重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定及其分子检测体系的建立

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单位代码10635学号112015325001719硕士学位论文重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定及其分子检测体系的建立论文作者：张红楠指导教师：梁国鲁研究员吴頔讲师学科专业：细胞生物学研究方向：细胞遗传提交论文日期：2018年4月10日论文答辩日期：2018年5月22日学位授予单位：西南大学中国重庆2018年6月 SouthwestUniversityMasterDissertationIdentificationandmoleculardetectionofpathogenscausinganthracnoseonloquatinChongqingCandidate:ZhangHongnanSupervisor:Prof.LiangGuoluDr.WuDiMajor:CellbiologyResearchofInterest:CytogeneticsChongqing·ChinaJune·2018 目录摘要................................................................................................................................IAbstract............................................................................................................................V缩略词和英汉对照表.....................................................................................................IX第1章文献综述.............................................................................................................11.1枇杷炭疽病的研究概况.....................................................................................11.1.1枇杷炭疽病的症状...................................................................................11.1.2国内外枇杷炭疽病的发生.......................................................................21.1.3枇杷炭疽病的流行...................................................................................31.1.4枇杷炭疽病的防治...................................................................................41.2枇杷炭疽病病原菌的研究概况.........................................................................51.2.1炭疽病病原菌属的分类及生物学特征...................................................51.2.2分子标记技术在炭疽病病原菌属系统分类中的应用...........................61.2.3枇杷炭疽病病原菌的研究进展...............................................................91.3真菌病害病原菌分子检测技术研究进展.......................................................101.3.1Nested-PCR检测技术及其应用.............................................................101.3.2其他分子检测技术及其应用.................................................................111.4研究目的及意义、研究内容和技术路线.......................................................121.4.1研究目的及意义.....................................................................................121.4.2研究内容.................................................................................................121.4.3技术路线.................................................................................................12第2章重庆地区枇杷炭疽病病原真菌鉴定...............................................................152.1主要试剂及仪器...............................................................................................152.1.1主要试剂.................................................................................................152.1.2主要仪器.................................................................................................152.1.3主要培养基配制.....................................................................................152.2试验方法...........................................................................................................15 2.2.1枇杷炭疽病病害调查.............................................................................152.2.2样品采集.................................................................................................162.2.3病原菌分离纯化.....................................................................................162.2.4炭疽病病原菌的形态学观察.................................................................162.2.5DNA提取和PCR扩增..........................................................................162.2.6核苷酸序列比对和系统发育树构建.....................................................182.2.7致病性测定.............................................................................................182.3结果与分析.......................................................................................................192.3.1枇杷炭疽病田间发病规律......................................................................192.3.2供试菌株.................................................................................................212.3.3枇杷炭疽病病原菌形态学鉴定.............................................................232.3.4枇杷炭疽病病原菌PCR扩增...............................................................282.3.5枇杷炭疽病病原菌分子系统学分析.....................................................302.3.6枇杷炭疽病病原菌致病性测定.............................................................412.4结论与讨论.......................................................................................................43第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立.....453.1引言...................................................................................................................453.2材料和方法.......................................................................................................453.2.1参试菌株及枇杷品种.............................................................................453.2.2植物组织及病原菌DNA提取..............................................................463.2.3特异性引物设计.....................................................................................473.2.4常规PCR及Nested-PCR反应.............................................................503.2.5灵敏度检测.............................................................................................503.2.6枇杷病组织快速检测.............................................................................503.3结果与分析.......................................................................................................503.3.1基因组DNA的提取...............................................................................503.3.2PCR引物筛选.........................................................................................533.3.3PCR引物的特异性检测.........................................................................543.3.4常规PCR与Nested-PCR灵敏度检测.................................................55 3.3.5Nested-PCR野外时效性检测.................................................................573.4结论与讨论.......................................................................................................60第4章结论...............................................................................................................63第5章创新点与研究展望...........................................................................................655.1创新点..............................................................................................................655.2研究不足..........................................................................................................655.3研究展望..........................................................................................................65参考文献.........................................................................................................................67致谢.............................................................................................................................77发表论文、获奖及科研情况.........................................................................................79 摘要重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定及其分子检测体系的建立细胞生物学硕士研究生：张红楠指导教师：梁国鲁研究员吴頔讲师摘要枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）是一种起源于中国的亚热带常绿果树，因其果实营养丰富，风味独特，而且具有润肺、健胃、润脾等功效而受到广大消费者喜爱，但近年来炭疽病的发生严重影响了枇杷产业。枇杷炭疽病主要为害枇杷叶片、果实，发病时叶片和果实将出现褐色病斑。在果实上，一旦感病，病斑将迅速扩大并凹陷，呈水渍状，侵染处果肉软腐。除了田间发病，在采后阶段炭疽病菌也可引起果实腐烂，上述症状均给果农和消费者造成了巨大的经济损失。此外，前人研究表明枇杷炭疽病菌具有潜伏侵染现象，若在田间观察到病症再进行防治已为时过晚。因此，建立一种快速、准确的枇杷炭疽病菌分子检测技术十分必要。为此，本研究对重庆北碚区和合川区疑似炭疽病的枇杷病叶和病果进行组织分离、鉴定，明确重庆地区枇杷炭疽病病原菌种类；建立了枇杷炭疽病的nested-PCR快速分子检测体系，为枇杷炭疽病早期诊断和有效防治提供了技术支撑。主要研究结果如下：1.2016年2月-10月，于西南大学种质资源圃对枇杷炭疽病的田间发病规律进行调查，结果显示：4月上旬为枇杷叶片炭疽病的始发期，病情指数为3.3%；4月下旬到6月上旬为爆发期，病情指数从10.6%增至31%；6月下旬到7月下旬为该病的发病高峰期，病情指数维持在41%左右。通过测定试验地块温湿度可知，炭疽病爆发期及高峰期温度为25-30℃，相对湿度为60%左右，可见高温高湿有I 西南大学硕士学位论文利于病害的发生蔓延，特别是夏稍新叶最易发病。2.2015-2017年，从西南大学枇杷种质资源圃、西南大学105枇杷种植基地和合川渭沱枇杷种植区共采集疑似炭疽病病样标本218份，共分离纯化得406株菌株。综合形态学鉴定结果及单基因和多基因联合的系统发育分析，将重庆地区所分离得到的131株刺盘孢属菌株共划分为3个种，分别为胶孢刺盘孢C.gloeosporioides（42株）、尖孢刺盘孢C.acutatum（61株）及喀斯特刺盘孢C.karstii（28株）。3.采用分生孢子悬浮液接种法对枇杷品种“金华1号”、“华白1号”进行致病性测定，结果显示：131个刺盘孢属菌株对叶片和果实有伤接种均可致病，并产生典型的枇杷炭疽病病症，回接症状与田间自然发病症状较为相似，说明所有刺盘孢属菌株均有致病性，但它们的致病力存在差异。在叶片上，C.gloeosporioides致病力最强，C.acutatum次之，C.karstii最弱。在果实上，C.acutatum致病力最强，C.gloeosporioides次之，C.karstii最弱。4.基于核糖体DNA序列对比枇杷炭疽病两个重要病原菌C.gloeosporioides和C.acutatum的差异序列，设计并合成特异性引物，经筛选得到2对特异性巢式内引物Cg1F/R和Ca1F/R。以真菌通用引物对ITS1/ITS4作为外引物，专化性引物对Cg1F/R作为内引物的nested-PCR体系只在C.gloeosporioides中扩增出392bp的特异片段，在其它病原真菌中无扩增片段。同样，以专化性引物对Ca1F/R作为内引物的nested-PCR体系只在C.acutatum中扩增出490bp的特异片段，在其它病原真菌中无扩增片段。5.用Cg1F/R进行常规PCR扩增，检测C.gloeosporioides菌株基因组DNA3的灵敏度为1ng/μL，而nested-PCR的灵敏度达到1pg/μL，是常规PCR的10倍；用Ca1F/R进行常规PCR扩增，检测C.acutatum菌株基因组DNA的灵敏度6为10pg/μL，而nested-PCR的灵敏度为10ag/μL，是常规PCR的10倍。6.从田间采集60份已显症的疑似枇杷炭疽病叶片和27份未显症叶片，显症叶样中，利用传统分离鉴定法从39份病样中均分离获得刺盘孢属菌株，其中6份病样同时分离获得C.gloeosporioides和C.acutatum；2份病样同时分离获得C.gloeosporioides和C.karstii；17份病样仅分离出C.gloeosporioides；12份病样仅分离出C.acutatum；2份病样仅分离出C.karstii。利用本研究建立的nested-PCR分子检测体系从44份病样中均检测出刺盘孢属菌，其中9份病样同时检测到C.gloeosporioides和C.acutatum，比传统鉴定结果多3份，19份病样仅检测出C.gloeosporioides，与传统鉴定结果一致；16份病样仅检测出C.acutatum，比传统鉴定结果多4份。可见，本研究建立的nested-PCR分子检测体系的检出率高于传统分离鉴定法。未显症叶样中，利用传统分离鉴定法从2份病样中分离得刺盘孢II 摘要属菌，均为C.gloeosporioides；采用nested-PCR法从9份病样中检测出刺盘孢属，其中6份病样检测到C.gloeosporioides，3份病样检测到C.acutatum。由此可见，该体系可检测携带微量C.gloeosporioides或C.acutatum的枇杷叶片。综上，本研究明确了重庆地区枇杷炭疽病是由胶孢刺盘孢C.gloeosporioides、尖孢刺盘孢C.acutatum及喀斯特刺盘孢C.karstii所致，其中C.gloeosporioides和C.acutatum为主要病原菌。此外，以ITS1/ITS4为外引物，Cg1F/R为内引物和以ITS1/ITS4为外引物，Ca1F/R为内引物的2套nested-PCR体系分别能够快速、高效检测携带微量C.gloeosporioides和C.acutatum的枇杷叶片。可见，本研究所建立的2套nested-PCR体系可为枇杷炭疽病的主要病原菌的快速检测和早期病害诊断工作提供技术支撑。关键词：枇杷；炭疽病；鉴定；巢式PCR；快速检测III AbstractIdentificationandmoleculardetectionofpathogenscausinganthracnoseonloquatinChongqingCandidate:ZhangHongnanSupervisor:Prof.LiangGuoluDr.WuDiAbstractLoquat(EriobotryajaponicaLindl.)isasubtropicalevergreenfruittreeoriginatingfromChina.Itisfavoredbyconsumersforitstasty,nutritiousfruitsandthepositiveeffectsonthelung,stomachspleen.However,theoccurrenceofanthracnoseendangeredtheloquatproductioninthepastfewyears.Anthracnoseofloquatmainlyinfectedleavesandfruits.Brownspotssymptomswereobservedontheleavesandfruitsafterinfection.Syptomsondiseasedfruitswouldrapidlyexpandandappearasslightlysunken,water-soakedandsoftlesions.Additionally,anthracnosecouldalsocausefruitdecayafterharvest.Theabovesymtomsresultedineconomiclosstogrowersandconsumers.Inaddition,itwasreportedthatthenatureoflatentinfectionwereobservedonloquatanthracnoseanditwastoolatetocontrolthediseaseaftervisualsypmtomsappearedinfields.Therefore,itisnecessarytodeveloparapid,responsiblemethodtodetectanthracnoseofloquat.Theobjectiveofthisstudywastoidentifythepathogenscausingloquatanthracnose.ThediseasedleavesandfruitscollectedinBeibeidistrictandHechuandistrictinChongqingwereplacedonpotatodextroseagarplate.ThepurifiedisolateswerechosenforrDNA-ITSsequenceandpathogenicitytest.Theotherobjectiveofthisstudywastodeveloparapid,responsibledetectionsystembasedonnested-PCRtoV 西南大学硕士学位论文providetheoreticalfoundationforearlydectionandeffectivecontrolofloquatanthracnoseofloquat.Themainresultswereasfollows:1.DuringFeb.2016toOct.2016,theincidenceofloquatanthracnosewasinvestigatedintheSouthwestUniversityLoquatGermplasm.ItshowedthattheinitialperiodofloquatanthracnoseinChongqingwasearlyAprilandthediseaseindexwas3.3%.ThediseaseoutbrokeduringlateApriltoearlyJuneandthediseaseindexincreasedfrom10.6%to31%.DuringlateJunetolateJuly,theloquatanthracnoseenteredpeakperiodandthediseaseindexstabilizedaround41%.Moreover,thetemperaturewasat25-30℃andtherelativehumiditywas60%fromanthracnoseoutbreakperiodtopeakperiod.Itindicatedthathightemperatureandhighhumiditycontributedtothespreadofloquatanthracnose,especiallytheyoungleavesofsummershootsweresensitivetoloquatanthracnose.2.During2015to2017,218sampleswithdiseasewerecollectedfromSouthwestUniversityLoquatGerplasm,SouthwestUniversity105plantationbaseandplantationbaseofWeituoinHechuandistrict.Intotal406strainswereisolatedfromallthesamplesandofwhich131isolatesbelongedtoColletotrichumaccordingtothecolonymorphology,phylogeneticanalysisbasedonrDNA-ITSsequence.Toidentifythe131Colletotrichumisolatesatspecieslevel,theITS,CAL,GAPDH,CHS-1andTUB2regionofthemwereamplifiedandsequenced.Withthemorphologicalobservationresults,131ColletotrichumisolatesfromloquatanthracnoseweregroupedintothreespecieswhichwereC.gloeosporioides(42isolates),C.acutatum(61isolates)andC.karstii(28isolates).3.Thepathogenicitytestswereconductedonthecultivarsnamed„JinhuaNo.1‟and„HuabaiNo.1‟usingsporesuspension.Pathogenicitytestresultsshowedthat131Colletotrichumisolatesappearedtypicalsymptomsbothontheleavesandfruitsafterwoundinoculationandthere-isolatedstrainscausedsimilarsyptomasthatinthefields.However,onleaves,thepathogenicityofC.gloeosporioideswashighestandC.karstiiwasweakest.Onfruits,thepathogenicityofC.acutatumwashighestwhileC.karstiiwasweakest.4.Twospecificnestedinnerprimerpairs,Cg1F/Rscreenedfrom20pairsandCa1F/Rscreenedfrom17pairs,weredesignedbasedonthedifferentribosomeDNAVI AbstractsequencebetweenC.gloeosporioidesandC.acutatum.ThenestedPCRwhichsettheuniversalprimerpairITS1/ITS4asouterprimerandCg1F/Rasinnerprimercouldamplify392bpfragmentonlyfromC.gloeosporioides.Noamplificationproductwasobservedfromothertestedfungi.ThenestedPCRwhichsettheuniversalprimerpairITS1/ITS4asouterprimerandCa1F/Rasinnerprimercouldamplify490bpfragmentonlyfromC.acutatum.Noamplificationproductwasobservedfromothertestedfungi.5.InthenestedPCRusingCg1F/Rprimerpair,thesensitivityofdetectionwas13pg/μLwhichwas10timesasthatintheconventionalPCR(1ng/μL).Meanwhile,thesensitivityofdetectionintheconventionalPCRusingCa1F/Rwas10pg/μLandwhichinthenestedPCRwas10ag/μL.ThesensitivityofCa1F/RinthenestedPCR6was10timesasthatintheconventionalPCR.6.60loquatsampleswithtypicalanthracnosesymptomsand27sampleswithoutsymptomswerecollected.Ofallthesampleswithsymptoms,Colletotrichumwereidentifiedfrom39samplesintotalusingtraditionalisolationandidentificationmethods.C.gloeosporioidesandC.acutatumweresimultaneouslyisolatedfrom6samples,C.gloeosporioidesandC.karstiiweresimultaneouslyisolatedfrom2samples.C.gloeosporioides,C.acutatumandC.karstiiwereindividuallyisolatedfrom17,12amd2samples,respectively.Ofallthesampleswithsymptoms,Colletotrichumweredetectedfrom44samplesintotalusingnested-PCRdevelopedinthisstudy.C.gloeosporioidesandC.acutatumweresimultaneouslydetectedfrom9samples.C.gloeosporioideswasindividuallydetectedfrom19sampleswhichwasconsistentwithtraditionalidentificationmethod.Moreover,C.acutatumwasindividuallydetectedfrom16samples.Itshowedthatthenested-PCRmoleculardetectionsystemdevelopedinthisstudywasmoreeffectivethantraditionalmethod.Ofallthesampleswithoutsymptoms,C.gloeosporioideswereidentifiedfrom2samplesintotalusingtraditionalmethod.However,Colletotrichumweredetectedfrom9samplesusingnested-PCRmethod.C.gloeosporioidesandC.acutatumweredetectedfrom6and3samples,respectively.Itshowedthatthenested-PCRmethodcoulddetectC.gloeosporioidesandC.acutatumtracesontheleavesofloquat.Inconclusion,itwasconfirmedthatthecausalagentofloquatanthracnosewereC.VII 西南大学硕士学位论文gloeosporioides,C.acutatumandC.karstiiusingtraditionalisolationandidentificationmethods.ThemaincausalagentswereC.gloeosporioidesandC.acutatu.Furthermore,theprocedureofnested-PCRwhichsetITS1/ITS4asouterprimer,Cg1F/RandCa1F/Rasinnerprimerwasarapid,effective,specificandsensitivemethodtodetectC.gloeosporioidesandC.acutatum,respectively.Thisstudyprovidedtechnicalsupportforrapiddetectionofpathogensandearlydiagnosisofloquatanthracnose.Keywords:Loquat;Anthracnose;Identification;Nested-PCR;RapiddetectionVIII 缩略词和英汉对照表缩略词和英汉对照表缩略词英文全称中文全称ITSInternaltranscribedspacers基因内转录间隔区GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase3-磷酸甘油醛脱氢酶CHS-1Chitinsynthase几丁质酶TUB2β-tubulin-geneβ-微管蛋白2CALCalmodulingene钙调蛋白RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性RAPDRandomamplifedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNALAMPLoop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增反应ISSRInter-simplesequencerepeat内部简单序列重复TBETBEbufferTBE电泳缓冲液PDAPotatodextroseager马铃薯葡萄糖琼脂培养基IX 第1章文献综述第1章文献综述枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）隶属于蔷薇科（Rosaceae）、枇杷属（Eriobotrya），其栽培历史已超过2100年。枇杷易于栽培种植，适应性较强，经济效益高，果实不仅营养丰富，风味独特，而且具有润肺、抗炎、止咳平喘、健[1]胃润脾等功效，因而深受国内外消费者喜爱，从而成为了世界性精美果品之一。[2,3]枇杷在30多个国家和地区均有分布和栽培，其中，我国枇杷的栽培面积和总产量均居于世界首位。据相关资料统计，我国枇杷栽培面积已达11.28万公顷以[4,5]上，约占世界的79%；枇杷产量在38.79万吨以上，占世界总产量的70%以上。但是，随着种植面积逐年扩大，枇杷从种植、采收到果实的贮存、运输等整个过[6-8]程中都会受到各种病害的危害，仅真菌性病害就达20余种。田间调查统计发现，炭疽病是枇杷生产中危害最严重的病害之一，该病害主要危及枇杷叶片和果[9]实，常常造成苗木溃变，树势早衰，果实腐烂，严重时导致苗木死亡。炭疽病不仅能够影响枇杷产量，而且还能够严重影响果实品质，同时也是制约果实采后贮藏和长途运输的主要因素。枇杷炭疽病在世界各国的枇杷产区均有发生，中国[10-13][14][15][16][17][18]、日本、巴基斯坦、美国加利佛尼亚州及德克萨斯州、印度、澳[19]大利亚等多个国家均有相关报道，对枇杷的生产和安全造成巨大危害，严重制约着枇杷产业的生产和发展。1.1枇杷炭疽病的研究概况1.1.1枇杷炭疽病的症状近年来，枇杷炭疽病已经成为枇杷最严重的病害之一，不仅严重危害幼苗、叶柄、叶片及果实，甚至在整个生长期均会对枇杷产生侵染和影响。如果枇杷幼苗受到病原菌侵染，会导致叶片脱落，危害严重时，苗木甚至会全株枯死；叶柄与叶片交界处的叶柄上也易染病，病症的初期表现是出现暗绿色小点，之后会逐渐发展成不规则的褐色至黑褐色长条形病斑，发病后期在病害部位常常密生小黑点，即病原菌的分生孢子盘；在果实发病初期，果实表面往往发生淡褐色圆形小病斑，随后病斑会逐渐蔓延扩大，呈水渍状，染病的果肉和健康的果肉界限不明显，发病后期果实病害处表面干缩凹陷，密生小黑点（病原菌的分生孢子盘）、呈同心轮纹状排列，天气潮湿时会有淡红色粘质物（即病原菌的分生孢子团）溢出，蔓延至整个果实，致使全果腐烂呈暗褐色或干缩呈僵果，特别是在果实成熟前如[20]果遇到连续高温阴雨天气，果实就会严重发病而造成大面积腐烂脱落，极大地影响枇杷的产量和品质，严重制约了枇杷的生产和安全。枇杷夏梢新叶更容易感染此病，严重时甚至会造成叶片大量枯死或脱落；叶片染病时，往往会形成圆形、1 西南大学硕士学位论文长形、椭圆形或不规则形状的病斑，病斑直径为3-30mm，一般多发生于叶缘，发病后期叶片病斑中央呈灰白色，边缘为暗褐色，干燥易脆裂，病斑扩展延伸后可互相接触愈合为赤褐色大斑，有时也会出现不规则的同心轮纹，着生暗褐色小点（即病原菌分生孢子盘）。[21]图1-1陈福如等报道的枇杷炭疽病病症[21]Fig.1-1SymptomsofanthracnoseofloquatreportedbyChenA：炭疽病病果；B：炭疽病病叶初期症状；C：炭疽病病叶后期症状A:anthracnoseinfruit;B:theinitialsymptomsofanthracnoseinleaf;C:thelatersymptomsofanthracnoseinleaf1.1.2国内外枇杷炭疽病的发生目前国内外有关刺盘孢属在枇杷上引起植物病害的报道屡见不鲜。早在1975[16]年美国加利佛尼亚州就开始出现对于枇杷炭疽病的报道；随后，在1979年德[17]克萨斯州也发现枇杷炭疽病的发生；同年，印度也出现关于枇杷炭疽病症状的[18]报道；之后，在1994年日本的千叶县馆山市、鹿儿岛垂水市等地区也发现炭[22]疽病的流行，TSato等已对炭疽病病原菌的特性做了详细描述；近些年来，澳[19][15]大利亚以及巴基斯坦也已先后报道了枇杷炭疽病的发生和危害。而在国内几[23]大枇杷主产区也均有枇杷炭疽病的报道，戴芳澜等在1958年就对福建地区枇杷炭疽病有过报道，而后陆续又有多名研究学者对福建枇杷炭疽病进行研究；2010[24]年，孔琼等首次在云南蒙自枇杷种植园中分离到枇杷炭疽病菌并对其生长特性进行了研究和报道。而在2009-2010年发现，在贵州遵义、罗甸（苗圃）枇杷树[12]叶片上首次出现炭疽病害，且有暴发之势；2014年开阳县植保植检站等工作人员对贵州开阳县枇杷种植园常见病害进行了全面调查，结果发现炭疽病是枇杷最[25][26]常发病且发病较为严重的病害之一；张丹华在2016年分别对四川、重庆不同种植园枇杷病害进行了年周期观察，调查发现炭疽病在高温多雨时会迅速流行传播；从2017年5月到6月的短短两个月内，在四川成都周边几个主要园区因采[27]后储存期间发生炭疽病而造成的损失至少3%。2 第1章文献综述1.1.3枇杷炭疽病的流行1.1.3.1越冬枇杷炭疽病菌的分生孢子只能在温度适宜的环境存活，故其不能在低温下存活，但它的菌丝活力比分生孢子强，可以越冬。故枇杷炭疽病菌的菌丝可以在枇[28]杷树的干枯枝、病虫为害的破伤枝、僵果和病果等处越冬，病菌在这些部位形成分生孢子盘，翌年春天遇到适宜的温度和湿度，即可产生大量的分生孢子侵染果实和树体，发生侵染依气侯情况而定，与降雨量也有较大关系。1.1.3.2侵染过程枇杷炭疽病菌的分生孢子一般从伤口、气孔等入侵，有时也可以直接穿透表皮入侵。分生孢子借助风、雨、昆虫等媒介进行传播，在20℃-30℃时比较适宜孢子萌发，其中以25℃的萌发率为最高，5℃以下或者45℃以上均不适宜孢子萌发；孢子萌发与湿度环境有较大关系，在相对湿度98%时，孢子萌发率仅为53%，[29]而在饱和湿度和水滴中的萌发率则达到72.35%。孢子萌发后可产生芽管，芽[30]管与寄主表面接触后顶端膨胀形成附着胞附着在寄主表面，而后进行侵染。侵入后从附着胞的下方又产生侵入菌丝，而其在细胞间隙生长可导致寄主细胞被破[31,32]坏，大约在7天后病菌又可产生新的分生孢子。1.1.3.3潜育期由于未成熟枇杷中绿原酸含量较高，同时含有的一些抑菌物质能够钝化病原菌分泌的水解酶，所以病原菌的附着胞通过皮孔侵入枇杷后不会立即产生侵入菌丝，而是埋藏在枇杷表皮或角质层内，静止休眠可达数月，表明炭疽病菌具有潜伏侵染的特性。但是，随着果实不断成熟、采收，其生理状况不断发生改变，例如细胞膜通透性发生变化、释放出可溶性养料、抑菌物质浓度降低、呼吸作用增[33,34]强等，枇杷自身抗病能力随之不断降低，此时病原菌附着胞结束休眠，开始产生侵入菌丝，穿透寄主角质层和细胞壁，进而侵入果实扩展致病。1.1.3.4流行炭疽病菌分生孢子的传播和萌发都需要相对的高温高湿环境，因此在每年4-6月，若是遇到阴雨连绵，或晴雨相间的潮湿天气，大量的分生孢子在此较为适宜的条件下不断萌发并持续传播，一旦生长期的果实发病又会成为新的病原中心，进一步产生大量分生孢子进行再次侵染，生长季节不断出现的新病果导病原菌反复再次侵染和病害蔓延，最终枇杷炭疽病将会严重发生，并迅速流行。果实染病后或进入潜伏期，在采后或者贮藏期如果遇到适宜条件，仍可出现病斑，并3 西南大学硕士学位论文会快速传播，最后可能造成贮藏期大量果实腐烂变质。高温高湿的环境是炭疽病发生流行的主要因素，而除此之外，枇杷种植年限过长、水肥管理不当、种植密度过大、排水不良、通风不良、产后没有及时清理果园和用药不科学等也是其流行传播的重要原因。1.1.4枇杷炭疽病的防治1.1.4.1清除侵染源目前了解到炭疽病菌主要在病枝、僵果、病果上越冬，因此可通过冬季清园的措施清除菌源。清除僵果和病果、剪除病虫枝和干枯枝、刮除病皮和粗皮，集中焚烧，断绝病源。同时也要把枇杷园区内杂草清除干净，堆肥或深埋。剪去荫蔽枝、密生枝、重叠枝，使树冠通风透光，减轻病菌为害。夏季发现病果最好及时摘除并烧毁，清除落果以减少病源，但在一些大型果园因果实需要套袋，观察病果落果不易实现，因此还是要以冬季剪枝清除越冬病菌为主。1.1.4.2农业防治选用和选育抗病品种，提高枇杷树体自身抗病能力，是控制病害发生的基本措施。此外还要加强果园管理，合理挂果负载，确保树势健康；采果后选择适宜时间剪除过密枝、光腿枝，特别要剪去病虫枝；压低枇杷旺枝使其缓慢生长，以促进夏梢的抽发，保证整株协调生长；控制氮肥、增施磷钾肥，多施有机肥；而且还要搞好排灌系统，做到雨季能排水、旱时能灌水，不使土壤过干过湿；幼树[35]果园在7-8月一般不灌溉浇水，但要及时疏松树盘。研究表明，枇杷幼果期和果实膨大期采取疏果、喷药和果实套袋等农艺措施是有效控制果实炭疽病的方法[36]。通过这些农艺措施，就能达到增强枇杷树体抗病能力，减少或减轻病害的发生。1.1.4.3化学防治化学防治又叫农药防治，是用具有毒性的化学药剂来防治病虫害的措施。化学防治是植物保护最常用的方法之一，也是综合防治方法中一项重要措施。使用化学农药最关键的就是对施药时期的把握。首先在新梢抽发期，可用65%代森锌可湿性粉剂600倍液或50%多菌灵可湿性粉剂800-1000倍液喷治，每隔10-15[37]天，连续喷施2-3次进行防治。第二个时期是花期，也称秋梢抽生期，此时期秋雨不断，环境潮湿，病害发生较为严重，因此一定要加强防治，可以喷施65%代森锰锌可湿性粉剂800倍液或是70%甲基托布津可湿性粉剂800-1000倍液进行防治。第三个时期就是果期，此期是控制炭疽病病害的关键时期，也是关系到4 第1章文献综述枇杷增产收益的关键时期，化学防治药剂与花期基本相同，但用药时机一定是关[38]-1-1键。枇杷采收后，立即用500µg·mL苯来特浸果30s，或用1000µg·mL施-1保功和200µg·mL百可得的混合溶液洗果，再结合乙烯吸收剂处理后用PE保鲜[39]膜封口，能起到很好的防病效果。1.1.4.4生物防治生物防治是利用微生物之间的拮抗作用，选择对寄主不造成伤害，但对病原菌有明显抑制作用的微生物来防治寄主病害的一种有效方法。王晓莉研究发现无论是分别利用生防菌蜡质芽孢杆菌（Bacilluscereus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus[40][41]subtilis），还是利用其混合菌剂均能提高枇杷果实对炭疽病的抗病性。Cao等通过研究生防酵母Pichiamembranefaciens对枇杷采后炭疽病的拮抗效果，发现生防酵母的细胞悬浮液可以显著抑制炭疽病孢子萌发和芽管生长，从而减少收获后由炭疽病引起的果实腐烂。另外，在应用生防酵母菌株防控水果采后炭疽病的研[42]究中，Cao等在现有生防酵母菌株基础上，与茉莉酸甲酯混合处理，发现其混[43]合处理比分别单独使用具有更高的防病效果。刘凤娟等则探究了Pichiaguilliermondii与热处理相结合的方法对枇杷炭疽病的防治作用，结果发现，复合处理能够诱导枇杷果实产生抗病性，降低炭疽病的发生。1.2枇杷炭疽病病原菌的研究概况1.2.1炭疽病病原菌属的分类及生物学特征早在1790年，生物学家Tode最早观察到刺盘孢属真菌，并首次将刺盘孢属[44]命名为Vermicularia，而到1831年Corda又将分生孢子盘上具有刚毛的[45]Colletotrichum从Vermicularia分出来另名刺盘孢属。但是，自从刺盘孢属建立以来，其分类和命名一直都很混乱，这主要是由于在传统的半知菌分类系统中根据不稳定的形态学特征和发育学特征进一步划分出了与ColletotrichumCda.没有[46]差异的几个属所致，也就是说该时期进行菌属分类的依据主要是寄主类型，那么就会出现只要从一种未曾报道过的寄主上分离得到该属真菌，就会被当作新种[47]进行描述和研究，从而就导致许多异名同种的菌株出现。随着研究的不断深入，刺盘孢属的分类也在发生着变化。1957年ArxJ·von根据分生孢子、附着胞等的[48]形态特征和纯培养特征将750多个种合并成为11个种，这一分类系统基本上得到了学术界的认可和肯定，但是这一系统也存在着一定的缺陷，比如对胶孢炭疽菌（Colletotrichumgleoeosporiodies）和黑线炭疽菌（Colletotrichumdenatium）[49]种下的生理型仍采用原种级双名指称是不够准确的，事实上这些型多应为种。因此，在1962-1991年间Sutton又做了更深一步的研究，以纯培养物产生的分生5 西南大学硕士学位论文孢子和附着胞的形态特征为研究基础并结合培养物的基本特征和寄主范围重新确[50]立了炭疽病属的分类，把Arx所确立的11个种再次扩展为39个种。而1992年Sutton又报道了C.gloeosporioides中存在极度的变异，即C.gloeosporioides在培养过程中的生长特征、孢子形态、附着胞形态和致病力等存在较大差异，因此可认为C.gloeosporioides是一个庞杂种群，而且有必要对种以下的分类单位做更[51-53]深入的研究。近些年来，Sutton分类系统得到了越来越多学者的认可，并逐渐被业界接受，因此，真菌学家分类仍然以Sutton分类系统为主。在Ainsworth（1973）分类系统中刺盘孢属（ColletotrichumCorda.）隶属于真菌门（Eumycota）、半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目（Melanconiales）、黑盘孢科（Melanconiaceae）。刺盘孢属真菌寄主范围十分广泛，而且地域分布也非常广泛，其分生孢子盘产生于寄主植物角质层下、表皮或表皮下，散生或聚生，不规则形开裂；培养过程中有时会产生菌核，菌核上和分生孢子盘中有时生刚毛，刚毛呈褐色甚至暗褐色，具分隔；分生孢子梗为无色至褐色，具分隔，基部有分枝；产孢细胞无色，圆柱状，内壁芽生、瓶体式产孢；分生孢子无色，单胞，直、短圆柱形或镰刀形，薄壁，有时含油球，端部钝，个别种的孢子顶端延伸成一附属丝；菌丝或芽管顶端接触固体界面时往往会产生附着胞。附着胞为褐色，边缘较整齐，厚壁，附着胞可反复多次萌发和再产生，[54-56]从而形成更为复杂的结构。1.2.2分子标记技术在炭疽病病原菌属系统分类中的应用近年来，随着分子生物学的快速发展，基因标记的方法和技术也日益成熟，因此，分子生物学技术在真菌的分类中被广泛应用，其中应用最广的就是ITS核苷酸序列在真菌和细菌的鉴定。随着对炭疽病菌研究的深入发现，在炭疽病菌广阔的分支中，其生物和基因的关系仍存在很多未知，很显然仅仅以ITS序列不足[57,58]以解决这些问题，为了能使分类结果更加可靠准确，学者们引入了其他分子[59,60]标记中特定基因序列与ITS一并加入对比，从而得到更加准确的分类结果。（1）ITS序列分析及应用由于核糖体基因内转录间隔区（internaltranscribedspacers，ITS）序列进化较快，在种间甚至种内都有一定的变异度，可用于相近种的区分，因此该区域适合在不同的分类水平进行分析。另一方面是由于ITS序列容易获得，具有广泛适用的通用引物，对模板DNA的要求也不高，使得该区域已成为各个研究者的偏爱，并成为研究真菌分类鉴定及群体遗传多样性时使用较为普遍的一种分子标记方法。[61]Sherriff等对显示属于13个种的27株刺盘孢的ITS2和LSU基因进行测序，6 第1章文献综述并第一个提交了刺盘孢临近法（N-J）系统发育树的支持率，这项研究工作表明瓜类刺盘孢C.orbiculare复合种是一个复杂的分类单元，并检测4个弯孢种之间的[62]遗传一致性。2010年，Koike等通过ITS和GS基因序列的分析鉴定，并结合形态学特征，将其采集分离到的向日葵炭疽病菌鉴定为C.acutatum。而Abang等[63]通过ITS1-5.8S-ITS2序列分析，结合形态及致病性验证，证明从山药炭疽病分[64]离到的病原菌为C.gloeosporioides。Xie等采集浙江和上海地区的草莓炭疽病标本共分离得到31株刺盘孢菌株，经ITS序列分析结合形态学特征共鉴定出C.[65]gloeosporioides10株、C.fragariae10株和C.acutatum11株。2010年，王震等对柑橘炭疽病样本中分离得到的10株代表性菌株进行了种属鉴定，通过培养性状、形态学特征及ITS序列分析，证明其均为盘长孢状刺盘孢C.gloeosporioides。[66][67][68]目前，山东核桃炭疽病、尼日利亚西南部芒果炭疽病、泰国木薯炭疽病、[69]苹果炭疽病等多种植物炭疽病均已通过ITS序列得到鉴定。（2）β-tubulin-gene序列分析及应用微管是细胞骨架的主要组成部分，同时也与纺锤体的形成有着密不可分的联[70]系。β微管蛋白作为一种结构蛋白，具有相当保守的序列，β微管蛋白的变异水平从一个侧面反映出了物种的进化水平。编码β-微管蛋白的基因为β-tubulin基因，该基因具有的保守序列己被广泛用于真菌的分类鉴定、亲缘关系以及种内各菌株之间的遗传分化研究中。[71]2009年，Damm等利用β-tubulin、ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和HIS3六个基因片段来分析草本植物上分离到的97个炭疽病菌，结果构建的系统发育树有20个进化分枝，其中12个进化枝的菌株被鉴定为C.dematium。在2014年，[72]韩国学者ChangGiBack等对苹果上分离到的150株C.gloeosporioides进行抗苯并咪唑性质测定，结果表明超过110株出现了抗药性，对其他九种杀菌剂的测定结果与苯并咪唑相似；进一步对其β-tubulin基因序列分析发现该基因出现了点突变，使得本来对药物敏感的编码谷氨酸的GAG转变为对药物高抗的编码丙氨[73]酸的GCG，从而使得炭疽病菌出现抗药性。同年，马来西亚的Mahmodi等通过β-tubulin及ITS序列分析，将从梨上分离到的病原菌鉴定为C.truncatum，并进一步通过ISSR标记分析了C.truncatum的遗传多样性。（3）Calmodulingene序列分析及应用钙调蛋白基因（calmodulingene，CAL）主要参与细胞的生理功能调节，尤其在细胞分裂周期中和细胞癌变时，钙调蛋白基因的表达加强。由钙调蛋白基因[74]表达产生的钙调蛋白能与下游钙调素结合而发生作用。随着分子生物学技术的快速发展，钙调蛋白基因已经被成功的分离克隆，由于具有一定的保守性，钙调蛋白基因序列通常被用于探讨生物体的遗传进化问题。7 西南大学硕士学位论文[75]Talhinhas等对羽扇豆的15个炭疽菌菌株的ACT、TUB2、CAL、GS、GPDH和ITS序列进行分析比对，结果表明，基于CAL与GS基因序列所得到的各菌株[76]之间的差异比其余4种基因序列所得到的差异更为明显。VitorWarwar等研究证明CAL基因调节合成的钙调蛋白在炭疽病菌侵染苜蓿过程中能够促进菌株分生孢子萌发和附着胞的发育形成，作者又通过CAL基因的反义片段表达，即在降低钙调蛋白基因的表达后发现确实减缓了病原菌分生孢子萌发和附着胞的发育。[77]2017年，李沛利等从成都市采集疑似为炭疽病的鹅掌柴病叶，通过形态学特征并结合ACT、TUB2、CAL、GS、GPDH和ITS序列分析证明其病原菌为C.siamense及C.karstii。（4）GAPDHgene序列分析及应用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）是生物体内糖酵解和糖异生过程中的关键酶，参与生物生命代谢活动的许多主要[78,79]过程。目前，已经获得多种植物GAPDH的基因和氨基酸序列，并有研究发现编码GAPDH的基因在功能区序列高度保守，与其他的编码蛋白基因相比较，[80]GAPDH基因的进化较慢，GAPDH进化树的主要区域与其他分子序列得到的进[81]化树往往一致，因此，GAPDH基因序列被广泛应用于生物的分子系统发育研究。利用GAPDH基因序列分析技术进行炭疽病菌种群分类鉴定已有很大的进[82]展。2015年，李河等通过对湖南、广西油茶叶上分离获得的5株油茶炭疽病菌进行ITS、CAL、GAPDH序列分析后发现这5株炭疽病菌均为暹罗刺盘孢（C.siamense）。随后，作者又对分离的62株炭疽属菌株的rDNA-ITS、CAL和GAPDH3个基因进行测序和系统发育分析，结果表明这些炭疽病菌属于果生炭疽菌（C.fructicola）、暹罗炭疽菌（C.siamense）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、山茶[83][84]炭疽菌（C.camelliae）和哈锐炭疽菌（C.horii）。宁平同样采用ITS、ACT、CHS-1和GAPDH基因序列分析技术首次将莪术炭疽病病原菌鉴定为C.curcumae。此外，利用该分析方法，诸多学者相继对咖啡炭疽病菌（Colletotrichum[85][86][87]coffeanum）、苹果炭疽病菌、萹蓄炭疽病菌（C.dematium、苜蓿炭疽病[88][89]菌（C.trifolii）、田七炭疽病菌等一些植物炭疽病的病原菌进行了鉴定和系统分类。（5）CHS基因序列分析及应用由几丁质合成酶（chitinsynthase，CHS）调控合成的几丁质是真菌细胞壁的主要成分之一，其对维持细胞的形态和结构起到了关键作用，CHS基因在不同植[90,91]物类群中保守性较高，因此，研究CHS基因序列有助于解决生物分子系统[92]发育中复杂的问题。2017年，杨友联等通过ITS、ACT、CHS1、GAPDH、CAL、8 第1章文献综述TUB2基因联合分析将分离到的2株虎耳草炭疽病病原菌鉴定为喀斯特炭疽菌（C.[93]karstii）和江西炭疽菌（C.jiangxiense）。Liu等在研究山龙眼炭疽病时则采用7基因（ACT、CAL、CHS-1、GAPDH、GS、ITS、TUB2）的序列分析并结合形态学特征，共分出2个新种（C.proteae和C.grevilleae）以及4个已知种。真菌群体内种外或种间遗传的研究方法有很多种，随着生物技术水平的不断提高和分子生物学研究的不断深入，大量先进的技术方法逐渐被应用到真菌群体遗传分类的研究当中，这些方法具有突出的优点但同时也存在一定程度的不足。比如某些近似种之间的ITS序列变异较小，不能提供足够的区分度和支持率，从而造成分类不够真正准确。因此，仅单纯依靠一种方法进行真菌分类研究会有一[94]定的片面性。随着Carbone等对几个不同的蛋白编码序列设计了对大多数真菌通用的引物，越来越多的研究开始关注到其它具有足够种间分辨力的基因序列。采用多个基因片段的联合序列分析能够更加准确地鉴定真菌种类和推断其系统发育关系，多基因序列联合分析也已被越来越多地应用于真菌的分类和系统发育研究。近来，采用多基因联合分析方法进行种属分类，能使刺盘孢属真菌系统分类[95,96][97]的准确率得到大幅提高。2009年，Damm等通过采用ITS、ACT、CHS1、TUB2、HIS3、和GAPDH六个基因联合分析，对形态上极难区分的草本植物上[98]分离的该属真菌区分开来，引入了个新种。Crouch等则通过ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2四基因联合分析了形态极为相近的C.gramincola复合种，共鉴[99]别出6个新种，而且还恢复2个曾被取消的合格种。Tao等在黄花白芨叶片上分离到36株内生刺盘孢菌，通过ITS-TUB2-ACT-GAPDH等4基因联合的多基因[100]系统分析并结合其形态学特征共鉴定出7个新种；Huang等在浙江、广东等7个柑橘主产区分离得到312株刺盘孢菌株，采用ACT、TUB2、CAL、GAPDH、GS和ITS等6基因序列分析和菌株形态学相结合的方法鉴定出2个新种（C.citricola与C.citri）和4个已知合格种。2015年，西北农林科技大学的王玉春等[101]以茶树上分离得到的炭疽病菌菌株的ITS、TUB2基因序列构建多基因位点系统发育树，对其进行系统分类，结果发现45个菌株与C.camelliae聚为一族、28个与C.fructicola聚为一族、5个与C.siamense聚为一族，所有菌株均归属于C.gloeosporioides复合种，同时确定了C.camelliae为中国茶树炭疽菌优势种。目前，形态特征结合多基因系统学鉴定刺盘孢属真菌已成为一种发展趋势，并且能够真正解决正确识别和系统分类上存在的问题。1.2.3枇杷炭疽病病原菌的研究进展[10]2002年，陈福如等在福建枇杷上发现了尖孢炭疽菌（C.acutatum）；日本[22][102][103]在1994年及2009年也相继报道其可致枇杷炭疽病；周丹丹、潘永梅均9 西南大学硕士学位论文指出枇杷炭疽病的病原菌为C.acutatum。其分生孢子盘表生、散生，黑色，缺刚毛和分生孢子梗，产孢细胞瓶颈型，无色；分生孢子梭形，无色单胞，10-16µm×2.6-4µm，内含2-3个油球。[29]2006年，陶金华在自然发病、疑似炭疽病的枇杷果实上分离到其病原菌，经鉴定证明为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；2009-2010年，在贵州遵义、罗甸枇杷树叶片上发现疑似炭疽病害，采用传统的形态学方法并结合病原菌[12]rDNA-ITS序列分析对其进行了鉴定，发现其病原菌为C.gloeosporioides；而[11][104]在云南蒙自、四川、巴基斯坦等地相继也有报道指出C.gloeosporioides可引起枇杷炭疽病。有性阶段为围小丛壳菌[Glomerllacingulata（Stonem.）Schr.Spauld.]，属子囊菌亚门，球壳目，自然情况下少见。分生孢子盘黑色，其上有排列整齐的分生孢子梗。分生孢子梗短小，密集，圆柱形，12-21µm×4-5µm，无色，无隔膜；分生孢子椭圆形或圆柱形，两端钝圆，单细胞，无色，11-18µm×4-6µm，有1-2个油球；附着孢扁球形，棒形或不规则形，褐色。[105][13]枇杷炭疽病有时还由这两种炭疽病菌混合侵染所致。Wu等在2017年的研究发现C.nymphaeae可引起枇杷炭疽病，其菌丝在PDA培养基上呈灰白色，背面大部分为橙色；分生孢子透明、无隔膜，圆柱形棒状，一端圆一端略尖，与C.acutatum分生孢子相似，后经ITS-rDNA，GAPDH，CHS-1，HIS3，ACT及TUB2共6个基因测序聚类分析再次证明其病原菌为C.nymphaeae。1.3真菌病害病原菌分子检测技术研究进展1.3.1Nested-PCR检测技术及其应用Nested-PCR是在常规PCR基础上进一步发展而来的一项更为快速、灵敏、精确的检测技术。其原理是利用两对特异性引物先后共同扩增一段目的区域，而第二次扩增的目的区域位于第一次扩增的目的区域内部，从而降低常规PCR经常出现的非特异性扩增的几率，使得PCR更加快速、准确，大量研究表明nested-PCR[106]具有比常规PCR更高的灵敏度。由于nested-PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少），增加了检测的敏感性；同时又有两对PCR引物与检测模板的配对而增加了检测的可靠性。又由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种nested-PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有因引物配对特异性不强而造成非特异性扩增的污染，因此nested-PCR的灵敏性、准确性及检测特异性都比常规PCR要[107]高。近些年来，nested-PCR已经广泛应用于植物病原菌的鉴定及病害诊断。201010 第1章文献综述[108]年，Spagnolo等通过nested-PCR成功区分葡萄溃疡病菌有性态Neofusicoccum[109]parvum和其紧密相关种Neofusicoccumsensu。2012年，Zang等也利用nested-PCR从苹果不同真菌病害中成功鉴定出苹果腐烂病病原菌Valsamalivar.[110]mali。张磊等利用nested-PCR和常规PCR建立梨炭疽病菌分子检测体系时发5[111]现nested-PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约10倍。何末军则设计了油茶炭疽菌的特异性引物，通过nested-PCR和常规PCR扩增对不同地理来源的135个菌株进行检测，发现nested-PCR技术的灵敏度比常规PCR至少提高了10倍。因此，nested-PCR技术在植物病害分子检测中的作用愈发重要，而其应用也越来越普遍。1.3.2其他分子检测技术及其应用目前，研究学者对分子检测技术又进行了不断探究，除了nested-PCR技术外[112]还有一些新的检测技术不断涌现。例如张贺等建立并完善Multiplenested-PCR[113]检测技术对芒果炭疽病菌进行检测分析，灵敏度达2fg/μL。孙涛等利用Taqman探针实时荧光定量PCR技术快速检测喀斯特炭疽菌（C.karstii），为进出境口岸[114]一线检疫鉴定提供新的快速灵敏技术方法。Xiao等通过RAPD标记技术快速[115]检测到了草莓炭疽病菌的潜在侵染源。随后，Lee等也运用RAPD技术分析了韩国的苹果炭疽病菌遗传多样性，将胶孢刺盘孢分为4个分支，而将尖孢刺盘孢[116]各分为两个分支。2006年，González等利用RFLP技术研究了美国和巴西的苹果炭疽病菌遗传多样性，将围小丛壳Glomerellacingulata分为7个分支，将胶[117]孢刺盘孢和尖孢刺盘孢各分为两个分支。曾大兴等应用ITS-RFLP技术对38个不同寄主来源的弯孢类炭疽菌菌株的遗传多样性和系统发育进行研究，结果发现弯孢类炭疽菌的酶切图谱在种内基本是一致的，而种间差异较大。与RAPD和RFLP等分子标记相比，具有更高的重复性且操作简单的ISSR是一种非常理想的[118]检测种内遗传变异的分子标记技术。例如西北农林科技大学的符丹丹等采用ISSR技术对所分离到的14株苹果炭疽病菌进行遗传多样性分析，结果表明炭疽病菌株明显区分为胶孢刺盘孢和尖孢刺盘孢2个种，并且可以区分种以下的亚群。[119]LAMP是Notomi等发明的一种新型、简便的核酸扩增方法，该技术的产生和[120]发展对于快速鉴定病原微生物具有重要的理论意义和应用价值。王贤达等通过建立葡萄炭疽病LAMP检测方法对来自福建等5个地区的样品进行实测，结果发现有81.5%感染葡萄炭疽病菌，检测灵敏度是常规PCR的100倍，为葡萄炭疽病的田间样品检测提供了技术支持。11 西南大学硕士学位论文1.4研究目的及意义、研究内容和技术路线1.4.1研究目的及意义随着枇杷栽培面积的增加，生产栽培上的病害发生成为限制枇杷优质高产的主要因素。枇杷从种植、采收到果实的贮存整个过程中都会受到各种病害的危害，[6]叶片、果实、苗木等都会受到侵染，真菌性病害就多达20余种。炭疽病是枇杷生产中危害较重的病害之一，全世界各枇杷种植地均有报道。该病害主要危害枇杷叶和果实，常造成苗圃大量苗木死亡，也会造成果实腐烂落果，枇杷果实贮运期间仍会继续发病，导致严重经济损失。前人研究表明枇杷炭疽病菌具有潜伏侵染现象，若在田间观察到病症再进行防治已为时过晚。因此，建立一种快速、准确的枇杷炭疽病病原菌分子检测技术十分必要。为明确枇杷炭疽病病原菌种类，进而有效地开展防治工作，本研究通过计算病情指数，采用传统分离鉴定方法并结合单基因及多基因系统发育分析对病原菌进行鉴定。针对枇杷炭疽病主要病原菌设计筛选nested-PCR特异性引物，并对其灵敏度及野外时效性进行检测，以期建立一个快速、准确的枇杷炭疽病病原菌早期诊断的体系，为后续枇杷炭疽病病害研究与防治提供技术支撑和新思路。1.4.2研究内容研究内容主要分为以下3个部分：（1）采用五点取样法在西南大学枇杷种质资源圃统计不同时期枇杷叶片炭疽病的发病率及病情指数，并记录对应时期温度及湿度，对枇杷炭疽病的田间发病规律进行调查。（2）在重庆地区枇杷春梢、夏梢、秋梢生长时期，采集枇杷炭疽病病样，采用传统的分离鉴定方法，包括菌落特征及孢子形态观察、rDNA-ITS序列分析和致病性测定并结合单基因及多基因联合系统分类学方法，对分离得到的病原菌进行鉴定。综合上述分析结果，明确重庆地区枇杷炭疽病病原菌种类。（3）基于枇杷炭疽病病原菌ITS基因序列设计nested-PCR内引物，验证引物的特异性、检测引物灵敏度，建立针对炭疽病病原菌的nested-PCR快速检测体系，并运用该体系对田间样品进行检测，验证该方法的可靠性。1.4.3技术路线12 第1章文献综述田间枇杷炭疽病发病规律调查采集疑似枇杷炭疽病病样分离纯化枇杷叶片、果实炭疽病病原菌CHSCalGAPDHITSβ-tubulin联合基基因序基因序基因序序列基因序因序列列分析列分析列分析分析列分析分析形态学鉴定分子生物学鉴定致病性测定确定病原菌分类地位基于ITS区枇杷炭疽病菌巢式PCR引物设计及验证灵敏度检测野外田间时效验证建立枇杷炭疽病菌快速分子检测体系13 西南大学硕士学位论文14 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.1主要试剂及仪器2.1.1主要试剂DNA提取液[Tris-HCl0.2mol/L（pH7.5），NaCl0.5mol/L，EDTA0.01mol/L，SDS10g/L]、无菌水、无水乙醇、70%乙醇、75%乙醇、Tris-饱和酚、氯仿、10mg/LRNA酶、甘油、氯仿:异戊醇（24:1）、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、0.5×TBE缓冲TM液（pH8.0），DS1000Marker、2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）、引物ITS1、ITS4、Bt2a、Bt2b、CL1C、CL2C、GDF1、GDR1、CHS-79F、CHS-354R均有英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。2.1.2主要仪器高温高压蒸汽灭菌锅、电热恒温培养箱（上海齐欣）、荧光显微镜（OlmpusBX34）、高通量组织研磨仪（CoyoteG200）、台式冷冻离心机（Sigma3K15）、C1000TouchPCR仪（BIO-RAD）、VeritiPCR仪（ABI）、超净工作台SA-1600-ZJZ（上海稼丰园艺用品有限公司）、恒温水浴锅（Shellab）、电泳系统（BIO-RAD）、凝胶成像系统GelDocTmXR+imagingsystem（BIO-RAD）、核酸蛋白检测仪Nanodrop2000（ThermoScientific）、-80℃超低温冰箱、1.5mL离心管、2mL离心管、一次性无菌培养皿（直径90mm）等。2.1.3主要培养基配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseager，PDA）：马铃薯浸粉3.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，加蒸馏水至1L。121℃高温高压灭菌20min后冷却至50℃左右加入100μg/mL链霉素（streptomycin）。2.2试验方法2.2.1枇杷炭疽病病害调查2016年2月-10月，于西南大学枇杷种质资源圃对“华白1号”、“金华1号”两个枇杷品种发病规律进行调查。自枇杷炭疽病发病初期开始在园间定点、定株、定期调查发病情况。在该园区中五点取样，每点随机选取3棵枇杷树挂上标签并作标记，每15天调查一次，每棵树分4个方向进行调查，每个方向随机调查10片新叶，分别记载每棵树所调查新叶总数及发病新叶数，统计其发病率（%）及病情指数。病害分级标准为0级：无病斑；1级：病斑较少，病斑比率≤25.0%；15 西南大学硕士学位论文3级：病斑中等，病斑比率25.1%-50.0%；5级：病斑较多，病斑比率≥50.1%。发病率（%）＝（发病株数／调查株数）×100∑（各级病叶数×相对级数值）病情指数（%）＝×100调查总数×最高分级级别2.2.2样品采集2015-2017年枇杷抽新稍时期（主要包括春、夏、秋稍时期）及结果期在西南大学枇杷种质资源圃、西南大学105枇杷种植基地和合川渭沱枇杷种植区采集具有典型炭疽病症状的病叶及病果，每次采样10份以上，分别装入干净的自封袋中并做好标记，置于冰盒中运送回实验室，立即进行分离。2.2.3病原菌分离纯化将采集到的典型枇杷炭疽病病样进行拍照、描述及标号。采用常规组织分离法进行病原菌的分离。将病样清洗干净后，在超净工作台上使用无菌剪刀从发病部位剪下病健交界处组织（4mm×4mm），注意取果实部位病斑时，要尽可能薄，尽可能只取果皮，用70%酒精处理10-15s，再用1%升汞处理1-2min，最后用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干水分后转入PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养；3d后进行转皿纯化培养，纯化的菌种编号后于15%无菌甘油中保存，同时选取代表性纯菌株移接置PDA平板，置于25℃培养箱培养用于形态学观察。2.2.4炭疽病病原菌的形态学观察将纯化的代表性菌株转接至PDA培养基上，待菌落长满整个平板后，根据病原菌主要分类特征，观察记录菌落形态、菌落质地、菌落正背面颜色、有无气味及菌丝生长快慢等培养性状；采用无菌水冲洗菌落表面，获得孢子悬浮液以观察孢子形态特征，随机挑选30个孢子进行测量记载，并用OlmpusBX34荧光显微镜拍照，参考《真菌鉴定手册》及《中国真菌志》判定其可能种类。2.2.5DNA提取和PCR扩增2.2.5.1DNA提取将纯化的病原真菌转接至PDA培养基上，待菌落长满整个平板后，刮取适量菌丝放入1.5mL灭菌离心管中，使用CoyoteG200高通量组织研磨仪研磨菌丝[121]至粉末，真菌DNA提取方法参照张丹华真菌DNA提取，提取的DNA于-20℃16 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定保存备用。2.2.5.2PCR扩增PCR扩增所用的引物及其序列见表2-1。表2-1PCR扩增所用引物及其序列Table2-1Primersandtheirsequencesusedinthisstudy引物引物序列（5'-3'）参考文献PrimerPrimersequence（5'-3'）Reference[122]ITS15'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'[122]ITS45'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'[123]Bt2a5'GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3'[123]Bt2b5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3'[124]GDF15′GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA3′[125]GDR15′GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT3′[59]CL1C5′GAATTCAAGGAGGCCTTCTC3′[59]CL2C5′CTTCTGCATCATGAGCTGGAC3′[94]CHS-79F5′TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG3′[94]CHS-354R5′TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG3′（1）rDNA-ITSPCR扩增反应体系（40μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）20μL，引物ITS1和ITS4各2μL，DNA模板（50ng/mL）1μL，加ddH2O至40μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。（2）β-tubulinPCR扩增反应体系（50μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）25μL，引物Bt2a和Bt2b各2μL，DNA模板（50ng/mL）1μL，加ddH2O至50μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。（3）GAPDHPCR扩增反应体系（50μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）25μL，引物GDF1和GDR1各1μL，DNA模板（50ng/mL）2μL，加ddH2O至50μL。反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；72℃延伸7min，4℃保存。（4）CALPCR扩增17 西南大学硕士学位论文反应体系（50μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）25μL，引物CL1C和CL2C各1μL，DNA模板（50ng/mL）2μL，加ddH2O至50μL。反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。（5）CHSPCR扩增反应体系（50μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）25μL，引物CHS-79F和CHS-354R各1μL，DNA模板（50ng/mL）2μL，加ddH2O至50μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸90s，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖胶电泳检测（0.5×TBE电泳缓冲液，120V电压），加样10μL，在BIO-RAD凝胶成像系统下观察是否有明亮条带并照相存档。将有单一明亮条带的PCR扩增产物送至英潍捷基（上海）有限公司进行测序。2.2.6核苷酸序列比对和系统发育树构建在获得单基因测序结果后，先对Chromas软件产生的测序波形图和测序结果进行对照，查看图谱是否存在重峰、背景杂峰或其它不准确的区域，对必要的地方进行手动修改。然后用BioEditv.7.0.5软件比较上游引物和下游引物测得序列的差异，对序列进行拼接，以确保核苷酸序列的准确度和精确度。将拼接后序列与NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）核酸数据库进行同源性比对，另从GenBank上下载各国所分离的刺盘孢对照菌株的相应序列，用ClustalX软件进行比对，手动修正后，使用MEGA5.05中的邻位加入法（neighbor-joining，N-J）构建系统发育树。2.2.7致病性测定为比较分离菌株的致病性差异，在实验室内进行回接枇杷试验。根据柯赫氏法则，采集长势一致的健康枇杷嫩叶，用70%的酒精进行表面消毒处理后，用无菌水冲洗干净。在叶脉两侧选6点并用针刺伤，每点10针均匀分布在5mm范围内。将分离纯化后的病原菌转至PDA平板培养基上，于25℃暗处培养7d后，6用无菌水冲洗出孢子，配制成浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液。用无菌注射器将孢悬液注射于叶片针刺部位，0.5mL孢悬液/针刺位点，每个处理4片叶子，3次重复，以无菌水作对照，放置于铺有湿润滤纸的白色瓷盘内，上覆保鲜膜保湿，于25℃温室中培养、观察。待叶片发病后，记录病斑特征并从发病部位的病健交界处分离病原菌，与原接种菌株进行比较。果实接种的操作方法与叶片相同。18 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3结果与分析2.3.1枇杷炭疽病田间发病规律2016年于西南大学枇杷种质资源圃对枇杷炭疽病的发病规律进行调查，结果显示（图2-1）：4月上旬为枇杷叶片炭疽病的始发期，病情指数为3.3%；4月下旬到6月上旬为爆发期，病情指数从10.6%增至31%。由试验地块的温湿度变化可知（图2-2、2-3），4月上旬到5月上旬温度维持在25℃左右，可见25℃时较适合炭疽病的快速繁殖，此时期相对湿度基本维持在60%左右，表明该地区相对湿度普遍较高，有利于病害发生；而从6月下旬持续到7月下旬为发病的高峰期，病情指数维持在41%左右，此时叶片炭疽病发病情况已非常严重；8月以后枇杷炭疽病的病情指数及发病率均缓慢下降，10月下旬病情指数已降至9.6%。调查结果表明：4月上旬为枇杷叶片炭疽病的始发期，4月下旬到6月上旬为爆发期，而6月下旬到7月下旬为发病高峰期。并且高温高湿有利于病害的发生蔓延，特别是夏稍新叶最易发病。图2-1田间发病进程Fig2-1Thepathogenesisregularityinthefield19 西南大学硕士学位论文图2-2平均气温变化Fig.2-2Changesofaveragetemperature图2-3平均湿度变化Fig.2-3Changesofaveragehumidity20 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3.2供试菌株2015-2017年，分别从病果及病叶上采集疑似炭疽病病样73份及145份，共218份；共分离得到纯菌株131株，其中病果上44株、病叶上87株。代表菌株相关信息如下（表2-2）。所有供试菌株均保藏于西南大学园艺园林学院果树学实验室。文中出现的其他刺盘孢的多基因序列均从GenBank下载（表2-3）。表2-2代表菌株及其来源Table2-2Representativestrainsanditssources序号菌株编号寄主品种分离部位采集地株数No.NumberHostSeparationpartsSiteTotal1CQXM-12华白1号嫩叶西南大学枇杷种质资源圃192CQXM-9华白1号嫩叶西南大学枇杷种质资源圃173CQXM-17金华1号嫩叶西南大学枇杷种质资源圃294CQXM-11华白1号果实西南大学枇杷种质资源圃235CQHC-5金华1号嫩叶合川渭沱枇杷种植区196CQHC-3金华1号果实合川渭沱枇杷种植区97CQXN-21华白1号果实西南大学105枇杷种植基地1521 西南大学硕士学位论文表2-3参与系统分析的刺盘孢菌株的种类及序列号Table2-3SpeciesandGenBankaccessionnumbersofColletotrichumstrainsinphylogenyanalysis种类GenBank序列号SpeciesGenBankaccessionnumbersITSGAPDHCHSTUB2CALC.karstiiJQ005187.1KC506413.1JQ005360.1JQ005615.1JQ005740.1C.acutatumKC790936.1KT709218.1KF963617.1JQ950052.1KT600771.1C.acutatumAF090853.1KF963617.1KT709218.1KM251941.1—C.acerbumJQ948459.1JQ948790.1JQ949120.1JQ950110.1—C.aenigmaJX010244.1JX010044.1JX009774.1JX010389.1JX009683.1C.aeschynomenesJX010176.1JX009930.1JX009799.1JX010392.1JX009721.1C.alienumJX010251.1JX010028.1JX009882.1JX010411.1JX009664.1C.asianumFJ972612.1JX010053.1JX009867.1JX010406.1JX009723.1C.boninenseJQ005153.1JQ005240.1JQ005327.1JQ005588.1JQ005675.1C.cuscutaeJQ948195.1JQ948525.1JQ948856.1JQ949846.1—C.falcatumJQ005772.1FJ972585.1JQ005793.1JQ005856.1—C.fioriniaeJQ948292.1JQ948622.1JQ948953.1JQ949956.1KJ954727.1C.fructicolaJX010165.1JX010033.1JX009866.1JX010405.1JX009680.1C.gloeosporioidesJX010152.1JX010056.1JX009818.1JX010445.1JQ005673.1C.gloeosporioidesJX010150.1KC293706.1KC293706.1GQ849434.1KJ954728.1C.godetiaeJQ948402.1JQ948733.1JQ949063.1JQ950053.1—C.horiiGQ329690.1GQ329681.1JX009752.1JX010450.1JX009603.1C.siamenseJX010278.1JX010019.1JX009865.1JX010410.1JX009709.1C.kahawaeJX010231.1JX010012.1JX009813.1JX010444.1JX009638.1C.karstiiJQ005181.1KC293734.1JQ005362.1JQ005620.1JQ005705.1C.lupiniJQ948155.1JQ948485.1JQ948816.1JQ949806.1—C.musaeJX010146.1JX010050.1JX009896.1HQ596280.1JX009689.1C.orchidophilumJQ948151.1JQ948481.1JQ948812.1JQ949802.1—C.queenslandicumJX010276.1JX009934.1JX009899.1JX010414.1JX009691.1C.salsolaeJX010242.1JX009916.1JX009863.1JX010403.1JX009696.1C.siamenseJX010171.1JX009924.1JX009865.1JX010404.1—C.simmondsii—JQ948606.1JQ948937.1JQ949927.1—C.tropicaleJX010264.1JX010007.1JX009870.1JX010407.1JX009719.122 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3.3枇杷炭疽病病原菌形态学鉴定将所获得的131株纯菌株按照其在PDA培养基上的菌落形态进行归纳分类，将其大致分为7类，其各自形态特征见表2-4。分离获得第1类菌株共23株，其在PDA培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，气生菌丝疏松，初期为白色，后逐渐变为浅灰色至黑灰色，后期出现橘红色轮纹（分生孢子）；菌落反面中心橄榄灰色或浅灰色，具褐色、黑色、橘色相间同心轮纹（图2-4A，B），代表菌株为CQXM-11。分离获得第2类菌株共19株，其在PDA平板菌落上边缘完整，圆形，规则；气生菌丝厚重浓密，中间淡灰色，边缘白色，棉絮状，分生孢子盘藏于菌丝深处；菌落反面灰黑色（图2-4D，E），代表菌株为CQHC-5。而CQXM-11与CQHC-5分生孢子形态相似，大小相同，分生孢子均无色，单胞，棍棒形、圆柱形或椭圆形，两端钝圆或一端略尖，内含多个油滴（图2-4C，F）。而分生孢子形态在一定程度上可以反映炭疽病菌的种类，故而初步将CQXM-11与CQHC-5归为同一种，但其菌落及孢子形态特征与文献描述的C.gloeosporioides、C.fructicola、C.alienum等较相似，故不能仅通过形态学鉴定来判断其刺盘孢的种类，还需进一步分析判定。分离获得第3类菌株共19株，其菌落圆形，不规则；灰白色，气生菌丝稀疏，无数黑色的分生孢子散布其中；背面无色或淡橙色，分布无数黑色斑点（孢子）（图2-5A，B），代表菌株为CQXM-12。分离获得第4类菌株共9株，其菌落近圆形，规则；菌丝白色，絮状，紧贴培养基生长，具同心轮纹；背面白色或淡黄色（图2-5D，E），代表菌株为CQHC-3。CQXM-12与CQHC-3分生孢子形态相似，均单胞，透明，光滑，无隔膜，圆筒状，一端钝圆另一端有一个突出的颗粒，内含油滴（图2-5C，F）。依据其孢子形态初步将CQXM-12与CQHC-3定为同一种，根据菌落及孢子特征初步判定为C.karstii或C.boninense。分离获得第5类菌株共15株，其在PDA培养基上边缘不规则；菌落中心灰色，边缘白色，绒毛状；背面中心黑色，四周淡黄色（图2-6A，B），代表菌株为CQXN-21。分离获得第6类菌株共17株，其菌落呈近圆形，边缘整齐；菌丝初期为白色，逐渐变为橘红色，菌落中央涌出橘红色奶油状分生孢子团，产孢量较大，毡状，具明显同心轮纹；背面橘红色（图2-6D，E），代表菌株为CQXM-9。分离获得第七类菌株共29株，其菌落灰白色，毡状，边缘整齐，具明显同心轮纹；背面淡褐色，边缘灰色，具轮纹（图2-6G，H），代表菌株为CQXM-17。CQXN-21、CQXM-9及CQXM-17分生孢子相似，均单胞，无色，透明，光滑，无隔膜，纺锤形或梭形，两端较尖，内含多个油滴（图2-6C、F、I）。将其初步判定为C.acutatum、C.fioriniae或者C.cuscutae。23 西南大学硕士学位论文表2-4七种枇杷炭疽病代表菌株形态特征Table2-4ThesynopsisofmorphologicalcharactersofColletotrichumspeciesfromloquatinthisstudy分生孢子Conidiospore菌株编号菌落形态长（μm）宽（μm）StrainnumberColonymorphologyLength(μm)Width(μm)圆形，规则；气生菌丝疏松，浅灰色至黑灰色，具橘色同心CQXM-1110.2-20.54.0-7.7轮纹；背面浅灰色，具褐色、黑色、橘色相间同心轮纹菌落圆形，不规则；灰白色，气生菌丝稀疏，无数黑色的分CQXM-127.6-13.85.4-6.3生孢子散布其中；背面无色或淡橙色，分布无数黑色斑点边缘完整，圆形；气生菌丝厚重浓密，中间淡灰色，边缘白CQHC-59.7-19.54.6-7.5色，棉絮状；分生孢子盘藏于菌丝深处；菌落反面灰黑色菌落近圆形，规则；菌丝白色，絮状，紧贴培养基生长，具CQHC-310.2-14.45.2-6.0同心轮纹；背面白色或淡黄色边缘不规则；菌落中心灰色，边缘白色，绒毛状；背面中心CQXN-218.9-16.52.5-4.3黑色，四周淡黄色菌落呈近圆形，边缘整齐；菌丝初期为白色，逐渐变为橘红CQXM-910.9-14.53.6-4.2色，毡状，具明显同心轮纹；背面橘红色菌落灰白色，毡状，边缘整齐，具明显同心轮纹；背面淡褐CQXM-177.5-19.32.4-4.6色，边缘灰色，具轮纹24 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定图2-4分离菌株CQXM-11和CQHC-5在PDA上的培养性状及分生孢子形态Fig.2-4ColonymorphologyandConidiaofisolateCQXM-11andCQHC-5A：CQXM-11菌落特征（PDA，正面）；B：CQXM-11菌落特征（PDA，反面）；C：CQXM-11分生孢子；D：CQHC-5菌落特征（PDA，正面）；E：CQHC-5菌落特征（PDA，反面）；F：CQHC-5反面分生孢子；标尺=10μm。A:MorphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-11ontheobversesideofPDA,B:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-11onthereversesideofPDA,C:theconidiaofCQXM-11,D:morphologicalcharacteristicsofisolateCQHC-5ontheobversesideofPDA,E:morphologicalcharacteristicsofisolateCQHC-5onthereversesideofPDA,F:theconidiaofCQHC-5,thescaleis10μm.25 西南大学硕士学位论文图2-5分离菌株CQXM-12和CQHC-3在PDA上的培养性状及分生孢子形态Fig.2-5ColonymorphologyandConidiaofisolateCQXM-12andCQHC-3A：CQXM-12菌落特征（PDA，正面）；B：CQXM-12菌落特征（PDA，反面）；C：CQXM-12分生孢子；D：CQHC-3菌落特征（PDA，正面）；E：CQHC-3菌落特征（PDA，反面）；F：CQHC-3分生孢子；标尺=10μm。A:MorphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-12ontheobversesideofPDA,B:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-12onthereversesideofPDA,C：theconidiaofCQXM-12,D:morphologicalcharacteristicsofisolateCQHC-3ontheobversesideofPDA,E:morphologicalcharacteristicsofisolateCQHC-3onthereversesideofPDA,F:theconidiaofCQHC-3,thescaleis10μm.26 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定图2-6分离菌株CQXN-21、CQXM-9和CQXM-17在PDA上的培养性状及分生孢子形态Fig.2-6ColonymorphologyandConidiaofisolateCQXN-21,CQXM-9andCQXM-17A：CQXN-21菌落特征（PDA，正面）；B：CQXN-21菌落特征（PDA，反面）；C：CQXN-21分生孢子；D：CQXM-9菌落特征（PDA，正面）；E：CQXM-9菌落特征（PDA，反面）；F：CQXM-9分生孢子;G:CQXM-17菌落特征（PDA，正面）；H：CQXM-17菌落特征（PDA，反面）；I：CQXM-17分生孢子；标尺=10μm。A:MorphologicalcharacteristicsofisolateCQXN-21ontheobversesideofPDA,B:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXN-21onthereversesideofPDA,C：theconidiaofCQXN-21,D:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-9ontheobversesideofPDA,E:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-9onthereversesideofPDA,F:theconidiaofCQXM-9,G:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-17ontheobversesideofPDA,H:morphologicalcharacteristicsofisolateCQXM-17onthereversesideofPDA,I:theconidiaofCQXM-17;thescaleis10μm.27 西南大学硕士学位论文2.3.4枇杷炭疽病病原菌PCR扩增枇杷炭疽病病原菌供试菌株经ITS基因的上游引物ITS1和下游引物ITS4PCR扩增后，可得到大约500bp左右的条带，条带位点如图2-7所示，所得条带清晰明亮且无杂带，可用于后续的测序等工作。而在CAL基因的上游引物CL1C和下游引物CL2C的PCR扩增后，供试的枇杷刺盘孢菌株可得到700bp左右的条带，所得条带明亮且数目唯一，如图2-8所示，可继续进行后续的测序工作。同样，GAPDH基因的引物GDF1/GDR1、CHS基因的引物CHS-79F/CHS-354R及TUB2基因的引物Bt2a/Bt2b均可对枇杷刺盘孢菌株扩增出大约300bp或500bp的电泳条带，均可得到无非特异性杂带干扰的清晰条带，说明扩增程序适合，引物的特异性较好（见图2-9、2-10、2-11）。图2-7枇杷炭疽病病原菌ITS基因的PCR扩增Fig.2-7ITSPCRamplificationofColletotrichumisolatesfromloquatTMTM注：M为DNAMarkerDS2000。Notes:laneMwasDNAMarkerDS2000.图2-8枇杷炭疽病病原菌CAL基因的PCR扩增Fig.2-8CALPCRamplificationofColletotrichumisolatesfromloquatTMTM注：M为DNAMarkerDS1000，下同。Notes:laneMwasDNAMarkerDS1000,andthesamebelow.28 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定图2-9枇杷炭疽病病原菌GAPDH基因的PCR扩增Fig.2-9GAPDHPCRamplificationofColletotrichumisolatesfromloquat图2-10枇杷炭疽病病原菌CHS基因的PCR扩增Fig.2-10CHSPCRamplificationofColletotrichumisolatesfromloquat图2-11枇杷炭疽病病原菌β-tubulin基因的PCR扩增Fig.2-11β-tubulinPCRamplificationofColletotrichumisolatesfromloquatTMTM注：M为DNAMarkerDS2000。Notes:laneMwasDNAMarkerDS2000.29 西南大学硕士学位论文2.3.5枇杷炭疽病病原菌分子系统学分析2.3.5.1基于ITS序列构建的系统进化树以真菌rDNA-ITS区通用引物ITS1和ITS4扩增7种代表菌株基因组DNA，获得518bp左右的序列。用ClustalX软件将这7个代表菌株的rDNA-ITS序列进行比较，并与GenBank上已有刺盘孢属其他种进行比对（见表2-3），手动修正后，用最邻近法（neighbor-joining）构建系统发育树，在同一个ITS碱基序列数据集上，以distance为最优评判准则，通过邻近法搜索经过1000次重复计算获得的大于或等于50%自展支持率标注于相应节点处。所构建的系统发育树如图2-12所示，聚类结果显示，第一个分枝Clade1中CQXM-11和CQHC-5两个菌株与两株C.gloeosporioides聚在一起，且自展系数为63%，故将CQXM-11和CQHC-5鉴定为C.gloeosporioides。Clade2中CQXM-12和CQHC-3聚在一个小枝上，又与两株C.karstii聚在一起，虽然自展率达到94%，但因为CQXM-12和CQHC-3没有直接与两株C.karstii聚在同一小枝上，故只能初步认为其与C.karstii亲缘关系最近，遗传距离最小，但具体是否是C.karstii还有待其他基因佐证。Clade3中CQXN-21、CQXM-9及CQXM-17与一株C.acutatum（登录号：KC790936）聚在一起，后又与另一株C.acutatum聚在一起形成一个单独的小枝，但其自展率只有27%，说明其可信度较低，初步可确定为C.acutatum，但仍需其他基因佐证，所以仅通过ITS无法确定CQXN-21、CQXM-9及CQXM-17的归属。由以上可知，刺盘孢具有丰富的种群多样性，而ITS作为真菌分离的条码基因，虽然对某些亲缘关系较近的种无法区分，还需结合其他基因进行更进一步的研究，但整体来说对于刺盘孢属的分类仍具有较好的区分效果。30 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定CQXM-1163JX010150.1ColletotrichumgloeosporioidesClade1CQHC-5C.gloeosporioides68JX010152.1ColletotrichumgloeosporioidesJX010165.1Colletotrichumfructicola42JX010176.1Colletotrichumaeschynomenes5531JX010171.1ColletotrichumsiamenseFJ972612.1Colletotrichumasianum25GQ329690.1ColletotrichumhoriiJX010251.1Colletotrichumalienum13JX010244.1Colletotrichumaenigma4448JX010242.1ColletotrichumsalsolaeJX010276.1Colletotrichumqueenslandicum9JX010264.1Colletotrichumtropicale100JX010231.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawaeJX010278.1Colletotrichumsiamense100JX010146.1ColletotrichummusaeJQ005153.1ColletotrichumboninenseJQ005187.1Colletotrichumkarstii9494JQ005181.1ColletotrichumkarstiiClade2CQXM-123635CQHC-3JQ005772.1ColletotrichumfalcatumJQ948151.1Colletotrichumorchidophilum54JQ948402.1Colletotrichumgodetiae98JQ948472.1Colletotrichumsalicis95JQ948459.1Colletotrichumacerbum91AB443950.1Colletotrichumacutatum52JQ948292.1Colletotrichumfioriniae99JQ948195.1Colletotrichumcuscutae81JQ948155.1Colletotrichumlupini49AF090853.1ColletotrichumacutatumCQXN-21Clade327KC790936.1Colletotrichumacutatum39CQXM-9CQXM-170.005图2-12枇杷炭疽病病原菌ITS的邻近法系统发育树Fig.2-12PhylogramofColletotrichumisolatesofanthracnoseofloquatresultingfromneighbor-joining(N-J)analysisbasedonITSdatasets31 西南大学硕士学位论文2.3.5.2基于β-tubulin序列构建的系统进化树将7株代表菌株的TUB2基因序列与从GeneBank上下载的28株刺盘孢对照菌株的TUB2基因序列进行比对（见表2-3），构建最邻近法系统发育树。测序所得的7个代表菌株的TUB2基因的序列长度均在500bp左右。由TUB2基因构建的N-J系统发育树如图2-13所示，节点处为最邻近法（N-J）的自举支持率。TUB2的N-J树形图与ITS相似，第一个分枝Clade1中CQHC-5菌株与两株C.gloeosporioides聚在一起，自展率达到70%，故将CQHC-5鉴定为C.gloeosporioides。Clade2中CQHC-3与一株C.karstii（登录号：JQ005615）聚在一起，自展率为76%，故将CQHC-3鉴定为C.karstii。而CQXM-11、CQXM-12与ITS中出现相同情况，没有与C.gloeosporioides、C.karstii聚在同一个小枝上，故CQXM-11、CQXM-12还有待确定。而Clade3中CQXN-21、CQXM-9及CQXM-17单独聚在一枝，没有与任何刺盘孢模式种聚在一起，故而仅通过TUB2并不能确定其归属。从TUB2基因的系统发育分析可知，该基因的分辨力略弱，只能确定2株代表菌归属，但对于刺盘孢属的系统分类学还是有一定的应用价值，这些年TUB2基因已经广泛应用在包括刺盘孢属等很多真菌的系统分类学研究领域。32 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定86JX010392.1ColletotrichumaeschynomenesJX010407.1Colletotrichumtropicale5JX010405.1ColletotrichumfructicolaJX010389.1ColletotrichumaenigmaJX010410.1Colletotrichumsiamense5672JX010404.1ColletotrichumsiamenseJX010411.1Colletotrichumalienum64JX010406.1ColletotrichumasianumJX010403.1ColletotrichumsalsolaeJX010414.1Colletotrichumqueenslandicum85HQ596280.1ColletotrichummusaeCQXM-11Clade1C.gloeosporioides100GQ849434.1Colletotrichumgloeosporioides98JX010445.1Colletotrichumgloeosporioides70CQHC-598JX010450.1Colletotrichumhorii57JX010444.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawaeJQ005588.1ColletotrichumboninenseCQXM-12100Clade2JQ005620.1Colletotrichumkarstii83JQ005615.1Colletotrichumkarstii9676CQHC-3JQ005856.1ColletotrichumfalcatumJQ949802.1ColletotrichumorchidophilumJQ949927.1Colletotrichumsimmondsii10051CQXM-9Clade387CQXN-2198CQXM-1750JQ950110.1Colletotrichumacerbum57JQ950053.1ColletotrichumgodetiaeKM251941.1Colletotrichumacutatum99JQ950052.1Colletotrichumacutatum2287JQ949846.1ColletotrichumcuscutaeJQ949806.1Colletotrichumlupini35JQ949956.1Colletotrichumfioriniae0.02图2-13枇杷炭疽病病原菌β-tubulin的邻近法系统发育树Fig.2-13PhylogramofColletotrichumisolatesofanthracnoseofloquatresultingfromneighbor-joining(N-J)analysisbasedonβ-tubulindatasets33 西南大学硕士学位论文2.3.5.3基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH构建的系统进化树GAPDH基因的N-J系统发育树如图2-14所示，节点处分别为最邻近法（N-J）的自举支持率。第一个分枝Clade1中CQXM-11和CQHC-5与一株C.gloeosporioides聚在一起，自展率为69%，又与另一株C.gloeosporioides聚为独立的一枝，自展率达到99%，故将CQXM-11和CQHC-5鉴定为C.gloeosporioides。第二个分枝Clade2中CQXM-12与CQHC-3与两株C.karstii聚在一起，自展率达到了94%，故通过GAPDH构建的N-J树证明CQXM-12和CQHC-3为C.karstii。Clade3中CQXN-21、CQXM-9及CQXM-17与两株C.acutatum聚为一个大枝，但自展率较低，还有待验证。GAPDH基因确定归属的代表株有4个，区分效果目前比ITS和TUB2基因的区分效果都要好，因此GAPDH基因也可作为真菌鉴别的选择基因而广泛应用于真菌的系统分类学，但其对某些亲缘关系较近的炭疽菌种，结合其他基因的系统发育分析进行更进一步的验证才能更精确。34 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定JX010044.1Colletotrichumaenigma14JX010028.1Colletotrichumalienum23JX010033.1ColletotrichumfructicolaJX010050.1Colletotrichummusae23JX009930.1ColletotrichumaeschynomenesJX010019.1Colletotrichumsiamense4048JX009924.1ColletotrichumsiamenseJX010007.1ColletotrichumtropicaleJX010053.1Colletotrichumasianum5929JX009934.1ColletotrichumqueenslandicumJX009916.1ColletotrichumsalsolaeKC293706.1Colletotrichumgloeosporioides71CQHC-5Clade199CQXM-11C.gloeosporioides9369JX010056.1ColletotrichumgloeosporioidesGQ329681.1Colletotrichumhorii59JX010012.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawaeJQ005240.1ColletotrichumboninenseCQXM-12100CQHC-3Clade294KC506413.1ColletotrichumkarstiiC.karstiiKC293734.1ColletotrichumkarstiiFJ972585.1ColletotrichumfalcatumJQ948481.1Colletotrichumorchidophilum81JQ948790.1Colletotrichumacerbum100JQ948733.1ColletotrichumgodetiaeJQ948485.1Colletotrichumlupini51JQ948622.1Colletotrichumfioriniae45JQ948606.1Colletotrichumsimmondsii28JQ948525.1ColletotrichumcuscutaeJQ948551.1Colletotrichumnymphaeae14KF963617.1Colletotrichumacutatum41KT709218.1ColletotrichumacutatumClade331CQXM-17CQXM-95962CQXN-210.2图2-14枇杷炭疽病病原菌GADPH的邻近法系统发育树Fig.2-14PhylogramofColletotrichumisolatesofanthracnoseofloquatresultingfromneighbor-joining(N-J)analysisbasedonGADPHdatasets35 西南大学硕士学位论文2.3.5.4基于钙调蛋白基因CAL构建的系统进化树测序所得的7个代表菌株的CAL基因的碱基序列长度均在300bp左右。CAL基因的N-J系统发育树如图2-15所示，第一个分枝Clade1中CQXM-11与CQHC-5与两株C.gloeosporioides聚在一起，自展率达到98%，故将CQXM-11与CQHC-5鉴定为C.gloeosporioides。Clade2中CQXM-12及CQHC-3与两株C.karstii具在一起，且自展系数为97%，故将其鉴定为C.karstii。Clade3中CQXM-9、CQXM-17及CQXN-21与C.acutatum聚在一起，自展系数达到99%，故将其鉴定为C.acutatum。CAL基因的系统发育分析表明，该基因区分效果比ITS、TUB2、GAPDH基因都要好，因此CAL基因对于刺盘孢属的系统分类学有着较好的应用价值。57JX009680.1Colletotrichumfructicola39JX009664.1Colletotrichumalienum64JX009683.1ColletotrichumaenigmaJX009689.1ColletotrichummusaeJX009709.1Colletotrichumsiamense39JX009721.1Colletotrichumaeschynomenes8764JX009719.1Colletotrichumtropicale69JX009691.1Colletotrichumqueenslandicum74JX009696.1Colletotrichumsalsolae77JX009723.1ColletotrichumasianumCQXM-11Clade1JQ005673.1Colletotrichumgloeosporioides10098C.gloeosporioidesCQHC-562KJ954728.1ColletotrichumgloeosporioidesJX009638.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawae72JX009603.1ColletotrichumhoriiJQ005675.1ColletotrichumboninenseCQXM-12100Clade2JQ005705.1ColletotrichumkarstiiC.karstii97CQHC-3JQ005740.1ColletotrichumkarstiiKJ954727.1ColletotrichumfioriniaeKT600771.1Colletotrichumacutatum100CQXM-9Clade399CQXN-21C.acutatum28CQXM-170.05图2-15枇杷炭疽病病原菌CAL的邻近法系统发育树Fig.2-15PhylogramofColletotrichumisolatesofanthracnoseofloquatresultingfromneighbor-joining(N-J)analysisbasedonCALdatasets36 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3.5.5基于几丁质合成酶基因CHS序列构建的系统进化树测序所得的7个代表菌株的CHS基因的碱基序列长度均在300bp左右。CHS基因的N-J系统发育树如图2-16所示，Clade1中CQXM-11及CQHC-5与一株C.gloeosporioides聚在一起，但在Clade4中另一株C.gloeosporioides与两株C.acucatum独立成为一大枝，故不能确定CQXM-11及CQHC-5归属。Clade2中CQXM-12及CQHC-3与两株C.karstii聚在一起，鉴定为C.karstii。Clade3中CQXM-9、CQXM-17及CQXN-21单独聚为一枝，确定不了归属。CHS基因系统发育分析表明，其只能确定CQXM-12及CQHC-3的归属，其区分效果比其他基因都差。但该基因的优点是对于某些相近种有较好的区分能力，因此CHS基因对于刺盘孢属的系统分类学有着较好的应用价值，但它对刺盘孢其他亲缘关系较近的种区分效果仍不佳，还需结合其他基因的系统发育学分析进行更进一步的验证。37 西南大学硕士学位论文Clade165CQXM-1156CQHC-525JX009818.1Colletotrichumgloeosporioides46JX009866.1ColletotrichumfructicolaJX009870.1Colletotrichumtropicale3JX009896.1ColletotrichummusaeJX009899.1Colletotrichumqueenslandicum3022JX009799.1ColletotrichumaeschynomenesJX009882.1ColletotrichumalienumJX009774.1Colletotrichumaenigma50JX009865.1Colletotrichumsiamense305268JX009867.1ColletotrichumasianumJX009863.1Colletotrichumsalsolae84JX009813.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawaeJX009752.1Colletotrichumhorii37JQ948812.1Colletotrichumorchidophilum99JQ949063.1Colletotrichumgodetiae49JQ949120.1ColletotrichumacerbumJQ948953.1Colletotrichumfioriniae36JQ948937.1Colletotrichumsimmondsii6765JQ948816.1Colletotrichumlupini25JQ948856.1ColletotrichumcuscutaeCQXM-17Clade348CQXM-991CQXN-21100JQ005327.1ColletotrichumboninenseCQXM-12Clade273CQHC-3C.karstii95JQ005360.1ColletotrichumkarstiiJQ005362.1ColletotrichumkarstiiJQ005793.1ColletotrichumfalcatumKF963617.1ColletotrichumacutatumClade4KT709218.1Colletotrichumacutatum41KC293706.1Colletotrichumgloeosporioides0.2图2-16枇杷炭疽病病原菌CHS的邻近法系统发育树Fig.2-16PhylogramofColletotrichumisolatesofanthracnoseofloquatresultingfromneighbor-joining(N-J)analysisbasedonCHSdatasets38 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3.5.6基于基因组合序列构建的系统进化树在同一个合并基因数据集上，采用最邻近法构建多基因（ITS-TUB2-GAPDH-CHS-CAL）的N-J系统发育树。测序所得的7个代表菌株的ITS、TUB2、GAPDH、CHS、CAL基因的碱基序列长度均在1745bp左右。多基因的N-J系统发育树如图2-17所示，多基因联合建树可以将7株代表菌株明确的分在3个分枝中，Clade1中CQXM-11与CQHC-5与两株C.gloeosporioides聚在一起，且自展率达到100%，故将CQXM-11与CQHC-5鉴定为C.gloeosporioides。Clade2中CQXM-12及CQHC-3与两株C.karstii具在一起，且自展系数为100%，故将其鉴定为C.karstii。Clade3中CQXM-9、CQXM-17及CQXN-21与C.acutatum聚在一起，自展系数达到99%，故将其鉴定为C.acutatum。综上所述可知，采用多基因联合建树进行分子系统发育分析，通过最邻近法（N-J）对7株代表菌株鉴定发现，7株刺盘孢菌株可明确分为3个分类单元，且自展系数较高，可信度较高，证明多基因系统分析对于缺乏有效的形态学特征造成分类困难的刺盘孢属的分类问题有较为准确的效果，由此可知，通过多基因首尾相连建树系统分析可发挥每个基因分类的长处。39 西南大学硕士学位论文53JX009683.1Colletotrichumaenigma45JX009664.1Colletotrichumalienum57JX009689.1Colletotrichummusae55JX009680.1ColletotrichumfructicolaJX009709.1Colletotrichumsiamense70JX009721.1Colletotrichumaeschynomenes6362JX009719.1Colletotrichumtropicale96JX009723.1ColletotrichumasianumJX009691.1Colletotrichumqueenslandicum10059JX009696.1ColletotrichumsalsolaeJQ005673.1Colletotrichumgloeosporioides55CQXM-11100Clade1CQHC-538C.gloeosporioides10039KJ954728.1ColletotrichumgloeosporioidesJX009603.1ColletotrichumhoriiJX009638.1Colletotrichumkahawaesubsp.kahawaeJQ005675.1ColletotrichumboninenseCQXM-12100JQ005705.1ColletotrichumkarstiiClade2100C.karstiiCQHC-39781JQ005740.1ColletotrichumkarstiiKJ954727.1ColletotrichumfioriniaeKT600771.1Colletotrichumacutatum100CQXM-17Clade39967CQXM-9C.acutatum60CQXN-210.02图2-17枇杷炭疽病病原菌多基因的邻近法系统发育树Fig.2-17Neighbor-joining(N-J)phylogenetictreeofColletotrichumisolatesassociatedwithanthracnoseofloquatbasedonmuti-genesequence40 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.3.6枇杷炭疽病病原菌致病性测定采用分生孢子悬浮液接种法对‘金华1号’、‘华白1号’两个枇杷品种进行致病性测定，结果显示（图2-18、图2-19），131个刺盘孢属菌株对叶片和果实有伤接种均可致病，并产生典型的枇杷炭疽病病症，初期病斑呈水渍状，中期颜色为黄褐色，然后颜色会慢慢加深为黑褐色，腐烂处略向内凹陷，有的菌株还会在果面产生白色菌丝体，回接症状与田间自然发病症状较为相似，说明所有刺盘孢属菌株均有致病性，但它们的致病力存在差异（表2-5）。在叶片上C.gloeosporioides（代表菌株CQXM-11和CQHC-5）致病力最强，C.acutatum（代表菌株CQXN-21，CQXM-9和CQXM-17）次之，C.karstii（代表菌株CQXM-12和CQHC-3）最弱。在果实上C.acutatum致病力最强，C.gloeosporioides次之，C.karstii最弱。其对叶片和果实的无伤接种致病力同有伤接种结果相似，在叶片上，C.gloeosporioides最强，C.acutatum次之，C.karstii无病斑。在果实上，C.acutatum最强，C.gloeosporioides次之，C.karstii无病斑。图2-18枇杷炭疽病病原菌叶片接种症状Fig.2-18Thesymptomofleafinoculatedwithpathogenscausedanthracnoseofloquat注：A:CQXM-11,B:CQHC-5,C:CQXM-12,D:CQHC-3,E:CQXN-21,F:CQXM-9,G:CQXM-17;1：针刺接种,2：无伤接种。Note:A:CQXM-11,B:CQHC-5,C:CQXM-12,D:CQHC-3,E:CQXN-21,F:CQXM-9,G:CQXM-17,1:thepinprickmethodofinoculation,2:theunwoundedinoculation.41 西南大学硕士学位论文图2-19枇杷炭疽病病原菌果实接种症状Fig.2-19Thesymptomoffruitinoculatedwithpathogenscausedanthracnoseofloquat注：A:CQXM-11,B:CQHC-5,C:CQXM-12,D:CQHC-3,E:CQXN-21,F:CQXM-9,G:CQXM-17；1：针刺接种,2：无伤接种。Note:A:CQXM-11,B:CQHC-5,C:CQXM-12,D:CQHC-3,E:CQXN-21,F:CQXM-9,G:CQXM-17,1:thepinprickmethodofinoculation,2:theunwoundedinoculation.表2-5致病力测试结果Table2-5ResultsofinoculationtestswithColletotrichumisolates叶片Leaf果实Fruit菌株编号接种方式Inoculationmode接种方式InoculationmodeNumber无伤接种针刺接种无伤接种针刺接种NWWNWWCQXM-11++++++++CQHC-5+++++++++CQXM-12—+—+CQHC-3—+—+CQXN-21+++++++++CQXM-9++++++++CQXM-17+++++++注：—：无病斑；+：致病力弱；++：致病力中等；+++：致病力强；NW：无伤接种；W：针刺接种。Note:—:nospots,+:weakpathogenicity,++:mediumpathogenicity,+++:strongpathogenicity,NW:non-woundedinoculation,W:thepinprickmethodofinoculation.42 第2章重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定2.4结论与讨论本研究自2016年2月-10月在西南大学枇杷种质资源圃对疑似炭疽病的枇杷病株进行发病规律调查，并于2015-2017年从重庆市西南大学枇杷种质资源圃、西南大学105枇杷种植基地及合川渭沱枇杷种植区采集具有枇杷炭疽病病症的病叶及病果为实验材料，采用组织分离法分离其病原菌，然后通过形态学和单基因及多基因系统分类学相结合的方法对其进行鉴定，确定其分类地位。1、2016年2月-10月，在西南大学枇杷种质资源圃对枇杷炭疽病发病规律的观察结果表明：4月上旬为枇杷新叶炭疽病的始发期；4月下旬到6月上旬为枇杷新叶炭疽病的爆发期；而6月下旬到7月下旬为枇杷炭疽病发病的高峰期。此外，高温高湿气候有利于病害蔓延，特别是夏稍新叶易发病。2、2015-2017年从西南大学枇杷种质资源圃、合川渭沱枇杷种植区、西南大学105枇杷种植基地共采集疑似炭疽病病样标本218份，共分离纯化得到406株菌株。根据各菌株的菌落形态、基于真菌rDNA-ITS的系统发育分析进行分类鉴定，结果表明，共131个菌株隶属于刺盘孢属（Colletotrichum）。为了进一步在种水平上明确其分类地位，对131个刺盘孢属菌株进行基于内转录间隔区序列（ITS）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、几丁质酶（CHS-1）、β-微管蛋白2（TUB2）、钙调蛋白（CAL）单基因及多基因联合的系统发育分析，并综合形态学鉴定结果，将重庆地区所分离的刺盘孢属菌株共划分为3个种，分别为C.gloeosporioides（42株）、C.acutatum（61株）及C.karstii（28株）。3、采用分生孢子悬浮液接种法对“金华1号”、“华白1号”进行致病性测定。结果显示，131个刺盘孢属菌株对叶片和果实有伤接种均可致病，并产生典型的枇杷炭疽病病症，回接症状与田间自然发病症状较为相似，说明所有刺盘孢属菌株均有致病性，但它们的致病力存在差异。在叶片上C.gloeosporioides致病力最强，C.acutatum次之，C.karstii最弱。而在果实上，C.acutatum致病力最强，C.gloeosporioides次之，C.karstii最弱。供试菌株对叶片和果实的无伤接种致病力同有伤接种结果一致。刺盘孢属的分类问题一直以来都存在较大争议，在分子系统学分析应用于真菌分类研究之前，人们一直通过形态学鉴定和寄主范围等特征对刺盘孢属进行分类，但因为该属的形态特征界限不明显，造成该属的区分困难较大，特别是Arx（1957）所鉴定的个别种范围过大，过去所报道的枇杷炭疽病的病原菌为C.gloeosporioides或者C.acutatum，也有报道指出其为两者的复合种。目前为止，还没有报道指出C.karstii也为枇杷炭疽病的病原菌，可见过去人们对于枇杷炭疽病这种重要病害的病原菌认识还不够深入。43 西南大学硕士学位论文在分子系统学开始应用于植物病原真菌分类问题之后，刺盘孢的分类问题进入一个新的发展阶段，早期多是应用ITS单基因进行分类，但从前文我们也可以看出，采用单基因方法往往很难准确界定。而TUB2、CHS等基因单独使用时也出现很难精准界定的情况，由此可以看出，单基因的区分能力有限，而多基因结合形态学等其他手段共同鉴别往往能得出更准确的结论。因此多基因系统分类方法已渐渐成为刺盘孢属及其他真菌分类鉴定的趋势，目前应用在刺盘孢属分类上的基因主要有：肌动蛋白（ACT）、钙调素（CAL）、几丁质酶（CHS-1）、延长因子（EF）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、谷氨酸合成酶（GS）、内转录间隔区（ITS）、超氧化物歧化酶（SOD）、β-微管蛋白1（TUB1）、β-微管蛋白2（TUB2）[71,98,126]等基因还有Apn2、Mat1/Apn1或ApMat基因系列。因此通过多基因系统发育分析和形态学相结合的方法，越来越多的新种得到鉴定。44 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立3.1引言目前已有报道指出枇杷炭疽病的病原菌并非单一，该病是降低枇杷产量的主要病害之一，但目前还没有对该病主要病原菌快速检测的有效方法。因为炭疽病菌具有丰富的表型范围，故基于形态学的识别很难区分炭疽病菌，需要很大的工作量，而且耗财费时，需要辅助以专业知识和特定技术，鉴定结果的可靠性也不能保证。虽然寄主与病原之间的相互作用也可用于种属间的特异性识别，但是，炭疽病菌可侵染不同的寄主，故可知这种方法也不适应用于炭疽病菌的分类研究。随着分子生物学的不断发展，PCR技术可以在病原菌没有被分离出来的情况下快[127]速灵敏地检测出植物材料中的病原菌而被广泛应用。而核糖体内转录间隔区已经广泛应用于林木类树种、果树及一年生作物的病原鉴定中，利用ITS区段设计[128,特异性引物己经用于多种病原的快速鉴定，其中就包括炭疽病菌的快速鉴定129]。目前已经报道危害枇杷的炭疽病病原菌并不单一，造成枇杷树势减弱，对枇杷产量造成巨大影响。因此本研究针对重庆地区发现的两种主要病原菌C.gloeosporioides及C.acutatum分别在ITS基因序列内设计特异性引物，拟实现对枇杷炭疽病菌的特异性扩增，为快速检测枇杷炭疽病菌并进行及早防治提供重要理论基础。3.2材料和方法3.2.1参试菌株及枇杷品种参试菌株：将保存至4℃冰箱的菌株进行活化，活化后的菌株转入新的PDA平板中，在25℃条件下培养3-5d，参试菌株信息见表3-1。同时在NCBI中下载同供试炭疽病菌株亲缘关系较近的其他种属病原菌的ITS序列，GenBank登录号见表2-3。供试枇杷品种：‘金华1号’及‘华白1号’。45 西南大学硕士学位论文表3-1供试枇杷炭疽病菌及其他真菌病害的病原菌菌株Table3-1IsolatesofColletotrichumsp.andotherfungalisolatesusedinthestudy编码菌株种类来源No.StrainSites1C.gloeosporioides分离自重庆歇马枇杷叶片2C.gloeosporioides购自中国农业微生物菌种保藏管理中心3C.acutatum分离自重庆歇马枇杷叶片4C.karstii分离自重庆合川枇杷叶片5C.orbiculare购自中国农业微生物菌种保藏管理中心6C.coccodes购自中国农业微生物菌种保藏管理中心7C.capsici购自中国农业微生物菌种保藏管理中心8C.truncatum购自中国农业微生物菌种保藏管理中心9Alternariasp.分离自重庆枇杷叶片10Phomasp.分离自重庆枇杷叶片11Phomopsissp.分离自重庆枇杷叶片12Botrysissp.分离自重庆枇杷叶片13Fusariumsp.分离自重庆枇杷叶片14Epicocumsp.分离自重庆枇杷叶片15Leptosphaeriasp.分离自重庆枇杷叶片16Pleosporalessp.分离自重庆枇杷叶片17Cladesporiumsp.分离自重庆枇杷叶片18Sohizophyllumsp.分离自重庆枇杷叶片19PyricμLariasp.分离自重庆枇杷叶片20CericμLariasp.分离自重庆枇杷叶片21Phyllostictasp.分离自重庆枇杷叶片22Pestalotiopsissp.分离自重庆枇杷叶片23Cylinlrobasidiumsp.分离自重庆枇杷叶片24弯孢霉（Curvulariaspp.）西南大学植物生态病理研究所惠赠25西瓜蔓枯病菌（Didymellabryoniae）西南大学植物生态病理研究所惠赠26松分离菌核菌（Rhizoctoniasolani）西南大学植物生态病理研究所惠赠27西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum）西南大学植物生态病理研究所惠赠28烟草赤星病菌（Alterariaalternata）西南大学植物生态病理研究所惠赠3.2.2植物组织及病原菌DNA提取3.2.2.1病原菌DNA提取病原菌DNA提取方法同2.2.5。46 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立3.2.2.2枇杷组织DNA提取（1）取叶片，去主脉，加PVP一小勺于无菌研钵中，迅速加入适量液氮用研磨棒研磨至粉末状后立即转入10mL离心管中。（2）加3mL去糖缓冲液，冰上处理10min。（3）5000r/min，4℃离心10min，倒上清。（4）重复（2）、（3）操作。（5）每管加入预热的CTAB3mL，摇匀，放入65℃水浴锅中水浴1h，期间每10min摇匀一次。（6）取出离心管轻微晃动，加醋酸钾200μL摇匀，冰盒上静置20min。（7）加入等体积氯仿:异戊醇（24:1，V/V），静置3-5min，摇匀，5000r/min，4℃离心15min。（8）取上清移入新离心管中，加入等体积氯仿:异戊醇（24:1，V/V），5000r/min，4℃离心15min。（9）取上清，加入1倍体积预冷的异丙醇，-20℃静置30min，然后6000r/min，4℃离心15min。（10）去上清液，将絮状DNA沉淀转移至1.5mL离心管中，加入400μL70%冷乙醇洗两次，然后6000r/min，4℃离心10min，真空干燥沉淀。（11）加入300μL灭菌水，轻敲管壁，使DNA完全溶解。（12）加入2μLRNase，37℃水浴30min，放入-20℃冰箱保存。3.2.2.3喷施孢子悬浮液枇杷叶片DNA提取将PDA培养基上培养6d的C.gloeosporioides及C.acutatum用无菌水冲洗6出孢子，配制成浓度为1×10个/mL的孢子悬浮液，分别取3mL均匀喷施于健康无菌枇杷叶片上，放置于铺有湿润滤纸的白色瓷盘内，上覆保鲜膜保湿，3d后取未显症枇杷叶片、5d后取显症叶片按照3.2.2.2中方法提取叶片DNA。3.2.3特异性引物设计菌株C.gloeosporioides及C.acutatum的特异性引物均在ITS序列内设计，将在NCBI上下载的其他种刺盘孢菌ITS序列及供试菌株ITS序列放入文本研究档中，应用软件Clustalx将上述文本打开，进行序列比对，找到C.gloeosporioides或者C.acutatum的特异性核酸位点，打开软件PrimerPremier5.0找到相应的区间设计引物。检查所设计的引物是否存在引物二聚体及发夹结构等影响PCR反应的因素。设计的候选引物再在DNAMAN软件中进行回检。将设计的引物送至上海英俊生物技术有限公司进行引物的合成，引物序列见表3-2及表3-3。47 西南大学硕士学位论文表3-2C.gloeosporioides特异性引物序列Table3-2SpecificprimersequenceforC.gloeosporioides引物名称正向序列反向序列产物长度(bp)PrimersForwardprimerReverseprimerLength(bp)Cg15'GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC3'5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'392Cg25'CCCTGTGTGAACATACCTAT3'5'CTTTCAGGGCCTACATCAGCT3'366Cg35'CCTGGTCTCTCGCCTCCGGGC3'5'GATGCGTGGTCAACCTTTGGAA3425'Cg45'GCTTCGGCGGGTAGGGTCTC3'5'GCTCCGTGGTCAACCTTTGG3'454Cg55'GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC3'5'CTTTCAGGGCCTACATCAGCT3'333Cg65'CCCTGTGTGAACATACCTAT3'5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'425Cg75'CCTGGTCTCTCGCCTCCGGGC3'5'GCTCCGTGGTCAACCTTTGG3'425Cg85'GCTTCGGCGGGTAGGGTCTC3'5'GATGCGTGGTCAACCTTTGGAA3454'Cg95'TGCTTCGGCGGGTAGGGTC3'5'CTTTCAGGGCCTACATCAGCT3'340Cg105'TGCTTCGGCGGGTAGGGTC3'5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'399Cg115'TGCTTCGGCGGGTAGGGTC3'5'GATGCGTGGTCAACCTTTGGAA3455'Cg125'TGCTTCGGCGGGTAGGGTC3'5'GCTCCGTGGTCAACCTTTGG3'455Cg135'GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC3'5'GATGCGTGGTCAACCTTTGGAA3448'Cg145'CCCTGTGTGAACATACCTAT3'5'GATGCGTGGTCAACCTTTGGAA3481'Cg155'CCCTGTGTGAACATACCTAT3'5'GCTCCGTGGTCAACCTTTGG3'481Cg165'CCTGGTCTCTCGCCTCCGGGC3'5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'369Cg175'CCTGGTCTCTCGCCTCCGGGC3'5'CTTTCAGGGCCTACATCAGCT3'310Cg185'GCTTCGGCGGGTAGGGTCTC3'5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'398Cg195'GCTTCGGCGGGTAGGGTCTC3'5'CTTTCAGGGCCTACATCAGCT3'339Cg205'GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC3'5'GCTCCGTGGTCAACCTTTGG3'44848 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立表3-3C.acutatum特异性引物序列Table3-3SpecificprimersequenceforC.acutatum引物名称正向序列反向序列产物长度(bp)PrimersForwardprimerReverseprimerLength(bp)Ca15'ACCCTTTGTGACATACCTAACC3'5'GAGCCGAGTTCAACCTGTAA3'490Ca25'GTGGGTAGGGGAAGCCTCT3'5'GCTCCGATGTCAACCTGTAA3'459Ca35'CACCCACCACGGGGACGG3'5'GCTCCGATGTCAACCTGTAA3'415Ca45'GGAGGAAACCAAACTCTATTTAC3'5'GCTCCGATGTCAACCTGTAA3'387Ca55'GGAGGAAACCAAACTCTATTTAC3'5'ATCCCAGTGCGAGACGTTA3'332Ca65'CACCACCACGGGGACGG3'5'ATGCCAGTGCGAGACGTTA3'359Ca75'CGGACAGGGGAAGCCTCT3'5'ATGCCAGTGCGAGACGTTA3'403Ca85'ACCCTTTGTGACATACCTAACC3'5'ATGCCAGTGCGAGACGTTA3'435Ca95'GCCATTTGTGACATACCTAACC3'5'TAACTTTAAGGGCCCACGTGT3'379Ca105'CGGGCAGGGGAAGCCTCT3'5'TACCTTTAAGGGCCCACGTGT3'347Ca115'ACCACCACCACGGGGACGG3'5'CTACCTTTAAGGGCCCACGTGT3'306Ca125'CGGAGGAAACCAAACTCTATTTAC3'5'CTTCAAGGGCCCACGTGT3'274Ca135'GTGGGTAGGGGAAGCCTCT3'5'ATGCCAGTGCGAGACGTTA3'404Ca145'ACCACCACCACGGGGACGG3'5'GAGCCGAGTTCAACCTGTAA3'416Ca155'CGGAGGAAACCAAACTCTATTTAC3'5'CTACCTTTAAGGGCCCACGTGT3'278Ca165'CACCCACCACGGGGACGG3'5'TACCTTTAAGGGCCCACGTGT3'304Ca175'CACCACCACGGGGACGG3'5'CTTCAAGGGCCCACGTGT3'30049 西南大学硕士学位论文3.2.4常规PCR及Nested-PCR反应3.2.4.1常规PCR扩增PCR扩增反应体系（40μL）：2×PCRMastermix（含染料）（上海生工）20μL，引物各1μL，一轮产物稀释1000倍取1μL，加ddH2O至40μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。3.2.4.2Nested-PCR扩增以ITS1/ITS4作为第一轮反应引物，反应体系和反应程序同2.2.5中所述。取1μL反应产物稀释1000倍作为第二轮扩增的模板，特异性引物作为第二轮扩增引物，反应体系和反应程序同3.2.4.1中所述。取10μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照。3.2.5灵敏度检测将C.gloeosporioides基因组DNA以10倍浓度为一个数量级从100ng/μL稀释至1pg/μL，即100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL，分别取1μL进行常规PCR及nested-PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像仪拍照。将C.acutatum基因组DNA以10倍浓度为一个数量级从100ng/μL稀释至10ag/μL，即100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL，分别取1μL进行常规PCR及nested-PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像仪拍照。3.2.6枇杷病组织快速检测利用筛选出的分别针对C.gloeosporioides及C.acutatum的两对特异性引物分别以C.gloeosporioides及C.acutatum的致病性回接显症枇杷叶片DNA、回接未显症枇杷叶片DNA、采集的具有典型炭疽病病症的枇杷叶片DNA和健康枇杷叶片DNA为模板进行nested-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像仪检测拍照。同时将采集的具有典型炭疽病病症的叶片按照2.2.3中的方法进行分离纯化。3.3结果与分析3.3.1基因组DNA的提取50 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立3.3.1.1参试菌株基因组DNA提取结果对供试的刺盘孢菌株及其他对照菌株的DNA进行提取（表3-1），所提DNA浓度在200-500ng/μL，蛋白含量260/280在1.8-2.0之间，污染物260/230在1.2-1.8之间，符合后续PCR反应的条件。所有参试菌株用通用引物ITS1及ITS4扩增，扩增产物经过凝胶电泳检测，目标条带单一明亮，无拖尾现象，菌株条带均在500-600bp，符合各DNA的ITS序列的标准长度（图3-1）。图3-1菌株DNA通用引物ITS1/ITS4扩增反应结果Fig.3-1TheexpansionincreasereactionresultsofstrainDNAuniversalprimerITS1/ITS4注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker；泳道1-28是通用引物ITS1/ITS4对表3-1中所对应的参试菌株DNA溶液PCR扩增；泳道29为空白对照（H2O）。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000;lane1-28werePCRamplificationofstrainscorrespondingtable3-1byuniversalprimerITS1/ITS4;lane29wasH2O3.3.1.2对枇杷样本组织基因组DNA提取结果分别提取健康枇杷叶片、回接显症枇杷叶片、回接未显症枇杷叶片及田间典型炭疽病症状枇杷叶片基因组DNA。所提取的基因组DNA总浓度大于500ng/μL，DNA质量符合后续PCR实验。所有枇杷组织DNA用通用引物ITS1/ITS4扩增，扩增产物经过凝胶电泳检测，目标条带单一明亮，无拖尾现象，条带均在600-700bp，符合各DNA的ITS序列的标准长度（图3-2、3-3）。51 西南大学硕士学位论文图3-2健康及携带C.gloeosporioides枇杷叶片DNA通用引物ITS1/ITS4扩增反应结果Fig.3-2TheexpansionincreasereactionresultsoftissueDNAofloquatuniversalprimerITS1/ITS4注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker；泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA；泳道10-12为典型炭疽病样枇杷叶片DNA；泳道13-16为接种C.gloeosporioides但未显症枇杷叶片DNA；泳道17-18为接种C.gloeosporioides且显症枇杷叶片DNA；泳道19为空白对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-9wereDNAfromhealthyloquatleaves,lane10-12wereDNAfromloquatleavesnaturallyinfectedanthracnose,lane13-16wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.gloeosporioidesbutwithoutsymptoms,lane17-18wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.gloeosporioideswithsymptoms,lane19wasH2O.图3-3健康及携带C.acutatum枇杷组织DNA通用引物ITS1/ITS4扩增反应结果Fig.3-3TheexpansionincreasereactionresultsoftissueDNAofloquatuniversalprimerITS1/ITS4注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker；泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA；泳道10-12为典型炭疽病样枇杷叶片DNA；泳道13-16为接种C.acutatum但未显症枇杷叶片DNA；泳道17-18为接种C.acutatum且显症枇杷叶片DNA；泳道19为空白对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-9wereDNAfromhealthyloquatleaves,lane10-12wereDNAfromloquatleavesnaturallyinfectedanthracnose,lane13-16wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.acutatumbutwithoutsymptoms,lane17-18wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.acutatumwithsymptoms,lane19wasH2O.52 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立3.3.2PCR引物筛选共设计针对C.gloeosporioides引物20对、C.acutatum引物17对。经过筛选后得到C.gloeosporioides种属专化性引物1对Cg1F/R，引物位点如图3-4；C.acutatum种属专化性引物1对Ca1F/R，引物位点如图3-5。两对特异性引物信息见表3-4。图3-4C.gloeosporioides特异性引物Cg1F/R位点信息Fig.3-4ThesiteinformationofspecificprimerCg1F/RofC.gloeosporioides图3-5C.acutatum特异性引物Ca1F/R位点信息Fig.3-5ThesiteinformationofspecificprimerCg1F/RofC.acutatum表3-4两对特异性引物信息Table3-4Informationoftheprimer基因引物名称引物序列（5'-3'）起始位置GC含量（%）引物长度（bp）GenePrimernamePrimersequence(5'-3')InitiationsiteGCcontent(%)Primerlength(bp)Cg1F5'GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC3'416520ITSCg1R5'TCCTAGTGCGAGACGTAA3'4325018Ca1F5'ACCCTTTGTGACATACCTAACC3'145.522ITSCa1R5'GAGCCGAGTTCAACCTGTAA3'490502053 西南大学硕士学位论文3.3.3PCR引物的特异性检测以真菌通用引物对ITS1/ITS4作为外引物，专化性引物对Cg1F/R或Ca1F/R作为内引物进行nested-PCR扩增，一轮反应所有参试的菌株均可扩增出500bp左右条带，条带单一明亮，无拖尾及非特异性扩增现象（图3-1），将一轮产物稀释1000倍后作为二轮反应的模板进行巢式扩增。引物对Cg1F/R只能从枇杷C.gloeosporioides中扩增到392bp的特异性片段（图3-6），条带单一明亮，无拖尾及非特异性扩增现象，而此对引物对尖孢炭疽病菌株（C.acutatum）、喀斯特炭疽病菌株（C.karstii）、瓜炭疽病菌株（C.orbiculare）、毛核炭疽病菌株（C.coccodes）、辣椒炭疽病菌株（C.capsici）、平头炭疽病菌株（C.truncatum）及其他对照病菌菌株均无扩增条带，表明该引物具有种属专化性，可以将C.gloeosporioides与其他属种很好的区分开。图3-6ITS-gene区特异性引物Cg1F/Rnested-PCR扩增结果Fig.3-6TheamplificationeffectofspecificprimerCg1F/RfromITS-genebynestedPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-28是特异性引物Cg1F/R对表3-1中所对应的供试菌株DNA溶液PCR扩增，29为阴性对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-28werePCRamplificationofstrainscorrespondingtable3-1byprimerCg1F/R,lane29wasH2O.同样，专化性引物对Ca1F/R只能从C.acutatum中扩增到490bp的特异片段（图3-7），条带单一明亮，无拖尾及非特异性扩增现象，而此对引物对胶孢炭疽病菌株（C.gloeosporioides）、喀斯特炭疽病菌株（C.karstii）、瓜炭疽病菌株（C.orbiculare）、毛核炭疽病菌株（C.coccodes）、辣椒炭疽病菌株（C.capsici）、平头炭疽病菌株（C.runcatum）及其他对照病菌的菌株均无扩增条带，表明该引物具有种属专化性，可以将C.acutatum与其他属种很好的区分开。54 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立图3-7ITS-gene区特异性引物Ca1F/Rnested-PCR扩增结果Fig.3-7TheamplificationeffectofspecificprimerCa1F/RfromITS-genebynestedPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-28是特异性引物Ca1F/R对表3-1中所对应的供试菌株DNA溶液PCR扩增，29为阴性对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-28werePCRamplificationofstrainscorrespondingtable3-1byprimerCa1F/R,lane29wasH2O.3.3.4常规PCR与Nested-PCR灵敏度检测对浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL的C.gloeosporioides基因组DNA分别进行常规PCR扩增（图3-8）及nested-PCR扩增（图3-9），结果表明nested-PCR具有更高的灵敏度。在40μL反应体系中，常规PCR灵敏度为1ng/μL，低于1ng/μL则不能检测到条带。而nested-PCR则能从浓度为1pg/μL以上的模板中扩增出约400bp的特异性条带，3检测灵敏度提高了10倍，可满足田间检测要求。图3-8常规PCR灵敏度检测结果Fig.3-8SensitivitytestresultsofconventionalPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-7的枇杷胶孢炭疽病原菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-7wereDNAproductsofC.gloeosporioidesatquantityof100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL.55 西南大学硕士学位论文图3-9nested-PCR灵敏度检测结果Fig.3-9SensitivitytestresultsofnestdPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-7的枇杷胶孢炭疽病原菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-7wereDNAproductsofC.gloeosporioidesatquantityof100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL.对浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL的C.acutatum基因组DNA分别进行常规PCR扩增（图3-10）及nested-PCR扩增（图3-11），结果表明nested-PCR具有更高的灵敏度。在40μL反应体系中，常规PCR灵敏度为10pg/μL，低于10pg/μL则不能检测到条带。而nested-PCR则能从浓度为10ag/μL6以上的模板中扩增出条约500bp的特异性条带，检测灵敏度提高了10倍，可满足田间检测要求。图3-10.常规PCR灵敏度检测结果Fig.3-10SensitivitytestresultsofconventionalPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-12的枇杷尖孢炭疽病原菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-12wereDNAproductsofC.acutatumatquantityof100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,100ag/μL,10ag/μL,1ag/μL.56 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立图3-11nested-PCR灵敏度检测结果Fig.3-11SensitivitytestresultsofnestdPCR注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-12的枇杷尖孢炭疽病原菌基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-12wereDNAproductsofC.acutatumatquantityof100ng/μL,10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,100ag/μL,10ag/μL,1ag/μL.3.3.5Nested-PCR野外时效性检测3.3.5.1从枇杷发病组织上快速检测枇杷炭疽病菌健康枇杷叶片、采集具有典型炭疽病的枇杷叶片、接种C.gloeosporioides但未显症枇杷叶片及接种且已显症枇杷叶片经CTAB提取方法提取总DNA后，以真菌通用引物ITS1/ITS4作为外引物，专化性引物Cg1F/R作为内引物进行nested-PCR检测。结果发现，采集具有典型炭疽病的枇杷叶片、接种C.gloeosporioides但未显症枇杷叶片及接种已显症的枇杷叶片均能扩增出一条大小约为400bp的条带，而健康叶片未能扩增出任何条带（图3-12）。同样，用专化性引物Ca1F/R作为内引物进行nested-PCR扩增，结果显示，仅健康叶片未能扩增出任何条带，采集具有典型炭疽病的枇杷叶片、接种C.acutatum但未显症枇杷叶片及接种且已显症枇杷叶片均能检测到500bp左右目标片段（图3-13）。57 西南大学硕士学位论文图3-12枇杷组织DNACg1F/R扩增结果Fig.3-12TheamplificationeffectofCg1F/RfromloquattissueDNA注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA，泳道10-12为典型炭疽病样枇杷叶片DNA，泳道13-16为接种C.gloeosporioides但未显症枇杷叶片DNA，泳道17-18为接种且显症枇杷叶片DNA，泳道19为阴性对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-9wereDNAfromhealthyloquatleaves,lane10-12wereDNAfromloquatleavesnaturallyinfectedanthracnose,lane13-16wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.gloeosporioidesbutwithoutsymptoms,lane17-18wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.gloeosporioideswithsymptoms,lane19wasH2O.图3-13枇杷组织DNACa1F/R扩增结果Fig.3-13TheamplificationeffectofCa1F/RfromloquattissueDNA注：图中泳道M为标准分子量大小DL1000marker，泳道1-9为健康枇杷叶片组织DNA，泳道10-12为典型炭疽病样枇杷叶片DNA，泳道13-16为接种C.acutatum但未显症枇杷叶片DNA，泳道17-18为接种且显症枇杷叶片DNA，泳道19为阴性对照。TMNote:laneMwasDNAMarkerDS1000,lane1-9wereDNAfromhealthyloquatleaves,lane10-12wereDNAfromloquatleavesnaturallyinfectedanthracnose,lane13-16wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.acutatumbutwithoutsymptoms,lane17-18wereDNAfromloquatleavesinoculatedC.acutatumwithsymptoms,lane19wasH2O.58 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立3.3.5.2田间快速检测枇杷叶片炭疽病菌利用nested-PCR方法对来自重庆市各枇杷产区的60份已显症的疑似枇杷炭疽病叶片及27份未显症叶片进行检测，并对供试的87份枇杷样品采用传统的分离方法和单基因及多基因系统发育分析进行验证。由表3-5可知，显症叶样中，利用传统分离鉴定法共从39份病样中分离获得刺盘孢属菌株，其中6份病样同时分离获得C.gloeosporioides和C.acutatum；2份病样同时分离获得C.gloeosporioides和C.karstii（表中未显示）；17份病样仅分离出C.gloeosporioides；12份病样仅分离出C.acutatum；2份病样仅分离出C.karstii（表中未显示）。利用本研究建立的nested-PCR分子检测体系共从44份病样中检测出刺盘孢属菌，其中9份病样同时检测到C.gloeosporioides和C.acutatum，比传统鉴定结果多3份，19份病样仅检测出C.gloeosporioides，与传统鉴定结果一致；16份病样仅检测出C.acutatum，比传统鉴定结果多4份。可见，本研究建立的nested-PCR分子检测体系的检出率高于传统分离鉴定法。由表3-6可知，未显症叶样中，利用传统分离鉴定法从2份病样中分离得刺盘孢属菌，均为C.gloeosporioides；采用nested-PCR法从9份病样中检测出刺盘孢属，其中6份病样检测到C.gloeosporioides，3份病样检测到C.acutatum。由此可见，该体系可检测携带微量C.gloeosporioides或C.acutatum的枇杷叶片。表3-5田间显症枇杷病样炭疽病菌的检测结果Table3-5TestingresultsofColletotrichumspp.onloquatleafsinthefields显症病样检测方法SymptomaticsampleDetectmethods样本数阳性样检出C.gloeosporioides检出C.acutatum同时检出C.gloeosporioides本数样本数样本数和C.acutatum样本数传统分离方法603917126Nested-PCR60441916959 西南大学硕士学位论文表3-6田间未显症枇杷病样炭疽病菌的检测结果Table3-6testingresultsofColletotrichumspp.onloquatleafsinthefields未显症病样检测方法SamplewithoutsymptomsDetectmethods样本数阳性样检出C.gloeosporioides检出C.acutatum同时检出C.gloeosporioides本数样本数样本数和C.acutatum样本数传统分离方法272200Nested-PCR2796303.4结论与讨论基于核糖体DNA序列对比枇杷炭疽病两个重要病原菌C.gloeosporioides和C.acutatum的差异序列，设计并合成了2对特异性巢式内引物Cg1F/R和Ca1F/R。以真菌通用引物对ITS1/ITS4作为外引物，专化性引物对Cg1F/R作为内引物的nested-PCR体系只在C.gloeosporioides中扩增出392bp的特异片段，在其它病原真菌中无扩增片段；同样，以专化性引物对Ca1F/R作为内引物的nested-PCR体系只在C.acutatum中扩增出490bp的特异片段，在其它病原真菌中无扩增片段。采用Cg1F/R进行常规PCR扩增，检测C.gloeosporioides菌株基因组DNA3的灵敏度为1ng/μL，而nested-PCR的灵敏度为1pg/μL，是常规PCR的10倍；采用Ca1F/R进行常规PCR扩增，检测C.acutatum菌株基因组DNA的灵敏度为610pg/μL，而nested-PCR的灵敏度为10ag/μL，是常规PCR的10倍。本研究建立的针对C.gloeosporioides的nested-PCR体系均可从发病样品中扩增出392bp单一明亮条带，而健康叶片却无条带，且可快速检测出携带微量C.gloeosporioides的叶片组织。针对C.acutatum的nested-PCR体系均可从发病样品中扩增出490bp单一明亮条带，健康叶片同样无条带，且可快速检测出携带微量C.acutatum的叶片组织。说明该体系可用于果园中疑似炭疽病样的快速检测，检测结果可靠。田间采集的87份样品中，同时检测到C.gloeosporioides及C.acutatum存在的样品有9份，同时检测到C.gloeosporioides及C.karstii的样品有2份，而目前没有检测到三种病原菌同时存在，这说明枇杷炭疽病可能存在混合致病现象，而[105]目前文献中鲜有提及多种病原菌同时致病现象，颜群等也只是在文章中略提到有时C.gloeosporioides及C.acutatum可同时致病。而对于无病斑叶片中检测出刺60 第3章枇杷炭疽病菌C.gloeosporioides及C.acutatum分子检测体系的建立盘孢，说明病原菌已经潜伏侵染，但还未显症。而部分无病斑叶片并没有检测到刺盘孢，可能是刺盘孢浓度低于检测极限或者该叶片本为健康无病叶片，又或者是因为该叶片感染其他病原菌故而针对刺盘孢的分子检测体系检测不到刺盘孢存在。炭疽病菌的传统鉴定方法主要依据形态学的特征，如大型分生孢子形态、小型分生孢子的有无和着生方式、分生孢子梗的特征、菌落的生长速度和颜色等，但是这些形态上的性状往往都要受到环境条件的影响，如温度、湿度及培养基的性状等，因此易造成漏检或是假阳性反应。而DNA是遗传的物质基础，决定着物种的多样性，并能在更精确的层次上揭示物种的特性。近年来，分子生物学技术已成为广泛使用的方法，而其中nested-PCR因具有灵敏度高、特异性强等特点，[130]已经广泛用于多种病原菌的快速鉴定。柑橘黑斑病相关的叶点霉属真菌、黄瓜[131][132][133]尖镰孢菌、桉树焦枯病原菌、荔枝霜疫霉等均采用nested-PCR实现快速鉴定。61 西南大学硕士学位论文62 第4章结论第4章结论本研究自2016年2月-10月在西南大学种质资源圃对疑似炭疽病的枇杷病株进行发病规律调查，并于2015-2017年从西南大学种质资源圃、合川渭沱枇杷种植区及西南大学105枇杷种植基地采集具有枇杷炭疽病病症的病叶及病果为实验材料，采用组织分离法分离其病原菌，然后通过形态学特征和单基因及多基因系统分类学相结合的方法对其进行鉴定，确定其分类地位。通过比较分析不同病原菌ITS基因的特异性片段设计特异性引物，建立了枇杷炭疽病的nested-PCR快速分子检测体系，为枇杷炭疽病早期诊断和有效防治提供了技术支撑。1.对枇杷病株进行发病规律调查发现，枇杷炭疽病在4月左右开始爆发，而6-7月两个月为发病的高峰期。另外，相对高温湿环境有利于病害传播，特别是夏稍新叶最易发病。2.结合传统分离鉴定法和单基因及多基因联合分析法将重庆地区枇杷炭疽病病原菌鉴定为3个种，分别为C.gloeosporioides、C.acutatum及C.karstii。3.通过枇杷炭疽病病原菌的致病性测定结果可知，所有刺盘孢属菌株均有致病性，但它们的致病力存在差异。在叶片上C.gloeosporioides致病力最强，C.acutatum次之，C.karstii最弱。在果实上，C.acutatum致病力最强，C.gloeosporioides次之，C.karstii最弱。4.本研究成功建立了2套快速鉴定枇杷炭疽病的nested-PCR体系。针对C.gloeosporioides的体系只可在C.gloeosporioides中扩增出392bp的特异片段，3且灵敏度较常规PCR高10倍；同样，针对C.acutatum的nested-PCR体系只可6在C.acutatum中扩增出490bp的特异片段，灵敏度是常规PCR的10倍。5.利用构建的2套nested-PCR检测方法，对田间枇杷病样能够进行一个有效的分子鉴定，即使携带微量病原菌的枇杷样本也可以快速鉴定，从而可对枇杷炭疽病病原菌进行早期的鉴定。为枇杷炭疽病病害的早期诊断、快速准确鉴定以及后期的防治工作提供一定的依据。63 西南大学硕士学位论文64 第5章实验创新点与研究展望第5章创新点与研究展望5.1创新点（1）本研究首次结合传统分离鉴定法和单基因及多基因联合分析法明确重庆地区枇杷炭疽病病原菌种类。发现C.karstii也是重庆地区枇杷炭疽病的病原菌，此发现未见报道。（2）本研究所建立的2套nested-PCR体系可为枇杷炭疽病主要病原菌的快速检测和早期病害诊断工作提供技术支撑。5.2研究不足由于时间关系，本研究所采集的样品并没有包含重庆所有地区的枇杷果园，仅以重庆几个种植区作为代表，这样获得的快速分子检测体系可能具有一定的局限性。若以后有进一步研究需要，应扩大样品采集范围，以此扩大分子检测体系的应用范围。同时，本研究使用的两种枇杷品种主要为市场销量较好的品种，而枇杷品种达到数十种，故后续研究将会延伸到其他枇杷品种，以验证该分子检测体系的快速性和适用性。本研究建立的2套nested-PCR分子检测体系因为错过枇杷果实成熟期而没有对果实上炭疽病快速检测进行验证，所以后续研究将会在果实成熟期，运用两套nested-PCR体系对果实炭疽病进行验证。5.3研究展望本研究获得的分子检测体系虽然可以对枇杷炭疽病进行快速鉴定，但是并不能对炭疽病菌进行量化分析，因此，后续研究希望通过筛选得到的特异性引物结合q-PCR技术来实现对炭疽病菌的量化分析，从而可以准确得到炭疽病菌对枇杷的侵染程度，达到早发现早治疗的目的。相信在本研究研究基础上，再结合其他检测技术定能建立一套完善的枇杷炭疽病的快速分子检测技术，为实现枇杷炭疽病菌快速检测并进行及早防治提供重要实践基础。65 西南大学硕士学位论文66 参考文献参考文献[1]陈飞平,周家华,常虹,等.枇杷核成分、功效及开发利用研究进展[J].食品科学,2012,33(17):336-340.[2]KobayashiT.IndexoffungiinhabitingwoodyplantsinJapan[J].Host,DistributionandLiterature,2007:1227.[3]章恢志,方德秋.中国枇杷属种质资源及普通枇杷起源研究[J].园艺学报,1990,(1):5-12.[4]刘国强,林志清.我国枇杷种质资源及选育种研究进展(综述)[J].亚热带植物科学,2000,29(2):65-70.[5]瞿付娟.重庆枇杷花腐病病因研究[D].重庆:西南大学,2008.[6]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版社,1979.[7]周庆椿.枇杷常见病虫害的防治[J].植物医生,2009,22(6):27-28.[8]林尤剑,胡翠风.福建枇杷病害与综合防治[J].东南园艺,1993,3):58-60.[9]JeffriesP,DoddJC,JegerMJ,etal.ThebiologyandcontrolofColletotrichumspeciesontropicalfruitcrops[J].PlantPathology,1990,39(3):343-366.[10]陈福如,杨秀娟.福建省枇杷真菌性病害调查与鉴定[J].福建农业学报,2002,17(3):151-154.[11]孔琼,袁盛勇,叶海燕,等.云南枇杷炭疽病菌生物学特性研究[J].西南农业学报,2010,23(4):1380-1382.[12]李小霞,肖仲久,章同平.贵州枇杷炭疽病病原菌的鉴定及rDNA-ITS序列分析[J].中国森林病虫,2012,31(2):7-10.[13]WuW,LiuY,HuangX,etal.FirstreportofanthracnosecausedbyColletotrichumnymphaeaeonloquatfruitinChina[J].PlantDisease,2017,102(1):22-37.[14]SatoT,UematsuS,MizoguchiH,etal.AnthracnoseofprairiegentianandloquatcausedbyColletotrichumacutatum[J].JapaneseJournalofPhytopathology,2009,63(1):16-20.[15]NazF,AbbasMF,RaufCA,etal.FirstreportofColletotrichumGloeosporioidescausinganthracnoseonloquatinPakistan[J].PlantDisease,2017,101(8):1550.[16]WehlburgC,AlfieriSA,Jr,LangdonKR,etal.IndexofplantdiseasesinFlorida[J].IndexofPlantDiseasesinFlorida,1975,11:390.[17]InternationalC.IndexofplantdiseasesintheUnitedStates[M].67 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致谢致谢时间如白驹过隙，稍纵即逝，三年的硕士研究生求学历程即将结束。回首起来，一切的一切都恍如昨日重现，历历在目，内心更是思绪万千，也有道不尽的万千感激。本研究是在导师梁国鲁研究员和吴頔老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。从论文的立题、设计、实施到撰写成文无不倾注了导师大量的心血。导师严肃的科学态度，严谨的治学精神，平易近人的长者风范，渊博的学识都给我树立了做学问和做人的好榜样，让我受益匪浅。借此我向我最敬爱的恩师致以最衷心地感谢。在实验开题、设计以及实施过程中，郭启高研究员，何桥副研究员，李晓琳老师，景丹龙老师等都提出了许多宝贵的意见，给予我耐心的指导和帮助。同时，也要感谢西南大学植物病理生态研究所惠赠实验材料，感谢其中的老师们给予热情帮助，在此，也向他们表示衷心地感谢。此外，我也要感谢党江波、张丹华、陈薇薇、杨星等几位师兄师姐对我实验的指点和帮助，感谢袁婷、刘婷、梁森林、王鹏、蒋朋飞、李荣飞等师弟师妹以及刘松月、舒巧丽、宋琴、侯康、陶聪聪、蒋圆圆、李小寒等同窗好友对我实验和生活上的帮助，在此，我对帮助过我的朋友们一并表示衷心地感谢！最后，特别感谢远在家乡的父母亲人和男朋友张旭辉，感谢你们一直以来对我的关爱、理解与包容，正是你们在物质上和精神上给予我莫大的支持，使我能够专心学习，你们是我顺利完成学业和不断成长的坚强后盾和精神支柱。再次向给予我帮助和支持的老师、同学、朋友和亲人致以最诚挚的谢意！张红楠2018年4月9日77 78 发表论文、获奖及科研情况发表论文、获奖及科研情况一、攻读硕士学位期间发表文章：1.张红楠,张旭辉,吴頔.生防烟管菌对植物抗病性相关酶活性及叶绿素含量的影响[J].浙江农业科学,2017,58(12):2226-2230.2.张红楠,张旭辉,吴頔,等.烟管菌M-1菌株对油菜核盘菌的生防作用研究[J].草业学报,2018,27(3):78-89.*3.张旭辉,张红楠,李勇,等.抑制西瓜蔓枯病菌的生防真菌筛选、鉴定及发酵条件优化[J].中国生物工程杂志,2017,37(5):76-86.4.张丹华,张红楠,吴頔,等.重庆地区枇杷叶斑病病原初步鉴定及防治药剂室内筛选[J].中国南方果树,2017,46(4):102-106.二、获奖情况：2016--2017学年：荣获西南大学“三好研究生”称号；2017--2018学年：荣获研究生国家奖学金；荣获西南大学科研活动奖；荣获西南大学“科技创新先进个人”称号。三、参加课题及实践：1.参研重庆市应用开发计划项目：三倍体无核抗病枇杷质源创新研究，2014-2016，项目编号：cstc2014yykfB50001。2.参研西南大学基本科研业务费专项资金项目：基于Miseq高通量测序的枇杷主要叶部病害诊断方法研究，2016-2017，项目编号：XDJ2016185。3.参研第59批中国博士后科学基金面上资助项目：无核抗病枇杷新种质创新及其鉴定，2016-2018，项目编号：2016M592621。79