匀，室温下放置15~30min，使得核酸与蛋白复合物充分完全被分离；③4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀取上清；④加入0.2mL氯仿，上下手动颠倒振荡15s，室温放置5min；⑤4℃，12000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和RNA主要在上层无色的水相，把上层（约600µL）水相转移到新的1.5mL离心管中，切勿吸到中间层；⑥在吸取的水相中加入600µL(等体积)异丙醇，轻轻的上下颠倒摇匀，室温放置10min；⑦4℃，12000g离心10min，弃上清，RNA离心后在管底形成胶状沉淀；⑧加入1ml75%的无水乙醇至上述沉淀中，用枪轻轻吹匀以悬浮洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心5min；⑨弃上清，用枪头吸尽上清，晾干沉淀；⑩加50µL高压灭菌的1%DEPC水，用枪头轻轻吹打溶解沉淀，使RNA充分溶解；11立即取5µLRNA样品进行琼脂糖电泳检测提取效果，将余下的RNA-80℃保存或直接用于下游实验。2.2.3反转录反应cDNA的合成参考宝生物RT-PCR试剂盒方法①200uLEP管中加入下列模板RNA变性体系试剂名称体积NDVRNA5µLOlig(dT)Primer(50µM)5µLRNasefreedH2Oupto30µL②70℃水浴10min后迅速在提前准备好的冰上冷激2min左右；③短暂离心数秒后，变性的RNA聚集于EP管底部；④在上述EP管中继续配制下列反转录体系21 研究论文试剂名称体积上述RNA液30µL5×M-MLVBuffer10µLdNTPMixture(各102.5µLmM)RNaseInhibitor(40U/ml)1.25µLRTaseM-MLV2.5µLRNasefreedH2Oupto50µL⑤42℃水浴1小时；⑥70℃水浴15min，得到的cDNA溶液可直接用于下游的PCR扩增或-80℃保存备用。2.3HN引物设计据HBNU/LSRC/F3株HN基因全长编码序列（登录号为KC246549.1）的开放阅读框架使用Primer5.0软件设计一对引物。为方便后续与载体连接，在上游引物和下游引物的5’端分别添加了酶切位点。选取C-flagpcDNA3的多克隆位点上常用的BamHI和HindIII限制性内切酶作为酶切位点，且两个酶均不切割HN基因的开放阅读框架。故设计好的引物两端带有BamHI和HindIII的酶切位点（下划线表示酶切位点）。其中，CCC和CGC为保护性碱基。引物由北京中美泰和生物技术公司合成。引物编号序列上游5’-CCCAAGCTTATGGACCGTGTAGTTAGC-3’(HindIII)下游5’-CGCGGATCCTTAAATCCCATCATCCTT-3’(BamHI)2.4HN的PCR扩增反应反应体系如下，总体系为25µL。试剂名称体积cDNA溶液（NDV）1µLdNTPMixture(各4µL22 研究论文2.5mM)10×ExTaqBuffer2.5µL引物1（10µM）0.5µL引物2（10µM）0.5µLEx·Taq（5U/µL）0.25µL灭菌去离子水16.75µLTotalVolume25µL将上述样品混合液吹打后短暂离心使之充分混匀，以NDV的cDNA为模板，进行HN基因的PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸3min，循环数为30次；72℃总延伸10min，PCR产物直接检测或4℃短暂保存。扩增反应结束后，取5μLPCR产物于1.0%琼脂糖样孔中电泳20min左右。凝胶成像系统上观察扩增效果。2.5PCR扩增产物的回收与纯化将PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下，迅速将位于1716左右的目的DNA片段切下来，将切好的DNA凝胶块转移至1.5ml提前称重EP管中，计算出凝胶块重量。纯化步骤参考AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒说明进行。回收的PCR扩增产物直接用于下游双酶切实验或-20℃保存备用。2.6PCR扩增产物及C-flagpcDNA3载体的双酶切试剂名称体积PCR纯化产物、C-flagpcDNA310µL灭菌去离子水6µL10×KBuffer2µLHindIII1µLBamHI1µL总体积20uL30℃酶切3h后，琼脂糖凝胶电泳后再进行PCR纯化产物、C-flagpcDNA3酶切产物进行DNA凝胶回收，回收步骤同2.5，回收产物可直接用于下游连接实验。23 研究论文2.7PCR酶切产物的连接转化及序列测定2.7.1纯化后的PCR双酶切产物与c-flagPCDNA3载体双酶切产物的连接在200ulEP管中加入下列试剂，体系如下：试剂名称体积c-flagPCDNA3双酶切回收产物1.5µLHNPCR双酶切回收产物6.5µL10×T4DNAbuffer1µLT4DNA连接酶1µL总体积10µLHNPCR双酶切回收产物为：引物扩增产物纯化后又进行酶切纯化产物。连接条件：16℃孵育过夜。2.7.2连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞转化步骤参考感受态细胞操作说明进行：①冰盒上融化从-80℃冰箱取出的Top10感受态细胞；②将10µL连接产物加到100µL的Top10中；③轻轻混匀，将其放在冰上冰浴30min；④42℃水浴中热激静置60s，立即冰浴2min；⑤无菌操作将110µL混合物里加890µL的不含氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基；⑥将上述混合物放在37℃，180rpm培养箱中振荡培养45min；⑦4000rpm离心2min收集细胞，留200µL左右上清重悬细胞；-1⑧吸取100µL重悬的转化细菌涂布于含终浓度为0.1g.LAmp的LB平板，先37℃温箱中正置1h待吸收后，倒置培养过夜，24h后观察有无菌落生长。2.7.3阳性重组质粒c-flagPCDNA3-HN的筛选从LB平板上（含Amp）分别挑取多个白色菌落，挑取菌落的一半用细菌PCR方法来筛选HN基因是否插入表达载体中，扩增条件均采用2.4中的条件。将确定为阳性的剩余半个菌落接种至6mL含有Amp24 研究论文的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒量说明提取质粒。2.7.4阳性重组质粒c-flagPCDNA3-HN的鉴定①重组质粒flagPCDNA3-HN的双酶切鉴定：将提取的重组质粒DNA进行双酶切，条件为30℃酶切3h双酶切体系如下：试剂名称体积重组质粒DNA2µL水14µL10×KBuffer2µLHindIII1µLBamHI1µL总体积20µL②序列测定：将经细菌PCR和双酶切鉴定正确的c-flagPCDNA3-HN阳性重组质粒，送北京华大基因公司进行DNA测序。将测序返回的序列结果和NCBI发布的序列进行BLAST比对分析。如序列正确或有突变不影响氨基酸翻译可以继续下游的基因表达的实验；如有移码或错译则需从3.2目的基因的扩增重头开始做起，直至插入的片段能正确翻译出目的HN基因的氨基酸为止。2.8HN的真核表达2.8.1重组质粒C-flagpcDNA3-HN转染ECA109细胞实验分两组分别为空质粒阴性对照组和重组质粒实验组，参考5Lipofecter脂质体转染试剂盒：转染前一天将5×10个ECA109细胞接种至放好经高压灭菌的洁净盖片的六孔板内，次日细胞长至70%-80%时进行转染，转染前把六孔板每孔内换成不含血清不含抗生素的不完全培养液。每孔2ml，用枪头将Lipofecter脂质体转染试剂轻轻混匀。每个待转染的六孔板内依次加入如下体系：25 研究论文用枪头轻轻吹打混匀（千万不可Vortex或离心）。20℃孵育15分钟。把孵育后的混合物对应缓慢逐滴均匀地加入到整个六孔板的孔C-flagpcDNA3-HNC-flagpcDNA3Lipofecter4ul4ulRPMI164057ul57ulDNA3ul(1ug)3ul(1ug)Finalvolume70ul70ul内，随后轻轻摇板混匀。将六孔板放回37℃，5%CO2培养箱中继续培养，6h后吸弃上述混合转染液，每孔加入2ml新鲜含血清的培养基继续进行转染。2.8.2重组质粒C-flagpcDNA3-HN转染细胞后的RT-PCR验证转染48h后收获ECA109细胞，Trizol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明操作获得cNDA，根据GenBank提供β-actin开放阅读框架。设计上游引物下游引物，引物由北京中美泰和公司合成。按3.2中的PCR程序扩增内参及目的基因HN，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。2.8.3间接免疫测HN蛋白的表达①将转染后置37℃、5%CO2培养箱中培养36h的细胞取出，吸弃培养基，PBS洗3次，每次3min；②固定细胞：每孔加1ml酮室温作用10min；③吸弃固定液，PBS洗3遍，每次洗3min；④通透：每孔加入0.2%Trion100，室温作用15min；⑤吸弃通透液，PBS洗3遍，每次洗3min；⑥封闭：每孔加1ml10%山羊血清室温作用1h；⑦一抗作用：吸弃封闭液，每孔加入100ul10%BSA配置的1：100稀释的兔抗NDV一抗4℃作用过夜；⑧吸弃一抗液，PBS洗4遍，每次洗5min；⑨二抗作用：每孔加入100ul10%BSA配置的1：20稀释的FITC标记的山羊抗兔二抗稀释液37℃作用1h；26 研究论文⑩吸弃二抗液，PBS洗4遍，每次洗4min；11立即荧光显微镜下观察空质粒组和重组质粒组中的荧光显色结果并保存结果。2.8.4流式细胞仪测重组质粒C-flagpcDNA3-HN转染ECA109细胞后细胞凋亡率实验分三组分别为只加不完全培养基处理细胞的空白对照组，空质粒阴性对照组和重组质粒实验组，分别收集空白对照组及转染后置37℃、5%CO2培养箱中培养48h的空质粒细胞和重组质粒组细胞，冷6PBS洗两次，调整细胞浓度为1×10个/ml。取100ulPBS稀释的1×缓冲液，采用双染色法检测凋亡情况，分别加入5ulPI及5ulAnnexinV-FITC，室温下，轻轻混匀后避光反应15min，后再加入400ul稀释的1×缓冲液，流式细胞仪检测结果。3NDVF3感染ECA109细胞后信号通路的研究3.1Western-blot法检测NDVF3感染ECA109细胞后36h内细胞内cleavedcasepase-3、cleavedPARP、fas、fasl、fadd等蛋白的表达情况3.1.1ECA109细胞中NDVF3的接种细胞培养至处于对数生长期并铺于单层时，弃培养基，实验组加入0.5mlRPMI1640维持液稀释至病毒感染复数（MOI）为25的NDVF3感染的尿囊液，阴性对照组加入同样方式稀释的正常尿囊液，每组三个重复，37℃5%CO2饱和蒸气下吸附1h，之后每瓶加入4.5mlRPMI1640维持液继续培养，使MOI最终为2.5。3.1.2细胞收集：分别收取NDVF3感染ECA109细胞后0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，36h的细胞沉淀，冷PBS洗两遍后留取细胞沉淀可直接用于下游蛋白提取实验或-20℃保存备用。3.1.3细胞总蛋白提取：①提取液制备：500ul冷的总蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用；6②取5×10个细胞，在4℃，1500rpm条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；27 研究论文③用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清；④每管细胞沉淀加入500uL冷的总蛋白提取液，混匀后，在4℃条件下振荡20分钟；⑤4℃，14000rpm条件下离心15分钟；⑥快速将上清吸入另一预冷的洁净离心管，即可得到总蛋白；⑦将上述蛋白浓度测定记录后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。3.1.4蛋白浓度检测①将标准品干粉稀释溶解后按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，用标准品稀释液补足至每孔20μL，使每孔对应的标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；②加适当体积待测样品到96孔板的样品孔中。如果样品浓度过小则加入20μl，如果样品浓度过大，可适当少加样品后加标准品稀释液补足至每孔20μl，及时记录每孔所加样品体积；③各孔加入200μLBCA工作液（现用现配），37℃反应25分钟左右。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间；④酶标仪测定A562nm波长每孔的吸光度；⑤将酶标仪测得的浓度从高到低个点的标准品绘制溶解曲线，根据标准曲线和使用样品根据体积计算出样品的蛋白浓度。3.1.5蛋白上样及检测①按要测目的蛋白的分子量大小配置合适的分离胶配方20-80kD选取10%胶112-60kD选取2%胶10-40kD选取15%胶10%分离胶12%分离胶15%分离胶成分胶浓度10mL20mL10mL20mL10mL20mL蒸馏水4.0008.0003.3006.6002.3004.60030%AB3.3006.6004.0008.0005.00010.00028 研究论文1.5MTris-Hcl2.5005.0002.5005.0002.5005.00010%SDS0.1000.2000.1000.2000.1000.20010%APS0.1000.2000.1000.2000.1000.200TEMED0.0040.0080.0040.0080.0040.0085%浓缩胶配置体积2ml4ml6ml8ml10ml12ml成分蒸馏水1.4002.7004.1005.5006.8008.20030%AB0.3300.6701.0001.3001.702.0301.0MTris-Hcl0.2500.5000.7501.0001.251.50010%SDS0.0200.0400.0600.0800.1000.12010%APS0.0200.0400.0600.0800.1000.120TEMED0.0020.0040.0060.0080.0100.012②电泳：加好电泳缓冲液后，将每个胶孔里的气泡赶走。所有-1蛋白样品调至30mgL后上样，样品用5×loadingbuffer按5:1混匀，煮沸10min后上样。先以初始电压为90V时电泳，当指示剂达分离胶时电压改为150V。在目的蛋白泳动至距胶接近下缘时结束电泳；③转膜：采用湿转法，将滤纸也浸入转移液中。PVDF膜左上切角，在甲醇中浸泡10s以上。将胶卸下，据预染蛋白Marker大小将胶合适位置切下，从负极板按顺序铺好海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵，滴加少许电转液再次驱赶气泡，叠紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。将电泳槽置于冰水混合物中降温。转膜条件注意据目的蛋白不同分子量及电泳仪的不同条件也要相应摸索。调整合适的恒压或恒流和时间。分子量大的电压大点时间也长一点；④封闭：转膜结束后将膜从转移电转槽中取出，在TTBS短暂漂洗数分钟，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色；⑤一抗孵育：将封闭好的PVDF膜从封闭液中取出，TTBS轻轻漂洗几分钟，将膜浸没在适当TTBS稀释的一抗中，室温下摇床轻摇29 研究论文孵育2小时或4℃轻摇过夜。一抗孵育结束后，TTBS浸洗膜四次，每次4min；⑥二抗孵育：根据一抗来源选择合适的二抗，将膜浸没在适当TTBS稀释的二抗中，摇床室温轻摇一小时。孵育结束后，用TTBS把膜浸洗四次，每次4min；⑦ECL发光显色：将A、B发光液按比例稀释混合。膜置于保鲜膜内固定后滴加显色剂使显色剂覆盖膜，迅速关闭胶盒，AmershamImager600自动化学发光凝胶成像仪选择化学发光发光强度曝光。标定Marker，进行结果图片检测及保存。3.2全caspase的抑制剂Z-VAD-FMK对NDVF3诱导食管癌ECA109细胞凋亡的影响-1实验分四组：实验组先用0.5mL100umol·LZ-VAD-FMK预处理细胞1h，后用RPMI1640维持液稀释至MOI为25的NDVF30.5mL吸附1h，最后加入4.0mLZ-VAD-FMK与RPMI1640维持液的混合液，-1使Z-VAD-FMK终浓度为100umol.L继续培养；空白对照组为正常尿囊液处理的ECA109细胞；阴性对照组为不加NDVF3感染的和实验-1组相同终浓度的100umol·LZ-VAD-FMK处理的ECA109细胞；阳性对照组为不加抑制剂和实验组一样浓度处理的NDVF3感染的ECA109细胞。正常对照组实验组阴性对照组阳性对照组Z-VAD-FMK预处理++正常尿囊液+RPMI1640维持液++++NDVF3（MOI=2.5）++倒置显微镜下记录各组细胞变化，24h后收集细胞沉淀检测Z-VAD-FMK对caspase的抑制效果。4统计学处理应用SPSS16.0软件，数据用（x±s）表示，采用t检验和单因素方差分析对数据进行统计学处理，P<0.05为有统计学差异。30 研究论文结果1HN的序列分析结果1.1理化性质经Protparam在线软件分析，HN蛋白由571个氨基酸组成，相对分子质量为62.5kDa，理论等电点为6.24，分子式为C2766H4316N752O852S24，该蛋白有13个半胱氨酸，当全部残基形成二硫-1-1键时，则该蛋白在水溶液中280nm处的摩尔消光系数为54500Mcm，-1吸光度值为（蛋白浓度为1g.L）0.872，当二硫键全部打开时，消光-1-1系数为53750Mcm，吸光度值为0.872。该蛋白在溶液中的不稳定指数为34.44，低于阈值40，推测该蛋白相对较稳定.该蛋白的脂肪族指数为81.59，总平均亲水指数为-0.133，蛋白质总体亲水性较高。在哺乳动物体内的半衰期为30h，在酵母菌体内的半衰期为>20h，在大肠杆菌中的半衰期>10h。1.2亲（疏）水性利用Protscale在线分析HN蛋白具有两亲性，最大疏水指数是3.4，最小疏水指数是-3.067，总平均疏水性为-0.1331，总体来说HN蛋白为亲水性蛋白见（图1-1）。1.3二级结构及表面可及性等参数经SOPMA预测，HN蛋白富含无规则卷曲（Cc）和α-螺旋(Hh)，其中无规则卷曲（Cc）占35.20%，α-螺旋(Hh)占29.77%，β-转角(Tt)的为10.33%，β-折叠(Ee)含24.69%。采用Bcepred程序分析，HN蛋白具有12个亲水性较高区域（参数得分≥1.9）分别位于第13-17，118-122，121-122，146-147，168-171，179-201，231-236，255-262，281-282，324-330，343-348，518-522位氨基酸；有9个柔韧性较高的区域（参数得分≥2.0）分别位于第13-15，212-213，230-236，255-256，321-323，362-363，507-508，510-511，515-519位氨基酸；17个表面可及性较高区域（参数得分≥1.9）分别位于12-20，66-70，84-85，200-202，231-236，255-262，280-285，322-330，336-351，356-362，368-370，431-435，472-473，482-483，495-498，513-514，536-539位氨基酸；5个暴露表面得分较高区域（参数得分≥2.3），分别位于13-17，232-235，259-261，339-340，495-497位氨基酸。31 研究论文1.4卷曲螺旋（Coils）Coils结果表明HN蛋白含卷曲螺旋部分的概率较低（图1-2）。1.5亚细胞定位经亚细胞定位软件PSORTIIPrediction采用K-NN方法（临近算法）分析，HN蛋白主要分布在线粒体和细胞质中，比例分别为34.8%和26.1%，在内质网，高尔基体，胞液，细胞核的比例分别为17.4%，13.0%，4.3%，4.3%。1.6跨膜区使用TMpred软件对HN基因编码蛋白进行跨膜区预测，结果表明该多肽链可能有4个跨膜螺旋，由膜内到膜外的3个跨膜螺旋位置分别位于：27-46，95-118，286-308，得分为（大于500即为显著性结果）；由膜外到膜内4个跨膜螺旋位置分别在：23-46，96-118，202-221，295-316，得分最高的跨膜拓扑模型中，膜外到膜内的跨膜螺旋为23-46，膜内到膜外的跨膜螺旋为27-46，95-118，且N端在胞质膜侧见（图1-3）。1.7信号肽SignalP4.1程序预测D值为0.135，小于阈值0.500，所以预测HN蛋白为非分泌蛋白（图1-4）。1.8翻译后修饰位点预测经预测HN蛋白共有翻译后修饰位点36个，1个酰胺化位点（365-368位氨基酸），6个N-糖基化位点（119-122，341-344，433-436，481-484，508-511，538-541位氨基酸），11个酪蛋白激酶II磷酸化位点（52-55，64-67，76-79，255-258，306-309，324-327，328-331，343-346，381-384，490-493，544-547位氨基酸），8个N-豆寇酰化位点（58-63，116-121，169-174，209-214，301-306，319-324，451-456，486-491位氨基酸），9个蛋白激酶磷酸化位点（20-22，216-218，223-225，358-360，375-377，458-460，483-485，521-523，537-539位氨基酸），1个酪氨酸激酶磷酸化位点（274-281位氨基酸），不含亮氨酸拉链。1.9保守结构域及功能域经软件预测该基因编码蛋白与GenBank数据库中所注册的唾液酸酶属具有相似性，属于唾液酸酶相似蛋白家族成员（图1-5），除了位32 研究论文于23-523位氨基酸的血凝素神经氨酸酶功能域外，还有23-45位氨基酸处有一个跨膜区和509-530位氨基酸组成的一个低复杂区。1.10高级结构经SWISS-MODEL软件同源建模后，rasmol浏览结果，并以图片形式输出结果，红色代表α-螺旋，黄色板条状代表β-折叠，蓝色代表β-转角，白色代表其它残基。详细见(图1-6）。1.11B细胞抗原表位将HN氨基酸序列经Bepipred1.0和ABCpred软件预测结果的共同结果进行统计，预测的B细胞抗原表位有17个（临界值为0.35），见（表1）。1.12HN蛋白的T细胞表位预测1.12.1HN蛋白的HLA-A2和HLA-A3限制性CTL表位经SYFPEITHI程序分析保存预测分值大于20的9肽，HN的HLA-A2和HLA-A3限制性CTL表位分别为23个和18个。再经过NetCTL预测HN蛋白的HLA-A2和HLA-A3限制性CTL表位，保存综合得分大于0.75的9肽，结果表明，HN蛋白的HLA-A2和HLA-A3限制性CTL表位都是14个，其中两个程序预测的共有序列为：HLA-A2：22-30，31-39，89-97，95-103，205-213，396-404，491-499，544-552，551-559，557-565位氨基酸；HLA-A3：38-46，210-218，274-282，403-411，498-506，533-541位氨基酸。1.12.2HN蛋白的辅助性T细胞表位采用SYFPEITHI程序分析HN蛋白的HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位，保留预测分值大于21的15肽，HN的HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位分别为30个和45个。1.12.3HN蛋白的T细胞表位和辅助性T细胞的联合表位结合CTL表位和辅助性T细胞表位预测结果可知，HN的CTL表位和辅助性T细胞的联合表位为：18-32，30-44，34-48，91-105，205-219，202-216，395-419，401-415，488-512，532-546，542-556，550-564位氨基酸。2NDVF3HN基因真核表达载体的构建与表达2.1HN基因的扩增33 研究论文以提取的新城疫病毒cDNA为模版，设计的一对引物进行RT-PCR扩增，得到一条大小约为1716bp的基因片段，与预期大小一致，见(Fig.2-1)。2.2阳性重组质粒c-FlagpcDNA3-HN的筛选与鉴定2.2.1细菌PCR的结果将连接过夜的连接产物，热激转化至TOP10感受态细胞，接种于含氨苄青霉素的LB固体平板上，次日取单个的阳性克隆菌落为PCR的模版，条件参照（3.2），结果见(Fig.2-2)，可见重组质粒转化的感受态细胞经细菌PCR扩展获得约1716bp大小的片段。2.2.2重组质粒双酶切结果将阳性重组质粒c-FlagpcDNA-HN经HindIII和BamHI双酶切获得大小约为1716bp和5.4kb左右的两条带与预期结果相符，说明插入位置及大小正确。结果见(Fig.2-3)。2.2.3重组质粒序列测定结果测序结果回来后，用NCBI上的Blast生物软件将测序结果与Genbank中HBNU/LSRC/F3株HN基因序列进行序列比对，结果显示测序结果中的重组质粒中插入片段与Genbank上核苷酸序列的一致性为100%。2.3HN的真核表达及功能2.3.1重组质粒转染细胞后的RT-PCR验证HN基因的检测经RT-PCR验证实验组和空质粒组均检测到β-Actin,而用HN的上下游引物只扩增出了重组质粒的HN基因，空质粒组未扩出HN基因的条带。结果见图(Fig.2-4)。2.3.2重组质粒转染细胞后HN基因蛋白的表达经荧光显微镜检测重组质粒组胞质内可见黄绿色荧光，而空质粒组未见，表明HN转染ECA109细胞成功，检测到了HN蛋白的表达。结果见如(Fig.2-5)。2.3.3流式细胞仪测重组质粒C-flagpcDNA3-HN转染ECA109后细胞凋亡34 研究论文经流式细胞仪检测，重组质粒组凋亡率(8.2%±0.37)高于空质粒组(4.6%±%0.22)，而空白对照组凋亡率为（1.0%±%0.72）差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图(Fig.2-6)。3NDV感染ECA109后信号通路的研究3.1Western-blot法检测NDVF3感染ECA109细胞后clevedcaspase-3,clevedPARP、fas、fasl、fadd等表达情况经Western-blot检测36h内NDVF3感染ECA109的细胞内clevedcaspase-3，clevedPARP蛋白的表达量随NDVF3感染时间延长呈上升趋势，而Fadd等蛋白的表达在4h达最高，4h后有降低趋势。结果见图(Fig.3-1)。3.2全caspase抑制剂Z-VAD-FMK对NDVF3诱导ECA109细胞凋亡的影响-1全caspase抑制剂（100umol.L）Z-VAD-FMK和F3共处理组，作用24h后收集细胞提取总蛋白，经Western-blot可见其能明显抑制ECA109细胞内caspase-3及下游PARP的断裂激活，从而延迟凋亡的发生；而不加抑制剂的阳性对照组则见明显的激活的caspase-3及下游-1断裂的PARP。证明100umol.LZ-VAD-FMK是NDVF3株24h内诱-1导ECA109细胞凋亡时比较合适的caspase抑制浓度，即100umol.LZ-VAD-FMK能够抑制NDVF3诱导ECA109细胞凋亡通路中的caspase的表达，结果见图(Fig.3-2)。显微镜下在24h内Z-VAD-FMK延迟了NDVF3诱导ECA109细胞的溶解作用，延迟了细胞的死亡，而阳性对照组细胞大片死亡。但是24h以后（包括24h）ECA109细胞逐渐开始被溶解，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组24h以后（包括24h）Z-VAD-FMK不能抑制NDVF3诱导ECA109细胞的细胞病变效应（CytopathicEffect，CPE）尤其是48h以后。细胞结构破坏较严重结果见图(Fig.3-3)。而空白对照组和阴性对照组则细胞结构完整。35 研究论文附图Fig.1-1ThehydrophobicitystructurepredictionofHNThehozizontalaxisstandeforthepositionofaminoacideinthisproteinandverticalaxisstandsforthehydrophobicity.ThepositivevalueofverticalaxisrepresenthydrophobicityandthenegativevaluerepresentFig.1-2PredictionofthecoilforHNproteinThehorizontalstandsforthepositionofaminoacidsinthisproteinandverticalaxisstandsforthepropensityindexFig.1-3PredictionofthetransmembranedomainsforHNproteinThehorizontalstandsforthepositionofaminoacidsinthisproteinandverticalaxisstandsfortheTransmembranevalue36 研究论文Fig.1-4PredictionofthesignalpeptideforHNproteinThehrizontalaxisstandsforthepositionofaminoacidsinthisproteinverticalaxisstandsforDvalueoftheFig.1-5ConserveddomainsonproteinofHNprotein(conservedomonontheNCBI)Fig.1-6The3-DstructurepredictionofpartsequenceforHNprotein（SWISS-MODELandrasmol）37 研究论文Fig.2-1AssayresultsofamplificationofHNgeneM:DL2000,1-3:HNgeneFig.2-2AssayresultsofamplificationofbacterialcolonybyrecombinantplasmidM:DL2000,1-2:Amplificationofbacterialcolonybyrecombinantplasmidc-FlagpcDNA-HN38 研究论文Fig.2-3AssayresultsofdoublerestrictionofrecombinantplasmidM:DL4500,1-2:doublerestrictionofrecombinantplasmidc-FlagpcDNA-HNFig.2-4AmplificationproductofRT-PCRinECA109cellsaftertransfectionM:DL10000,1:β-actingeneinemptyplamidtransfectionplasmid,2:β-actingeneinrecombinantplasmidtransfection,3:HNgeneinemptyplamidtransfection,4:AmplificationofHNgeneinrecombinantplasmidtransfection39 研究论文Fig.2-5AssayresultsofHNexpressioninECA109cellsA.c-flag-pcDNA3plasmidgroupB.c-flag-pcDNA3-HNplasmidgroupFig.2-6ApoptoticEffectofrecombinantplasmid-transfecedECA109cellsdetectesbyAnnexinV/PIdoublestainflowcytmetryA.c-flag-pcDNA3plasmidgroupB.c-flag-pcDNA3-HNplasmidgroup40 研究论文Fig.3-1Activationofclevedcaspase-3,clevedPARP,Fas,Fasl,FADDpreteininductionuponNDVinfectionECA109cellswasinfectedbyNDVF3forvarioustimesasindicatedinthefigure.Celllysateswereanalyzedfortheactivationofcleavedcaspase-3,leavedPARP,Fas,Fasl,FADDbyimmunoblotassay(Gelsfromsixproteinexpressionanalysisforallexperimenttimes.eachdatapointrepresentthemean±sem;*p<0.05vs.0hgroup)Fig.3-2TheinhibitioneffectofZ-AD-FMKontheapoptosisinducedbyNDVF31:NDVF32:Z-AD-FMK3:NDVF3+Z-AD-FMK41 研究论文Fig.3-3EffectofZ-VAD-FMKonNDV-infectedECA109cells1:control2:Z-VAD-FMK3:NDVF34:Z-VAD-FMK+NDVF342 研究论文附表Table.1PotentionalBepitopesofaminoacidsequenceofHN顺序氨基酸位置B细胞抗原表位的潜在序列OrderThepositionofaminoacidsThepotentialBepitopedssequencesofantigens110-18LENDEREAK249-55EASTPGD367-80EEKITSALGSNQDV4115-135NGAANNSGCGAPVHDPDYIGG5145-151ASDVTSF6164-174PAPTTGSGCTR7229-240LDDNQNRKSCSV8255-267TETEEEDYNSVIP9279-284GQYHEK10319-331GLKPNSPSDTAQE11341-350NDTCPDEQDY12357-367SSYKPGRFGGK13381-393SLGEDPVLTVPPN14431-439VDNKTATLH15448-462TRPGSVPCQASARCP16468-473GVYTDP17517-527VSSSSTKAAYT43 研究论文讨论生物信息学是以大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的理论和方法，去研究生命现象、组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。该系统由数据库、计算机网络和应用软件三部分组成，其关注的研究热点包括：序列比对、基因识别、DNA序列分析、蛋白质结构预测等。本文通过常用的生物信息学软件，对NDVHBNU/LSRC/F3株HN蛋白的主要基本特性及空间结构有了一个基本的了解。根据新城疫病毒的抗瘤特点，可将其分为溶瘤株和非溶瘤株，从字面上就可以看出两者抗肿瘤效果的强弱，NDV中的中、强毒株属于溶瘤株，可在肿瘤细胞内进行更多循环的复制，在肿瘤细胞间形成更多更大的合胞体；NDV中的弱毒株一般为非溶瘤株，其对肿瘤细胞的[28]杀伤力远不如溶瘤株。病毒不断复制，合胞体在细胞与细胞间膨胀，[29,30]最终合胞体破坏。NDV与其他溶瘤病毒相比，例如痘病毒，HSV-1病毒，腺病毒，麻疹病毒还有和肠狐病毒相比，NDV溶瘤有它的局限性的同时也有它[31]独特的优势。其优势主要有三点；首先，NDV是禽类病原体，serologic等调查发现96%人对NDV的免疫血清反应是阴性的，这样就可以避免[32,33]人体预存的免疫反应引起不利的免疫应答。其次，和其它溶瘤病毒类似，NDV拥有很强的免疫刺激作用，比如刺激IFN，细胞因子，上调MHC和黏附作用，除此之外它还可以通过在细胞表面表达病毒糖[34-36]蛋白来吸附淋巴细胞和抗原提程细胞，这些特性即使在病毒被清除后仍可以产生持久有效的抗肿瘤免疫反应。再次，NDV允许外来基[37]因的插入且可以相对稳定表达外源基因。并且能很好的表现出两者[38,39]的联合效果。NDV溶瘤的特异性可能和肿瘤细胞抗病毒免疫缺陷相关也可能和[40]肿瘤细胞凋亡机制缺陷有关。研究发现肿瘤细胞化疗药物耐药的一个重要原因和肿瘤细胞凋亡抵抗密切相关，而NDV对肿瘤化疗耐药表44 研究论文现出很好的治疗效果，敲除多种肿瘤细胞的Bcl-XL基因，可引起NDV的复制和其溶瘤活性的降低。NDV抗肿瘤强弱依赖于其诱导肿瘤细胞凋亡的能力和抗肿瘤的炎症反应。细胞凋亡也称细胞程序性死亡。与基因清除有害和突变细胞维持细胞生存和死亡的平衡密切相关。因此细胞凋亡对维持细胞稳态十分重要。凋亡缺陷和不充分的凋亡信号将引发基因的遗传变异及细胞无限性和侵袭性增长。例如前列腺癌细胞[41]与正常前列腺细胞相比癌细胞的增值率和凋亡率是失衡的。凋亡对维持身体各系统平衡也是非常重要的。凋亡信号的失调将[42]引起严重的疾病如癌症和自身免疫性疾病的发生。细胞凋亡通常是由连续的活化的caspase诱导完成的。Caspase广泛的以非活性的酶原形式存在，一旦触发又会以裂解的形式存在。如细胞凋亡的外源性途径涉及caspase-8的激活，它可直接激活下游caspase如活化caspase-3，[43]6和7。Caspase蛋白是一种通过调节细胞死亡和炎症保持细胞稳态非常重要的成员之一，如果caspases缺陷伴随凋亡异常将导致癌症的发生，而caspase的过度激活将引发神经变性性疾病。Caspase-3被认为是caspases里最重要的侩子手，被caspase-8，caspase-9，或者[44]caspase-10中任意一个caspase发起者切割激活。细胞凋亡过程中一条重要途径是死亡受体途径，由受体与配体的结合介导，其中死亡受体家族(TNF受体超家族)包括CD95(Fas/APO-1)，[45-47]TNF-R1，DR3，DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)受体。死亡受体途径可杀死体内的多种肿瘤细胞。有研究在NDV诱导小鼠肝癌细胞凋亡时在小鼠脾脏里检测到了TRAIL的表达，从而说明NDV是通[48]过TRAIL途径刺激NK细胞杀伤肿瘤细胞。细胞外部环境情况决定细胞的生死存亡，外源性凋亡通路开始于细胞的外部，即外源性通路信号来源于细胞外部的外来信号，外源性通路，主要是通过配体FasL，TNF-alpha，Apo3L和TRAIL结合相应受体FasR，TNFR1，DR3和DR4以膜受体复合物的形式招募激活[49]caspase-8和caspase-10。Fas或者TRAIL受体与配体接触将引发[50,51]caspase依赖性的凋亡通路。受体配体结合后，Fas和TRAIL受体通过与适配体FADD的结合，进一步形成死亡诱导信号复合物(DISC)，45 研究论文这使得procaspase-8被激活成有活性的caspase-8招募特殊的促caspases[49]启动者(caspase-8或者10)到质膜上来进一步激活caspase。激活的caspase-8有两个作用，或者激活caspase-3，或者断裂蛋白（Bid）为（tBid），然后tBid通过触发低聚的促凋亡蛋白激活内源性凋亡通路。tBid使细胞内的线粒体外膜通透性增加，紧接着它行使着和Bcl-2家族促凋亡蛋白一样的功能，因此caspase-8操控Bid断裂成促凋亡的截短形式的方式，建立了一个死亡受体途径激活线粒体凋亡[52]通路的桥梁。研究显示，caspase-8/Bid对NDV诱导的内源性凋亡通[13]路作用不明显。大量实验提示，caspase抑制剂并不能有效抑制所有的死亡刺激信号诱导的细胞死亡。因此，凋亡中还存在caspase非依赖性凋亡途径。caspase非依赖性途径即可以在完全缺乏caspase蛋白酶的情况下完成，调亡途径又可以分为caspase依赖性（caspasedependent）和caspase非[53]依赖性（caspaseindependent）活性的细胞死亡机制。Caspase依赖性途径中caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，线粒体被广泛的认为是调节凋亡的核心，死亡受体途径与线粒体途径的相互共同作用导致线粒体膜电位降低，细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosisinducingfactor，AIF）的释放。细胞色素C激活下游的caspase瀑布反应，引发caspase依赖性凋亡的发生；AIF促进染色体的聚集和DNA的断裂caspase非[54]依赖性凋亡的发生。我们实验室已经验证了NDVF3诱导ECA109细胞凋亡经过内源性通Bax，细胞色素C和caspase-9，表达随NDV浓度增高而增强，而本次实验结果NDV感染ECA109细胞36h内断裂的caspase-3和断裂的PARP的表达随着时间的延长有增加趋势，相反外源性途径中的一重要蛋白FADD等蛋白的表达4h含量达最大随后有递减趋势。提示NDVF3株诱导ECA109细胞凋亡的凋亡途径中外源性凋亡途径内源性线粒体凋亡途径共同发挥诱导凋亡作用。Caspase蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶。ECA109细胞在经caspase抑制剂Z-VAD-FMK和NDVF3株共同处理后，全caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理组24h内阻止了NDVF3诱导ECA109细胞46 研究论文的溶解作用，延迟了细胞的死亡，及前期我们在NDVF3株诱导ECA109细胞的凋亡时检测到caspase-8和caspase-9的激活和断裂证实NDVF3诱导ECA109细胞凋亡是通过caspase依赖性凋亡途径的，又因24h时及以后Z-VAD-FMK不能抑制ECA109细胞发生的细胞病变效应（CytopathicEffect，CPE），48h细胞结构模糊。而空白对照组和阴性对照组的细胞则结构完整。我们的结果和相同浓度Z-VAD-FMK处理的三株NDVLaSota株，BeaudetteC株和FMW株诱导的人肺癌细胞[55]A549凋亡中的实验结果极为相似，细胞出现细胞病变现象的原因可能是因为单纯的病毒在其中的复制而引起的，也可能是因为NDV感受[56]后引起的细胞病变作用是NDV诱导凋亡所致。如果是后者提示NDVF3诱导ECA109细胞凋亡的途径中可能还存在caspase非依赖性凋亡通路。也可能是因为抑制剂不足以抑制不断复制的NDV，到达一定时间后新复制的NDV又开始走caspase依赖性凋亡通路。但究竟是哪一方面原因导致ECA109细胞细胞死亡还值得继续深入研究。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyADP-ribosepolymerase,PARP)是定位在细胞核内，是一种与单链DNA损伤修复密切相关的核酶。PARP被认为是caspase-3的作用底物，在大多数凋亡晚期的细胞中可以检测到被剪切为24和89KD的片段分别包含DNA结合域和PARP激活位[57]点。PARP除了是caspase-3的作用底物为凋亡提供能量外，还参与其它的生理活动，大量的PARP激活断裂可以引起线粒体损伤和凋亡诱导因子AIF的释放。AIF一旦释放到胞质中，它不仅可以增加线粒体膜电位，还可以定位于细胞核切割DNA引发凋亡，抑制AIF可以减少[58]放疗对HepG2细胞诱导的细胞凋亡。然而AIF途径不依赖于蛋白酶[59]家族。但它们彼此之间可能存在非常重要的协同促凋亡效果。ChenM等也报道PARP-1的释放对AIF从线粒体到核及AIF裂解染色体成核[60]碎片是非常重要的。NDVF3株诱导的凋亡通路很可能也通过AIF的caspase非依赖性途径。核酸内切酶G（GendonucleaseG，EndoG)是参与和caspase不相关[61]凋亡的另一个特殊内切酶，它广泛存在于真核细胞内。且它一般在47 研究论文[62]caspase缺失的时候从线粒体释放诱导凋亡，EndoG是唯一存在于线[63]粒体上的凋亡核酸酶。在细胞死亡过程中负责DNA降解。NDVF3诱导的凋亡通路是否通过以上caspase非依赖性途径还有待继续研究。48 研究论文结论1.对NDVF3HN基因序列进行了生物信息学分析，为后期研究HN结构与功能的研究打下了理论基础。2.构建了NDVF3HN基因的真核表达载体，并检测到了HN的表达，初步探索了其抗肿瘤特性。3.进一步证实NDVF3诱导ECA109细胞凋亡通过内源性及外源性caspase依赖性途径，但24h后细胞又开始继续发生细胞病变现象，提示NDVF3诱导ECA109细胞凋亡可能有caspase依赖性途径，同时可能也有caspase非依赖性的凋亡通路。49 研究论文参考文献1ZhaoL,LiuH.Newcastlediseasevirus:Apromisingagentfortumourimmunotherapy[J].ClinExpPharmacolPhysiol,2012,39(8):725-730.2BrownJM,AttardiLD.Theroleofapoptosisincancerdevelopmentandtreatmentresponse[J].NatRevCancer,2005,5(3):231-237.3BaiF,NiuZ,TianH,etal.GeneticallyengineeredNewcastlediseasevirusexpressinginterleukin2isapotentialdragcandidateforcancerimmunotherapy[J].ImmunolLett,2014,159(1-2):36-46.4ZeyaullahM,PatroM,AhmadI,etal.OncolyticVirusesintheTreatmentofCancer:AReviewofCurrentStrategise[J].PatholOncolRes,2012,18(4):771-781.5ChaiZ,ZhangP,FuF,etal.OncolytictherapyofarecombinantNewcastlediseasevirusD90strainforlungcancer[J].virolJ,2014,11:84.6LiuK,MaY,WangJ,etal.Compeletegenomesequencingandanalysisofananti-tumorNewcastlediseasevirusstrain[J].Gene,2013,525(1):47-57.7LambRA,KolakofskyD.Paramyxoviridae:thevirusesandtheirreplication.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins[M].In:FieldsBN,KnipeDM,HowleyPM,GriffinDE(eds)Fieldsvirology,4thedn.Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,PA,2001,1305-1340.8张琪,杨呜琦,王根辈,等.新城疫病毒和康莱特注射液联合抗肿瘤试验中瘤组织的病理变化及IL-6表达的研究[J].中国兽医杂志，2010,46(10):33-34.9KoksC,GargAD,EhrhardtM.Newcastlediseasevirotherapyinduceslong-termsurvivalandtumor-specificimmunememoryinorthotopic50 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综述综述应用于抗肿瘤中的重组新城疫病毒摘要：运用基因重组技术来增强NDV的溶瘤特性，已经成为未来研究NDV抗肿瘤的一种趋势。通过基因重组技术来增强NDV的溶瘤特性、肿瘤靶向性、促肿瘤凋亡、抗肿瘤免疫等或是减弱限制病毒复制的抗病毒免疫等，重组的NDV经插入外来基因的协同作用能够显著增强NDV抗肿瘤特性，因此未来重组NDV研究和应用方向可能是多种基因与NDV的联合重组。本文主要综述重组NDV的研究进展，并对其前景进行展望。关键字：新城疫病毒；重组；抗肿瘤新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）属于副黏病毒科，副[1]黏病毒属，是禽1型副黏病毒的唯一成员，NDV的全基因组长约15186bp,包含6个基因，分别编码至少8种蛋白，从3’端到5’端依次为核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶−(HN)和聚合酶蛋白(L)以及由P基因编码的V与W两种蛋白。目前癌症治疗面临两大难题：一是治疗伴随严重的副作用和[2]毒性；二是治疗效果欠佳。癌症终极治疗目标是在清除癌细胞的同时[3]对正常的细胞的损伤尽可能的小。而NDV可以选择性的在肿瘤细胞[4]中增殖并杀死肿瘤细胞，不损伤正常细胞。溶瘤活力NDV作为表达载体一直被看作是非常有潜力的基因治[5]疗载体，其优势如下：首先，重组后的NDV在肿瘤细胞中复制的同时在肿瘤细胞中局部表达外来基因，可避免某些外来基因对人类的全身毒性；其次，模块化性质的新城疫病毒基因组允许插入外来基因并使外源基因稳定表达，确保稳定重组新城疫病毒的构造；第三，新城疫病毒感染有被证实上调MHCI的表达，引起宿主对肿瘤的强CTL应答。它能够引发强烈的细胞免疫应答；第四，NDV是一种禽类病原体，这避免了先前人类病原体存在的对机体的免疫问题；第五，新城疫病56 综述毒虽可感染人类但仅引起轻微流感样症状且不经治疗可自愈。因此NDV是一种安全有效的抗肿瘤基因治疗载体，NDV与不同类型的外源基因重组可以发挥协同增效的作用。本文即对今年来重组NDV的抗肿瘤研究做一综述。1.NDV与细胞因子重组后的抗肿瘤研究IL15是一种具有较多功能的细胞因子，其能够促进T，B淋巴细[6,7]胞和NK细胞的增殖和分化，促进免疫球蛋白的分泌，IL15较IL2[8]能更有效地抑制肿瘤生长、复发和转移,而且最重要的是,IL15的副作[9][10]用比IL2小。NIUZS等将IL15基因插入到新城疫病毒HN与L基因之间，通过脂质体转染的方法，拯救重组病毒rNDV-IL15，测定病毒生长曲线，发现插入的IL15对病毒的复制动力学和生长特性基本无影响，体外感染黑色素瘤B16F10，检测到细胞上清液中高效分泌的IL15的表达，IL15可能只能在体内发挥刺激如T淋巴细胞增殖等免疫作用，在体外基本没有作用，而体内小鼠黑色素肿瘤模型中rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长。原因rNDV-IL15可能更好的发挥了++IL15诱导激活NK细胞、CD4和CD8细胞、增加CTL细胞毒作用等[8]浸润肿瘤细胞的功能，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。IL2是一种可以激活固有免疫和适应性免疫的系统的多效的细胞因子，且IL2可以参与T细胞增殖，产生IFN-γ，发挥细胞毒作用等[11]一系列T细胞的激活的活动，IL2能够促进淋巴细胞的增殖引发细胞毒性T淋巴细胞和淋巴因子激活使两者共同作用于肿瘤细胞，IL2还可以通过调节记忆性T细胞的数量和增强MHCⅡ的表达来杀伤肿瘤[12][13]细胞。BaiF选用广泛应用于制备疫苗的弱毒株NDVLaSota为载体在其HN和L基因间插入人IL2构建rLaSota/IL2的重组体，在体外分别感染肝癌细胞H22和黑色素瘤细胞B16-F10，结果表明rLaSota/IL2所表达的IL2聚集了大量的T细胞刺激免疫系统清除肿瘤细胞。体内实验发现rLaSota/IL2使小鼠脾脏产生了大量的IFN-a，接受rLaSota/IL2治疗组小鼠肿瘤体积缩小的程度、小鼠的平均生存期明显好于对照组。有增强的CTL活性，且接受重组体治疗的肿瘤细胞检测到更高的++CD4、CD8和MHCⅡ反应。研究者推测NDV的感染和表达产物IL257 综述协同发挥抗肿瘤作用，使得IFN-a发挥的抗病毒作用和激活固有、适应性免疫同时起效。由此推测rLaSota/IL2组对肿瘤的抑制不仅是靠病[14]毒的感染，而且是通过对肿瘤的免疫反应，可能的机制是重组的插入IL2的NDV显著的增加了病毒的免疫刺激特性和抗肿瘤反应，提示NDV为某些抗肿瘤很强而对正常组织毒副作用很大的外来基因提供了很好的平台，两者重组后可能会使外来基因集中于肿瘤，同时又保护正常组织免受其害。[15]GM-CSF可以招募和使树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞成熟，而经常用于抗肿瘤研究，为了增加抗肿瘤免疫效果优化肿瘤疫苗，[16]Janke1等选择了NDVUlster的两个插入位点NP的前面和HN与L基因之间，分别插入人GM-CSF，重组的能够诱导三倍强度的MCF-7肿瘤细胞的细胞毒作用。这种增强的肿瘤细胞毒作用可通过摄取凋亡小体和宿主树突状细胞交叉提呈肿瘤相关抗原最终导致一个增强的免[17]疫反应。重组能诱导固有免疫细胞如单核细胞和树突状细胞的激活，且能刺激外周单个核细胞PBMC产生IFN-a，这个反应强度超出单独的NDV或单独的GM-CSF，而且插入的治疗基因明显的增加病毒的免疫刺激作用和中和肿瘤等抗肿瘤作用。可见如何最大限度的提高重组NDV刺激外周血产生IFN-a的能力从而提高抗肿瘤效果仍是抗肿瘤道路上一项艰难的任务。[18]还有学者在NDV基因组的P与M基因间插入IL7，发现重组NDV依赖于CD8+T细胞增加抗肿瘤的免疫反应达到增加肿瘤特异性CTL抗肿瘤反应。2.NDV与促凋亡蛋白重组后抗肿瘤研究运用腺病毒载体或者痘病毒为载体表达凋亡素Apoptin，可以明显[19,20]抑制肿瘤生长诱发肿瘤细胞调亡。来源于鸡贫血病毒VP3又称Apoptin，是独立于P53对BCL2不敏感的凋亡蛋白，因其特异性感染[21,22]肿瘤细胞，而不感染正常细胞的特性一直被用作抗肿瘤。WuY等[23]将Apoptin基因插入到NDVFMW的P和M基因间，Apoptin的插入没有影响NDV的复制，体外实验发现在人肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系SMMC7721中rFMW/AP比FMW能更明显的降低肿瘤细胞58 综述存活率，rFMW/AP与FMW的感染对正常人成纤维细胞系MRC-5细胞基本没有影响。体内实验表明pFMW-AP组抑瘤效果更明显。其机制可能是重组的pFMW-AP中凋亡蛋白激活了树突状细胞DC细胞，提成给T淋巴细胞，最终引发细胞毒作用和肿瘤细胞凋亡。[24]研究显示NDV与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)重组后通过调节肿瘤细胞凋亡可以明显的抑制人肝肿瘤(HepG2)，黑色素瘤(B16-F10),人肺腺癌(A549)和小鼠结肠癌(CT-26)肿瘤细胞的生长，Bai[25]FL等证实IL-2和TRaIL基因与NDV重组后能协同增强NDV对肿瘤的溶瘤特性和机体的免疫刺激作用。其它还有NDV与自杀基因胞嘧啶[26]的有协同增强抗瘤作用。3.NDV与肿瘤特异性抗原的单抗IgG重组后的抗肿瘤研究[27]Puhler等选用了一种针对肿瘤特异性血管标记抗原的III型纤维连接蛋白额外结构域(ED-B)的单克隆抗体，ED-B与肿瘤的血管生成和生长密切相关。ED-B的单抗IgG作为外来基因插入到NDVMTH68株的F与HN基因间来探讨重组体的抗肿瘤效果。MTH87(EGFP)，MTH146(ED-Bantibody)，MTH115(β-glucuronidase)分别感染人结肠癌细胞HCT116和HT29，MTH146和MTH115显示了很强的溶瘤活性，重组体在感染后的第二到第五天就检测到人结肠癌细胞HCT11、HT29、人类非小细胞肺癌H460培养的上清液抗ED-B的单克隆抗体IgG，而正常的细胞成纤维细胞HS68、角化细胞HaCaT培养上清液则无。说明重组体可以特异性结合肿瘤组织的靶抗原。当前的抗体疗法是抗体多次全身给药，而病毒介导的外源基因表达产物在高局部的病毒复制过程中，即只表达在肿瘤组织上。NDV与肿瘤特异性抗原单抗的结合可以大大提高与肿瘤的特异性结合率。这种与肿瘤相关抗原的单抗为重组NDV更好的靶向肿瘤细胞提供了一个新的研究方向，这可能是未来重组NDV的一个新方向。鼠抗人单克隆抗体HAb18（靶向CD147分子)，CD147在肝癌HCC[28]细胞是多表达的且与肿瘤细胞的侵袭性相关。DingWei[29]等在NDVItalien株的F与HN基因间插入嵌合cHAb18基因，该基因在肿瘤组织中随病毒的复制表达完整的cHAb18抗体，研究显示59 综述rNDV-18HL结合了病毒的溶瘤特性和抗体疗法于一体，表现为增强的抗肿瘤效果；另一方面，rNDV-18HL特异性感染肿瘤细胞，直接引起肿瘤细胞溶解。从肿瘤细胞溶解产物释放随病毒一起表达的cHAb18抑制了肿瘤细胞的新城代谢。4.NDV增加溶瘤特性后的抗肿瘤效果通过3个氨基酸突变将NDV/B1的F蛋白的断裂位点序列由30]112G-R-Q-G-R-L117改为112R-R-Q-R-R-F117后即为rNDV/F3aa[，修饰的NDVF蛋白因容易被细胞内蛋白酶断裂而更易于进入细胞形成[31]合胞体。研究发现NDV/F3aa对经腹扩散的人胃癌细胞(MKN-74)、头颈部肿瘤的四种细胞系(MSKQLL1、MDA1586、SCC15，SCC25)有[31,32][33]很好的杀伤作用。在此基础之上，一年后Vigil为了增强rNDV/F3aa的抗肿瘤效果，分别在NDV/B1和rNDV/F3aa的基因组P与M基因间插入绿色荧光蛋白(GFP)分别来感染结肠癌CT26细胞和人肺癌A549细胞来检验rNDV/F3aa的抗肿瘤效果，在没有提前注射IFN-β的感染重组NDV组的24h后在绿色荧光的引导下两组均有绿色荧光的表达，而rNDV/F3aa组看到大量的多核细胞的形成，能够更好的抑制小鼠体内肿瘤的生长。而感染重组体前24h接受IFN-β的A549组因没有NDV的复制看不到绿色荧光。当NDV的F蛋白289位甘氨酸发生突变变成亮氨酸(L289A)后可形成增强的融合特性，且与rNDV/F3aa相比rNDV/F3aa(L289A)在肝癌[34]细胞HCC中发挥更强的细胞毒作用。由此展望rNDV/F3aa(L289A)作为载体与外源基因重组后可能会发挥更好的抗肿瘤效果，但关于rNDV/F3aa(L289A)与外源基因的重组尚未见报道。在此基础之上，他们又以rNDV/F3aa为载体构建表达GM-CSF，IFN-γ，IL2和TNF-a的重组体。发现接受rNDV/F3aa-IL2的治疗组有明显的肿瘤细胞衰亡现象。肿瘤的匀浆能够检测到IL2，而小鼠的血清+中检测不到IL2。rNDV/F3aa-IL2肿瘤浸润淋巴细胞明显增多。且CD4+和CD8细胞明显高于对照组。由此可见重组后的NDV仍可以特异性感染肿瘤细胞，两年后又有学者做了相似研究证实NDV/(F3aa)-IL2感染黑色素瘤可使小鼠脾脏产生特异性CTL及增强的IFN-γ。由此可见60 综述经修饰后的NDV与IL2重组其抗肿瘤效果可能是细胞因子里效果较理想的。5.NDV与减弱固有免疫反应的基因重组后的抗肿瘤效果由于许多病毒可使机体产生很强的固有免疫反应，从而抑制病毒的复制和传播，使得天然的NDV株的溶瘤特性相对较低，为了克服它[35,36]的抗IFN作用。NDV/B1和rNDV/F3aa感染机体导致了抗病毒的[37]细胞因子IFN-β的产生，从而抑制了NDVF3aa的复制，Zamarin等在NDV/F3aa基因组的P与M基因之间插入编码流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因，NS1蛋白是IFN的拮抗剂，流感病毒的NS1蛋白是通过抑制RIG-I调节一型IFN的活力发挥NDV(F3aa)-NS1抗病毒细胞因子延迟了6个小时才产生，NDV(F3aa)-NS1可明显抑制黑色素瘤B16-F10细胞的生长，且表现为增强的IFN-γ和CTL活性。证实NDV(F3aa)-NS1有很强减弱固有免疫反应的能力从而消除了IFN等抗病毒免疫反应，使得病毒更多复制，间接增加了NDV抗瘤性，NDV对INF的敏感性为其更好更有效的运用到临床提供了重要依据。由此可见调整NDV对机体所产生的固有免疫反应，将会提高NDV的溶瘤特性。与流感病毒相似的其它病毒蛋白已经被证实可以在一型IFN产生和循环的水平上阻止固有免疫的抗病毒信号传递，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RVG)是有效的保护性抗原，可以诱导机体产[38]生抗体及细胞免疫，最近一项研究将狂犬病毒糖蛋白与NDV重组对A549细胞有明显的抑制作用，其机制可能是重组病毒激活了机体的免疫相关反应增加了NDV自身溶瘤作用，这与免疫系统的激活有着密切的关系。针对各种不同的肿瘤细胞，用重组的NDV来表达插入蛋白同时达到基因治疗的有效性和安全性。达到使重组的NDV保持天然NDV的使用在安全内范围又能达到最好的激活机体免疫相关反应尚待继续深入研究。6.NDV与肿瘤相关抗原(TAA)重组后抗肿瘤研究将NDV的溶瘤特性与能刺激机体产生抗肿瘤免疫的TAA重组以[39]达到更好的抗瘤效果，Vigil等在NDV(NDV/F3aa)的P与M基因间插入编码特异性CD8T细胞表位TPHPARIGL(minigal)的β-半乳糖苷61 综述酶的TAA，发现瘤内注射重组NDV展示了一个增强的肿瘤特异性反应，重组后的NDV激活了抗肿瘤的特异性T细胞反应，肿瘤细胞显著消退，其机制是被NDV感染的肿瘤细胞同时表达TAA可以更易被机体发现肿瘤细胞，表达CD8T细胞TAA表位的重组体激发了一个直接靶向TAA的适应性免疫反应，激活抗肿瘤特异性淋巴细胞增强抗肿瘤效果。并且如果重组的NDV同时表达IL-2这种反应会增强,90%的小鼠的肿瘤细胞几乎完全消退，展示了表达TAA的重组NDV作为肿瘤的疫苗治疗载体潜力。提示在进行NDV重组时，对能提高对肿瘤细胞靶向性、能增加肿瘤细胞的特异性免疫性等多种基因的联合重组效果可能会更好的提升NDV的抗瘤效果。7.结语在NDV载体中插入位点也是影响抗肿瘤效果众多因素中很重要的因素，研究发现将分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因插入到NP和P基因，M和F基因，HN和L基因之间，SEAP的表达较高，而将外来[40][16]基因插入到L基因之后则SEAP的表达甚少，Janke1等也选择了NDVUlster的两个插入位点NP基因的前面和HN与L基因之间，分别插入人GM-CSF，用两种重组体分别感染人乳腺癌细胞MCF-7，上清液中GM-CSF的表达在插入NP基因前表达量更高些，HuangZ也得[28]出相类似的结论插入HN与L基因之间的氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的表达要比插入位点NP基因前面的表达要低。其原因可能与[41]病毒基因组从3’到5’端的转录并非均等且逐级下降有关。由此可见在进行重组时插入位置越靠基因组的前面，外来基因的表达量则越多。然而我们同样需要考虑插入外来基因后对病毒的复制及增值的影响，由于NP和P基因对副黏病毒的复制可能是非常重要的，因此表达在由于NP和P基因间的外来基因后期表达量减少；而插入在L基因后的外来基因虽然表达量较少，但是因其在基因组GE后面因此其在插入后对病毒基因组的复制影响是最小的。综上分析，保证插入基因后，要达到对病毒复最小影响并保证外源基因的蛋白表达量要综合考虑以达到联合抗肿瘤的最好效果。62 综述虽然大量的病毒载体已经被用作携带免疫调节基因的基因治疗载[33]体，但是总体来说，治疗效果依赖于载体的类型和肿瘤的模型。最大化地减弱病毒的副作用，及最大限度的发挥NDV的溶瘤特性，未来重组NDV的发展趋势可能是集最大限度地发挥NDV溶瘤的靶向性及有效性、最大限度减小其副作用等多种优势于一身的重组NDV，以及如何选择外来基因从而更好地提高重组rNDVs与外来基因重组后的溶瘤特性仍有广阔的研究前景。参考文献[1]LiuK,MaY,WangJ,etal.Completegenomesequencingandanalysisofananti-tumorNewcastlediseasevirusstrain[J].Gene,2013,525(1):47–57[2]ZhaoL,LiuH.Newcastlediseasevirus:Apromisingagentfortumourimmunotherapy[J].ClinExpPharmacolPhysiol.2012,39(8):725–730.[3]GerlR,VauxDL.Apoptosisinthedevelopmentandtreatmentofcancer[J].Carcinogenesis,2005,26(2):263–270.[4]ReichardKW,LorenceRM,CascinoCJ,etal.NewcastleDiseaseVirusSelectivelyKillsHumanTumorCells[J].JSurgRes,1992,52(5):448-453.[5]ZamarinD,VigilA,KellK,etal.GeneticallyengineeredNewcastlediseasevirusformalignantmelanomatherapy[J].GeneTher,2009,16(6):796–804.[6]OverwijkWW,SchlunsKS.FunctionsofYCcytokinesinimmunehomeostasis:currentandpotentialclinicalapplications[J].ClinImmunol,2009,132(2):153−165.[7]KlebanoffCA,FinkelsteinSE,SurmanDR,etal.IL-15enhancestheinvivo+antitumoractivityoftumor-reactiveCD8Tcells[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(7):1969−1974.[8]TangF,ZhaoLT,JiangY,etal.Activityofrecombinanthumaninterleukin-15againsttumorrecurrenceandmetastasisinmice[J].CellMolImmunol,2008,5(3):189−196.[9]SteelJC,WaldmannTA,MorrisJC.Interleukin-15biologyanditstherapeuticimplicationsincancer[J].TrendsPharmacolSci,2012,33(1):35−41.63 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致谢致谢特别感谢导师刘开扬教授从入学以来在学习，科研和生活方面对我的悉心教诲，耐心指导及无微不至的关怀。导师刘开扬教授知识渊博，谦虚上进，孜孜不倦尽职尽责，她严谨的治学态度及对工作的热忱和执着永远激励着我，使我内心总是充满着信心、希望和力量，我求学期间科研水平得到了很大的提升，在此，谨向恩师表示我最诚挚的谢意和崇高的敬意！特别研究生部袁博老师，王辉老师等研究生部老师及从入学以来对我学习上的鼓励和支持及生活上的关心和帮助。特别感谢刘进军老师，王静老师，武彩霞老师，赵铁军老师，刘华老师，杨翠军老师，兰金苹老师，刘宇老师等生命科学研究中心全体老师在实验期间给予的辛勤的指导和全力的帮助！特别感谢张效云教授，朱晓波教授，贾晓晖老师等医学检验学院老师在实验期间给予的指导和帮助！特别感谢河北北方学院2013级硕士研究生赵霞，郭玲玲，李婷，王树林，2014级研究生郭伟强，吴倍，马方旭，刘杨，杜云广、袁立娟、王欢欢等其他各位研究生的热情帮助和支持。特别感谢母校为我们的学习研究创造优越的环境及对我们的学习和生活的关心照顾！非常感谢我的家人，无论是物质方面还是精神方面，他们对我学习的理解与支持无时无刻不在激励着我！谨在此向以上及所有关心，帮助和支持我的老师，同学，朋友及家人致以最衷心的谢意，没有你们的鼓励和帮助我不可能顺利完成学业，谢谢你们！67 个人简历个人简历一、一般情况姓名李冠华性别女民族汉族出生日期1986年6月9日籍贯河北省武安市午汲镇二、个人经历2006年9月～2009年6月沧州医学高等专科学校医学检验学生2009年9月～2011年6月河北工程大学医学检验系学生2013年9月～2016年6月河北北方学院病原生物学硕士研究生三、发表论文1.李冠华,马媛媛,王静等.新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株HN基因的克隆与生物信息学分析[J].中国病原生物学,2016,11(4):305-311.2.新城疫病毒HBNU/LSRC/F3株HN基因的真核表达及抗肿瘤功能初探.已录用，待发表。四、获奖情况无五、承担或主研课题情况1河北省自然科学基金项目NDVHBNU/LSRC/F3全基因组蛋白对癌细胞调控的研究（项目编号：H2014405044）参与者2河北北方学院创新人才培育项目NDVHBNU/LSRC/F3株cDNA文库的构建、F基因片段的真核表达及抗瘤效果观察（项目编号：CXRC1318）参与者六、读研期间参加学术会议情况时间：2014年11月27日-11月30日会议名称：第十一届全国抗炎免疫药理学学术交流会主办单位：苏州大学68