重组腺相关病毒基因药物口服吸收机制

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学校代码：10385分类号：研究生学号：1000216020密级：硕士学位论文重组腺相关病毒基因药物口服吸收机制Studiesontheabsorptionmechanismofrecombinantadeno-associatedvirusgenemedicine作者姓名：李佳指导教师：刁勇教授学科：生物学研究方向：重组腺相关病毒基因药物所在学院：生物医学学院论文提交日期：二零一三年三月二十九日 学位论文独创性声明本人声明兹呈交的学位论文是本人在导师指导下完成的研究成果。论文写作中不包含其他人已经发表或撰写过的研究内容，如参考他人或集体的科研成果，均在论文中以明确的方式说明。本人依法享有和承担由此论文所产生的权利和责任。论文作者签名：签名日期：学位论文版权使用授权声明本人同意授权华侨大学有权保留并向国家机关或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权华侨大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。论文作者签名：指导教师签名：签名日期：签名日期： 摘要重组腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirus，rAAV）载体具有免疫原性低、能介导外源基因稳定表达等优点，口服rAAV基因药物的有效性已得到大量实验证实。本实验通过构建M细胞模型、小鼠肠袢模型和小鼠口服灌胃给药这3种方法探讨了rAAV基因药物的转运、吸收和转基因的表达。（1）利用Caco-2细胞与人RajiB细胞共培养成功诱导分化出M样细胞，其顶层膜表面绒毛退化，只有形态数量不等的微绒毛，缺乏肠上皮细胞的典型刷状缘，碱性磷酸酶活性降低，凝集素-9表达上调。建立的M细胞模型符合实验要求，在rAAV基因药物跨M细胞转运实验中，rAAV能通过M细胞模型中的细胞单层从AP侧转运至BL侧，但病毒转运量较少。（2）Galectin-9免疫组化染色结果显示，肠上皮细胞及黏膜固有层中无Galectin-9表达，Galectin-9在派氏结的滤泡相关上皮（FAE）中高表达。（3）小鼠肠袢模型进行rAAV2基因药物给药2天后，在肠上皮细胞中能检测到转基因EGFP的表达。（4）小鼠口服rAAV基因药物后7天，在十二指肠与空肠中检测出rAAV载体基因组，并在肠上皮细胞与黏膜固有层细胞中检测到转基因表达产物。实验结果表明rAAV基因药物跨M细胞进行了少量转运，并证实了rAAV基因药物口服吸收的可行性，但口服rAAV基因药物的有效表达仍面临许多困难。加强rAAV基因药物生物药剂学方面的研究，为今后促进口服rAAV基因药物的剂型设计和临床应用奠定基础。关键词：重组腺相关病毒M细胞肠袢模型口服给药I AbstractRecombinantadeno-associatedvirus(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)eltcitsminimalimmuneresponsesandmediateslong-termtransgeneexpressioninavarietyofcelltypes.TheefficacyofrAAVvector-mediatedgenedeliverytothegastrointestinaltracthasbeendemonstrated.Inthisstudy,weusedthreemethods(Mcellmodel,mouseintestinalloopmodel,oralgavage)toevaluatedrugdelivery,absorption,distributionandtransductionoforalrAAVgenemedicine.CoculturesofphysicallyseparatedhumanintestinalepithelialCaco-2cellsandB-celllymphomaRajicellswereestablished.Thecocultureswerecharacterizedunderthecriteriaofmorphology,integrity,expressionofM-cellmarkers.Usingthisconstruct,theepithelialcellsweretransformedtocellswithanM-cell-likemorphologybyelectronmicroscopyandhadalteredexpressionofpotentialM-cellmarkers(alkalinephosphatasedown-regulationandGalectin-9up-regulation).InrAAVgenemedicinetransportexperiments,rAAVtransportedfromtheAPsidetoBLsidethroughMcells,buttheamountofviruscrossingthecellmonolayersisless.Immunohistochemistryofgalectin-9demonstratedthatgalectin-9expressioninintestinalepithelialcellsandlaminapropriaispoor,andgalectin-9ishighlyexpressedinfollicle-associatedepithelium(FAE)ofPeyer’spatches(PPs).Inmouseintestinalloopmodel,thetransgenicEGFPexpressioninintestinalepithelialcellswasdetectedat2daysafteradministrationofrAAV2vector.At7daysafteroraladministrationofrAAV2vector,vectorDNAintheduodenumandjejunumwasdetected.Inaddition,anorallyadministeredrAAVleadstotheexpressionofEGFPandLacZtransgeneinbothintestinalepithelialcellsandlaminapropriacells.ThisstudyconfirmedthefeasibilityoforalabsorptionofgenemedicinecarriedbyrAAVvector,buttheeffectiveexpressionoforalgenemedicinestillfacedmanyobstacles.ThroughcomprehensivestudyforbiopharmaceuticsofrAAVgenemedicine,aidealformulationwasdesignedtoovercometheexpressionbarriersofII genemedicines,whichcanlaidfoundationforclinicalapplicationoforalgenemedicine.KeyWords:rAAVMcellmouseintestinalloopmodeloraladministrationIII 目录第1章引言.......................................................11.1口服重组腺相关病毒基因药物.................21.1.1口服rAAV基因药物的药效学..............21.1.2口服rAAV基因药物的药动学................................31.1.3口服rAAV基因药物的生物药剂学............................71.2本课题的来源与研究内容.......................................91.2.1本课题的来源.............................................91.2.2本课题的研究内容.........................................9第2章M细胞模型研究rAAV基因药物的转运..........................112.1实验材料、试剂与仪器........................................112.1.1实验材料................................................112.1.2实验试剂................................................122.1.3实验仪器................................................122.1.4溶液配制................................................132.2实验方法....................................................152.2.1细胞培养................................................152.2.2M细胞模型建立..........................................162.2.3细胞形态学观察..........................................172.2.4细胞单层的完整性........................................172.2.5细胞单层的极性..........................................18V 2.2.6M细胞标志物半乳糖凝集素-9（Galectin-9）.................202.2.7rAAV基因药物跨M细胞转运...............................232.2.8统计学分析..............................................242.3实验结果与分析..............................................242.3.1细胞形态学观察和细胞单层形成............................242.3.2Caco-2细胞单层的完整性.................................252.3.3Caco-2细胞单层的极性...................................262.3.4M细胞模型特性的表征....................................272.3.5rAAV基因药物跨M细胞转运...............................302.4小结........................................................31第3章小鼠肠袢模型研究rAAV基因药物的吸收及表达.................333.1实验材料、试剂与仪器........................................333.1.1实验材料................................................333.1.2实验试剂................................................333.1.3实验仪器................................................343.1.4溶液配制................................................343.2实验方法....................................................353.2.1小鼠肠袢模型的建立及分组给药............................353.2.2HE染色检测组织形态.....................................353.2.3免疫组织化学检测Galectin-9、EGFP的表达.................373.2.4X-gal组织化学染色检测β-半乳糖苷酶的表达...............383.2.5统计学分析..............................................393.3实验结果与分析..............................................39VI 3.3.1组织形态................................................393.3.2Galectin-9(半乳糖凝集素-9)的表达........................393.3.3EGFP的表达.............................................403.3.4β-半乳糖苷酶的表达.....................................413.4小结........................................................42第4章rAAV基因药物在小鼠体内的口服吸收及表达....................434.1实验材料、试剂与仪器........................................434.1.1实验材料................................................434.1.2实验试剂................................................434.1.3实验仪器................................................434.2实验方法....................................................434.2.1口服rAAV基因药物.......................................434.2.2HE染色检测组织形态.....................................444.2.3免疫组织化学检测EGFP的表达.............................444.2.4冰冻切片................................................444.2.5X-gal组织化学染色检测β-半乳糖苷酶的表达...............454.2.6rAAV病毒基因组的分布...................................454.2.7统计学分析..............................................484.3实验结果与分析..............................................484.3.1肠组织形态..............................................484.3.2病毒基因组分布..........................................494.3.3EGFP的表达.............................................50VII 4.3.4β-半乳糖苷酶的表达.....................................524.4小结........................................................52第5章结论......................................................54参考文献..........................................................55致谢............................................................59个人简历..........................................................61VIII 主要符号对照表rAAV重组腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirus）DMSO二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）FAE滤泡相关上皮（follicle-associatedepithelium）Caco-2细胞人结肠腺癌细胞系（humancolonadenocarcinomacelllines）GALT肠道相关淋巴组织（gut-associatedlymphoidtissues）AP侧黏膜侧或肠腔侧（apicalside）BL侧膜侧或肠内壁侧（basolateralside）IX 第1章引言重组腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirus，rAAV）载体因为具有稳定性高、致病性低、免疫原性低、感染宿主范围广及能够长期表达外源基因等特点，日益受到科研人员的关注。口服rAAV基因药物的药效学研究取得了较大成果，但忽视了rAAV基因药物经胃肠道的吸收机制。rAAV基因药物如何突破胃肠道天然屏障，其细胞摄取、转运和表达的时空过程，以及口服给药技术等一系列问题都引起了研究人员的关注，并作为今后努力的方向。1.1口服重组腺相关病毒基因药物临床研究中基因药物大多采用侵入性的注射给药，有研究人员通过采用另一种具有给药方便、安全性高、病人依从性高的口服给药方式进行基因药物给药，得到了不错的治疗效果，所以这一种基因药物给药方式成为研究目标。研[1]究结果显示，口服基因药物可应用于治疗全身系统性疾病和局部胃肠道疾病。[2]根据载体性质与治疗目的选择口服基因药物载体。研究人员对脂质体、壳聚糖[3][4][5][6][7]、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒和腺病毒等载体进行了大量尝试，发现不同载体之间各有优缺点。脂质体具有无毒性，无生物源性，安全性高及介导的外源基因不受大小限制等优点；但其转染效率低，且外源基因表达短暂。腺病毒载体比较稳定，能耐受纯化浓缩等操作，可获得高滴度的病毒颗粒；宿主细胞范围广，感染效率高，但由于不能整合于宿主细胞染色体中，只能短暂地表达外源基因产物，适[8]用于治疗急性疾病结肠炎。而对于慢性疾病（如肿瘤、糖尿病等）的治疗，需要长期表达外源基因。重组腺相关病毒载体能有效地感染分裂细胞和分化细胞，能长期稳定表达，无致病性，免疫原性低，适合于一些遗传疾病或肿瘤的基因治疗。逆转录病毒能将所携带的外源基因整合于宿主细胞染色体中，能够长期稳定表达外源基因，并且只转导M期细胞，从理论上看适合转导处于增殖状态的胃肠道上皮细胞。但可能因为载体中前病毒序列的选择性甲基化导致动物体[9]内转基因表达不理想。1 1.1.1口服rAAV基因药物的药效学1.1.1.1局部疾病治疗[10]During等研究结果显示，乳糖不耐受大鼠口服基因药物后，转基因能在肠上皮细胞及黏膜固有层细胞中长期表达，可矫正乳糖不耐受症，显著提高大鼠消化和吸收乳糖的能力。NMBA模型中亚硝胺类化合物NMBA（甲基苄基亚硝胺）诱导产生食道癌和胃癌，口服rAAV-FHIT基因药物后，可表达抑癌基因FHIT，肿瘤的发生与[11]发展明显受到抑制。1.1.1.2全身系统性疾病的治疗研究人员不仅在局部性疾病动物模型中进行rAAV基因药物口服给药取得[12][13][14][15−17]了很好地效果，在肝纤维化、肝癌、贫血和糖尿病等全身系统性疾病的治疗研究中同样获得了显著疗效。小鼠口服rAAV-BMP-7基因药物后，在胃肠道黏膜层检测出BMP-7的异位[12]表达，而且血清中的BMP-7浓度升高，明显改善了四氯化碳诱导的肝纤维化。肝癌皮下移植瘤小鼠口服rAAV-sTRAIL基因药物后，在对正常肝细胞无毒[13]性的基础上抑制了肿瘤的生长。STZ诱导糖尿病模型中大鼠在口服rAAV-insulin基因药物后，12小时内血糖从大约30mmol/L降至2～6mmol/L的低血糖状态。经过2～3天后，因阳性肠上皮细胞自然脱落，转基因产物胰岛素水平下降，导致血糖水平重新升高。服药4周后，转基因胰岛素表达的主要器官为肝脏，使得血糖水平又从30mmol/L[15][17]降至12mmol/L。Hsu等研究人员发现，STZ诱导的糖尿病模型中小鼠在口服rAAV基因药物后可以转导小肠内分泌细胞K-细胞，并能长期向血液中分泌胰岛素，并显著降低了STZ诱导的糖尿病小鼠的死亡率。1.1.1.3基因疫苗rAAV还可作为口服疫苗载体。针对阿尔茨海默症开发了携带AβcDNA的rAAV疫苗，口服rAAV疫苗后，β淀粉样前体蛋白转基因小鼠的肠上皮细胞可表达分泌Aβ1-21或Aβ1-43多肽，血清中抗体6个月内维持高水平，在无炎症反应的情况下显著降低了小鼠脑内β淀粉样负荷量，并且检测不到T细胞增殖2 [18]免疫反应。口服疫苗能同时诱导系统免疫和黏膜免疫，黏膜免疫尤其是局部细胞介导的免疫，在预防传染性疾病（如获得性免疫综合症）方面起着重要作用。开发编码HIV病毒env基因的rAAV-HIV疫苗，BALB/c小鼠口服rAAV-HIV[19]疫苗后，能在小肠和引流淋巴结中检测出HIVmRNA的表达。小鼠免疫2个月后，分别能在血清和粪便中检测出高浓度的IgG和IgA。小鼠口服rAAV-HIV[19]疫苗后，诱导的免疫反应显著降低了经直肠给予的HIV病毒负荷量，研究结果证明此疫苗有机会成为有效防治AIDS的口服疫苗。随着大脑抗原免疫反应例子的增多，神经元表达主要组织相容性复合体I[20]及神经系统自身免疫性疾病已被确认。研究结果表明，针对一种特殊脑蛋白NMDA受体的NR1亚单元设计rAAV载体，大鼠口服rAAV疫苗后，可5个月持续表达NR1亚单元蛋白，并诱导自身产生相应抗体，并与强大的体液免疫反应相关。在海人藻酸诱导的颞叶癫痫模型大鼠中，仅2只大鼠的脑电图表现为癫痫发作，且其中1只发生了海马区细胞损伤和凋亡，其余大鼠未发生癫痫反应；而大部分对照组大鼠发生癫痫反应，并且均出现了海马区细胞损伤和凋亡。在内皮素-1诱导的中脑动脉阻塞模型和红藻氨酸致痫模型中，口服rAAV基因疫[20]苗同样表现出极好神经保护活性与较强的抗癫痫作用。这证实了针对脑蛋白的疫苗接种策略的可行性，为治疗神经系统疾病提供了可能。1.1.2口服rAAV基因药物的药动学1.1.2.1胃肠道内的传递长期进化过程中，野生型AAV可在胃肠道生存及增殖，一定程度上能避免pH和酶的破坏。在pH降低时，病毒会暴露出原来包裹在病毒衣壳内部的衣壳蛋白VP1和VP2的N端碱性氨基酸序列，这使病毒在酸性环境中的稳定性大大[21]提高。前期rAAV在细胞内的定位研究表明，5分钟内rAAV基因药物能透过细胞膜进入细胞，至少需要30～45分钟才能进入细胞核。在空腹情况下，不到4小时药物就能从胃部进入肠道，大鼠口服rAAV基因药物后经肝门静脉在不同时间点取血，PCR检测发现给药后1小时就有rAAV存在，3小时达到高峰，并持续[15]到6小时，直至8小时才开始下降。3 1.1.2.2口服吸收途径胃肠道拥有的黏膜表面约300平方米，肠上皮中包括多种不同性质和不同功能的细胞，如内分泌细胞、吸收性肠细胞、杯状细胞和派氏结（Peyer’spatch，PPs）中的M细胞等。肠道的淋巴组织（如PPs、上皮内的淋巴细胞和固有层淋巴滤泡）可作为基因药物黏膜免疫的入口，因而口服给药是基因治疗和基因免疫颇具潜力的给药途径。基因药物通过以下途径实现转基因经胃肠道给药后在[22]体内的表达：M细胞转运；跨上皮细胞转运；直接转导肠上皮细胞；细胞旁路转运；淋巴细胞主动摄取等。1．M细胞转运在黏膜淋巴结的滤泡相关上皮（follicle-associatedepithelium，FAE）中发现一种特殊的扁平上皮细胞，不同于肠上皮细胞表面规则的微绒毛，其表面是不规则的微皱褶，故称为微皱褶细胞（Microfoldcell，Mcell）。大量实验结果表明肠道相关淋巴组织可通过M细胞摄取病毒、细菌和朊[23]蛋白等多种病原体。在肠道中肠上皮细胞与M细胞排列紧密，形成了天然的保护屏障，但两者结构上存在显著区别（图1.1）：M细胞表面糖被层较肠上皮细胞薄，仅20纳米，这有利于肠腔内容物的接触和黏附；其顶端缺乏典型刷状缘，只有形态数量不等的微绒毛，有较大的内吞区域存在于微绒毛之间。M细[24]胞基底膜向顶部穹窿状凹陷形成“口袋”样结构，缩短了物质的转运距离。图1.1肠上皮细胞与M细胞的结构示意图M：M细胞；E：肠上皮细胞；MA：巨噬细胞；L：淋巴细胞；TJ：紧密连接（Tight-junction）；AP：黏膜侧；BL：浆膜侧；与正常肠上皮细胞相比，M细胞内缺乏水解酶，降低了对外源物质的胞内[24]降解，因而经M细胞转运的物质可基本完好地释放至肠道固有层。实验证明纳米颗粒（如碳颗粒、乳胶颗粒、脂质体等），多种生物大分子（如凝集素、铁蛋白、辣根过氧化物酶、抗病毒抗体和霍乱毒素结合亚基），微生物（如鼠伤寒4 [25]沙门氏菌、霍乱弧菌）等物质都可以通过M细胞跨肠上皮转运。但目前缺乏实验证明M细胞转运途径就是rAAV载体主要的转运途径。利[26]用Caco-2细胞与人B淋巴细胞共培养这一方法可定向诱导分化为M细胞，这为rAAV载体经M细胞转运机制的研究提供了可能。2．跨上皮细胞转运黏膜表面（如肠粘膜、生殖道黏膜）是病毒进入人体的主要入口，因此大部分病毒与上皮细胞相互作用，并利用宿主细胞的信号及侵袭途径。跨细胞转运是一种特殊的细胞内吞，内吞物从细胞的一端穿透细胞屏障入胞，被选择性地转运到对面的细胞表面，然后通过胞吐作用出胞。所以[27]病毒的跨肠上皮细胞转运并不会造成细胞的感染，其靶细胞是黏膜深层细胞。有研究人员认为M细胞转运并不是摄取病原体和微粒的唯一途径，因其与肠上皮细胞相比，数量所占比例很小，跨上皮细胞转运也可能发挥一定作用。Pasquale[28]等研究了对各种上皮和内皮细胞屏障rAAV载体的跨细胞转运，认为跨胞转运过程需要受体介导，并具有载体血清型（如与AAV2相比，其他血清型能转导上皮细胞并表现出在整个组织广泛传播）与细胞特异性，但存在不同的受体种类，而且中和抗体、温度、化学抑制剂能阻断胞吞转运。在跨胞转运后，病毒载体仍能保持完整的颗粒状态及体外细胞转导能力，此途径可能与转染肠道黏膜深层固有层细胞有关。3．转导肠上皮细胞野生型AAV通过受体介导的胞吞作用感染细胞，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）和I型成纤维细胞生长因子受体（FGFRI）及αVβ5整合素分别是血清型AAV-2的主要受体与辅助受体，主要受体与辅助受体共同作用导致有效感染AAV-2。HSPG广泛存在于小肠上皮细胞及细胞基质中，为[29]rAAV-2的有效转导提供了可能。rAAV-2载体转导肠上皮细胞，3天后转基因[10,20]产物大量表达，之后有阳性肠上皮细胞自然脱落，数量迅速减少。唾液酸[30]是血清型AAV-5的主要细胞受体，血小板衍生生长因子受体（PDGFRs）是[28]其辅助受体载体。由于Caco-2细胞缺乏PDGFRs导致不能被rAAV-5有效转导，但在Caco-2细胞能稳定表达PDGFRs后，rAAV-5转导Caco-2细胞的效率[28]大大提高。4．树突状细胞（DC）直接摄取病原体表达入侵基因侵袭肠道黏膜被认为主要是通过派氏结的M细胞进行，但入侵基因缺陷的鼠伤寒沙门氏菌口服给药后仍能到达脾脏，说明存在一条与M细胞不相关的细菌侵袭路线。Maria[31]Rescigno等研究发现了由树突状细胞（DCs）介导的黏膜组织摄取细菌的新机5 制，即DCs可以打开上皮细胞间的紧密连接，树突部分可从上皮细胞间隙伸入肠腔直接摄取病原体，而上皮屏障完整性因DCs表达紧密连接蛋白被保留。研[32]究结果表明朊病毒就是通过该途径被肠淋巴系统摄入，但没有研究证实rAAV是否从上皮细胞间隙被DC直接摄取。5．细胞旁路途径上皮屏障的重要组成部分是上皮细胞间的连接，如克罗恩病就是肠上皮通透性受损所致，胃肠道上皮细胞间的紧密连接呈现动态行为。2+磷酸酶C介导的调节作用、细胞外Ca的螯合作用、肌动蛋白和肌球蛋白环的收缩等都能使紧密连接暂时松弛，上皮通透性增高，肠组织暴露于肠腔抗原，促炎性细胞因子的释放影响上皮细胞顶端连接复合体的结构功能，此时微粒与[33]病原体会乘虚而入。口服药剂中辅料（如金属离子螯合剂、吸收促进剂等）的使用有可能会改变上皮细胞间的紧密连接状态，从而影响口服rAAV基因药物后的吸收途径和效率。1.1.2.3组织及细胞分布口服rAAV基因药物后，仅在胃、十二指肠和空肠上部检测出载体基因组。胃肠道上皮细胞转基因表达十分短暂，能够转基因长期表达的肠道细胞是固有[15,20]层中髓原性细胞、树突状细胞及弥散神经内分泌系统（DNES）细胞。在口[15]服rAAV基因药物后，它可以通过门静脉分布于肝脏。大鼠口服rAAV基因药物1小时后，在门静脉中检测出病毒载体基因组，其病毒滴度在3小时达到最大值，但病毒载体基因组在尾静脉血中非常少量。这说明载体基因组经血管高度集中的肠道吸收后，可通过门静脉快速传递至肝脏并有效表达。1.1.2.4基因转导[34]对于野生型AAV感染细胞的过程，我们已了解地比较明白，即AAV首先黏附于细胞膜表面并与相应的受体识别并结合，然后在受体介导状态下通过内吞作用由网格蛋白包被孔进入细胞内部，在胞质内由内体转运抵达细胞核，核内体的处理对于病毒的转导效率有着关键作用。入核前/或后脱壳，DNA正负链聚合形成二聚体，或以自身DNA为模板复制形成二聚体，然后定点整合至第19号染色体中，并进行病毒基因的表达。6 [34]图1.2野生型AAV感染细胞的过程rAAV载体基因组缺失了Cap基因和Rep基因，其胞内基因转导过程与野生型AAV存在一定的区别。rAAV载体基因组进入细胞核后主要以游离形式存在，所以rAAV在非分裂相细胞中趋向于稳定转导。[35]基因药物临床研究效果不好的关键问题是不能高效地转导靶细胞，同样制约口服rAAV基因药物治疗效果的主要问题在于是否能够高效转导靶细胞并表达治疗水平的转基因产物。研究人员通过偶联靶向、受体靶向和转录靶向等多种途径实现口服rAAV基[36]因药物的靶向性转导。改变单个氨基酸就可以影响AAV的病毒滴度、受体结[37]合性、细胞亲嗜性和组织靶向性。通过改进rAAV载体蛋白衣壳的定点偶联靶[38][39]向配基技术，为细胞水平的靶向传递提供了技术支持。Tang等对人小肠内分泌细胞进行rAAV-insulin基因药物转导后，发现转基因产物胰岛素的表达动态行为与内源性胰高血糖素样多肽-1（GLP-1肠内分泌细胞源性肠促胰素）一致，且符合内分泌分布特征，这有望成为胰岛素依赖型糖尿病的细胞治疗方法。但肠上皮细胞中内分泌细胞的比例仅为1%，研究的关键点集中于如何实现转基因[40]的靶向转导。Nian等通过采用高血糖素原启动子实现了转基因在肠分泌细胞中的特异性表达，为解决肠分泌细胞的靶向转录提供了方法。1.1.3口服rAAV基因药物的生物药剂学胃肠道内环境因素（如pH、食物、消化酶、黏液、菌群、细胞间连接等）均能够影响口服rAAV基因药物的体内稳定性和表达效率。我们可以从口服基因药物采用的剂型、使用的辅料及给药方法等方面进行改进，以提高rAAV基因药物的体内稳定性与表达效率。7 1.1.3.1胃肠道的降解作用在肠道碱性pH条件下rAAV基因药物非常稳定，但胃中较低的pH条件会[41]降低其稳定性。在pH2的条件下，30分钟内rAAV基因药物活性会下降约50%；但在pH3的条件下，药物活性30分钟内没有变化。在pH4～7.4内非常稳定，感染活力可保持4小时不变。使用胃酸中和剂可避免rAAV基因药物受胃内低pH条件的破坏；蛋白酶抑制剂（aprotinin）则可帮助药物抵抗肠道胰酶和胰凝乳蛋白酶的降解作用。在药剂处方中加入NaHCO3和蛋白酶抑制剂等辅料，可以提高rAAV基因药物的口服转导效率。1.1.3.2食物残留量口服给药时胃内残留食物量的多少，会对rAAV基因药物的药效产生显著影响。大鼠禁食12小时后仍有半数动物的胃内未能充分排空，此时口服rAAV-furin[15]的有效率仅为50%，食物排空时间的延长（如禁食24小时后给药）可明显提高口服rAAV基因药物的有效率。1.1.3.3药物凝聚作用影响肠细胞吸收的关键因素是物质的颗粒大小。rAAV基因药物凝聚后微粒直径变大，转导效率下降。虽然直径大于10微米的颗粒也能被M细胞吞噬，但纳米级粒子的吸收效率更高。在处方中加入β-环糊精、表面活性剂和糖类等，可降低其凝聚作用，提高药物的稳定性。1.1.3.4细胞黏附作用影响药物吸收的天然屏障是肠道表面的黏液组分，为促进rAAV基因药物的黏附，可以通过采用黏液溶解剂来减少小肠黏液层的黏度及厚度。利用黏液溶[17]解剂十二烷基麦芽糖苷预处理小肠后，口服转导效率提高了7倍。有大量的负电荷存在于rAAV基因药物的表面，细胞表面糖链的负电荷会与其发生排斥作用，不利于病毒载体与细胞黏附，通过阳离子聚合物处理后，有利于药物黏附于肠上皮细胞。1.1.3.5细胞转运表面活性剂在提高rAAV的稳定性同时，还可以破坏细胞紧密连接以促进细8 胞间转运。某些非肠道菌在短时间内（约3小时）可提高肠道M细胞数量和转运能力，进而调节由其介导的跨肠淋巴结滤泡相关上皮，这说明细菌、肠道上[42]皮、免疫系统之间的动态平衡有助于调节肠道的主要功能，为通过制剂学手段增强rAAV的选择性转运提供了新思路。1.2本课题的来源与研究内容1.2.1本课题的来源腺相关病毒（AAV）是无包膜的单链DNA病毒，属于细小病毒家族。目前，发现的多种血清型逐步用于重组腺相关病毒（rAAV）基因药物的研究。rAAV病毒基因药物因具有稳定性高、致病性低、免疫原性低、宿主范围广（能有效地感染分裂细胞和分化细胞）、长期稳定表达等优点，日益受到业界重视。特别[43,44]是rAAV基因药物成功治愈Leber’s先天性黑内障的临床研究结果，使得rAAV基因药物的安全性和有效性得到确认。在临床研究中基因药物的给药大多采用侵入性的注射途径，有口服给药具有给药方便、安全性高、病人顺应性强等诸多优点，所以基因药物口服给药一直是研究人员的目标。基因药物口服后经胃肠道吸收的过程非常复杂，经胃肠道的吸收和表达由3个连续过程组成：①在胃肠道稳定转运并释放进入消化液；②跨过胃肠道屏障转染靶细胞；③表达转基因。口服rAAV基因药物经胃肠道的摄取、传递和表达机制的认识不足，造成各实验室的实验结果的不一致，需要加强有关基础理论研究。在总结前人文献基础上，本课题提出了rAAV基因药物口服后主要通过跨M细胞转运方式摄入，然后转运至肠道固有层靶细胞,并长期表达转基因产物的假设。1.2.2本课题的研究内容本课题通过构建M细胞模型、小鼠肠袢模型和小鼠口服灌胃给药这3种方法探讨了口服rAAV基因药物的转运、吸收和转基因的表达。1.2.2.1M细胞模型研究rAAV基因药物的转运利用完全分化的人结肠腺癌细胞Caco-2细胞与人RajiB淋巴细胞进行共培9 养，诱导Caco-2细胞转变为形态及功能特征与M细胞极其类似的M样细胞以建立M细胞Transwell模型。以Caco-2细胞模型为对照，将rAAV基因药物加入单细胞层的顶膜侧孵育，PCR法测定rAAV基因药物在侧底层接受相的经时过程。1.2.2.2小鼠肠袢模型研究rAAV基因药物的吸收及表达建立小鼠肠袢模型，在不影响血流供应及神经功能的前提下分离出含有派氏结的肠段，将肠段两端结扎，肠袢内注入rAAV基因药物，给药后2天处死小鼠，取肠袢组织检测是否有转基因表达产物。1.2.2.3rAAV基因药物在小鼠体内的口服吸收及表达对已禁食24小时BALB/c小鼠灌胃给予rAAV基因药物，给药7天后处死小鼠，取肠组织检测rAAV病毒载体的分布及转基因表达产物，研究口服rAAV基因药物在小鼠体内的吸收及表达。10 第2章M细胞模型研究rAAV基因药物的转运呼吸道和消化道的黏膜表面经常受到外来抗原物质（如细菌、病毒及其它大分子物质）的侵袭，该处黏膜内的淋巴组织与其表面上皮共同形成了机体的第一道防线。消化道黏膜内的肠道相关淋巴组织（gut-associatedlymphoidtissues，GALT）中含有丰富的弥散淋巴组织、集合淋巴小结及孤立淋巴小结。集合淋巴小结上方的黏膜上皮与肠道黏膜免疫应答的诱发密切相关。[45]1974年，Owen在黏膜淋巴结的滤泡相关上皮（follicle-associatedepithelium，FAE）中发现一种特殊的扁平上皮细胞，其表面是不规则的微皱褶，不同于肠上皮细胞表面规则的微绒毛，称作微皱褶细胞（Microfoldcell，Mcell）。M细胞能够选择性地黏附和摄取外来抗原物质，并以小囊泡的形式转运至上皮内淋巴细胞以及中心淋巴组织从而诱导黏膜免疫应答或造成机体感染。因此，随着生物大分子药物及疫苗在胃肠道传递研究的日益深入，以M细胞为主要靶点的口服吸收研究成为重要课题。利用完全分化的人结肠腺癌Caco-2细胞（humancolonadenocarcinomacell）与人RajiB淋巴细胞进行共培养，诱导Caco-2细胞转变为形态及功能特征与M细胞极其类似的M样细胞以建立M细胞模型。以Caco-2细胞模型为对照，将rAAV基因药物加入单细胞层的顶膜侧孵育，PCR法测定rAAV基因药物在侧底层接受相的经时过程。2.1实验材料、试剂与仪器2.1.1实验材料人结肠腺癌细胞Caco-2细胞：购自中科院上海生化细胞所；人RajiB淋巴细胞：购自中科院上海生化细胞所；rAAV病毒载体（rAAV2-EGFP）：由本实验室制备保存；细胞培养板：购自美国CorningCostar公司；2Transwell培养板（聚碳酯膜，孔径3μm，有效膜面积0.33cm）：购自美国CorningCostar公司。11 2.1.2实验试剂Anti-Galectin-9AbcamHRP标记二抗AbcamDMEM粉剂Gibco胎牛血清（FBS）Gibco非必需氨基酸（nonessentialaminoacids，NEAA）Gibco胰蛋白酶（Trypsin，1:250）Amresco青霉素、链霉素华北制药股份有限公司谷氨酰胺Amresco6×loadingbufferTaKaRa乙二胺四乙酸二钠（AR）国药集团化学试剂有限公司乙二胺四乙酸（AR）国药集团化学试剂有限公司其余常规化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。本章用到的根据目的基因EGFP设计的引物见表2.1，由Invitrogen（广州）合成。表2.1本章用到的引物名称碱基数序列EGFP-F205'CGACGTAAACGGCCACAAGT3'EGFP-R205'GACCATGTGATCGCGCTTCT3'2.1.3实验仪器细胞电阻仪（Millicell-ERS）Millipore电子天平SartoriuspH计Sartorius电热恒温水浴锅上海森信超低温冰箱Thermo荧光倒置显微镜NikonCO2培养箱Thermo12 高温灭菌锅上海申安生物安全柜Thermo高速离心机Thermo微量紫外Thermo倒置显微镜Nikon超净工作台苏州净化琼脂糖水平电泳槽北京六一仪器厂电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司PCR仪Biorad2.1.4溶液配制（1）磷酸盐缓冲液（PBS）配制：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、十二水合磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.2g，加入800mL去离子水中，调整pH值至7.2-7.4，定容至1L，分装，高压灭菌，4°C备用。（2）胰酶配制：称取胰蛋白酶0.25g，EDTA20mg，加入100mL磷酸盐缓冲液中，充分溶解后，用0.22μm滤膜过滤除菌，-20°C冻存备用。（3）青链霉素储备液配制：青霉素80万单位和链霉素100万单位，分别加入40mL和50mL生理盐水，充分溶解后按1：1混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，1.0mL分装，-20°C冻存。（4）谷氨酰氨储备液的配制：称取谷氨酰胺2.92g，加入磷酸盐缓冲液100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，1.0mL分装，-20°C冻存备用。（5）DMEM培养基配制：将DMEM培养基1包（1L装）、NaHCO33.7g倒入烧杯中，加入约800mL去离子水，调节pH值至7.2-7.4，定容至1L，用双层0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4°C储存。用前加入20%FBS、1%谷氨酰胺、100U/mL青链霉素双抗液、1%非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠成为Caco-2细胞完全培养液。（6）4%多聚甲醛配制：称取多聚甲醛40g，加入磷酸盐缓冲液800mL，混合后加热至60°C，搅拌并滴加1MNaOH调pH至7.4，冷却后定容值1L。（7）1%牛血清白蛋白（BSA）溶液配制：称取牛血清白蛋白1g，加入磷酸盐缓冲液100mL，充分溶解后，4°C保存备用。13 （8）SDS-PAGE试剂配制A分离胶缓冲液4×Tris·Cl/SDS：在300mL去离子水中溶解91gTrisbase（1.5mol/L），用1mol/LHCl调pH至8.8，补加去离子水至整体体积为500mL。用0.45μm滤膜过滤，再加入2gSDS[0.4%(m/v)]，于4°C可保存1个月。B浓缩胶缓冲液2×Tris·Cl/SDS：在80mL去离子水中溶解6.05gTrisbase（0.25mol/L），用1mol/LHCl调pH至6.8，补加H2O至整体体积200mL。用0.45μm滤膜过滤，再加入0.4gSDS[0.2%(m/v)]，于4°C可保存1个月。C凝胶贮存液：30%丙烯酰胺/0.8%亚甲基双丙烯胺溶液。D2×SDS上样缓冲液4×Tris·Cl/SDS，pH6.8（0.1mol/L），25mL；甘油[20%(m/v)]，20mL；SDS[4%(m/v)]，4g；2-ME（2-巯基乙醇）或3.1gDTT（二硫苏糖醇），2mL；溴酚蓝[0.001%(m/v)]，1mg。加去离子水至100mL并混匀，等量分装成1mL于-80°C储存。E5×SDS电泳缓冲液Trisbase（0.125mol/L），15.1g；甘氨酸（0.96mol/L），72.0g；SDS[0.5%(m/v)]，5.0g。加去离子水至1000mL，使用前稀释至1×SDS电泳缓冲液。（9）WesternBlotting试剂配制A1mol/LTris储液（Tris·Clbuffer，pH7.5）称取121g的Trisbase溶解于约900mL去离子水中，加一定量的浓盐酸调制pH至7.5，定容至1L。BTTBS(Tween20/TBS)Tris·Cl，pH7.5，100mmol/L；0.9%（m/V）NaCl；Tween20，0.1%（V/V）；4°C保存，配制后最好一周内使用。C电转移缓冲液称取Trisbase，3g；甘氨酸，14.4g；甲醇，200mL。先将Tris-base和甘氨14 酸溶于800mL去离子水中，然后再加入甲醇，之后pH大约为8.63。如果使用PVDF滤膜，可以使用150mL甲醇。D封闭液5%脱脂奶粉，加入到TTBS中，现配现用。2.2实验方法2.2.1细胞培养2.2.1.1细胞复苏（1）将DMEM培养基及血清在水浴锅预热至37°C；（2）取本实验室冻存于液氮罐中的Caco-2细胞，37°C水浴，快速解冻；（3）加入1mL提前预热好的无血清细胞培养液混匀，1200rpm室温离心5分钟；（4）弃去上清，再加入含20%FBS的DMEM培养基，轻轻吹打混匀重悬；（5）吸取细胞悬液至细胞培养瓶中，补足5mL细胞完全培养液（含20%FBS、1%谷氨酰胺、100U/mL青链霉素双抗液、1%非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠），37°C、5%CO2培养箱内培养。2.2.1.2细胞传代（1）观察细胞，当细胞汇合度达到80%以上时，进行细胞传代；（2）弃去原培养液，加入适量的PBS溶液，清洗细胞后，弃去溶液；（3）加入500μL含0.02%EDTA的0.25%胰酶，37°C消化细胞；（4）显微镜下观察细胞收缩变圆时，吸出胰酶，加入适量细胞完全培养液终止消化；（5）轻轻吹打细胞，使细胞完全悬浮成单细胞悬液，混合均匀；（6）1200rpm室温离心5分钟；（7）弃上清，加入1mL细胞完全培养液，轻轻吹打细胞，使细胞完全悬浮成单细胞悬液，混合均匀；（8）血球计数板计数，按照细胞密度进行传代分装，补足5mL细胞完全培养液（含20%FBS、1%谷氨酰胺、100U/mL青链霉素双抗液、1%非必需氨15 基酸、1mM丙酮酸钠），并置于37°C、5%CO2培养箱内继续培养。2.2.1.3细胞计数（1）将血球计数板及盖玻片冲洗后，擦拭干净，并将盖玻片盖在计数板之上；（2）吸取少许细胞悬液，滴加在盖玻片边缘，使其充满计数板与盖玻片之间，静置1分钟（注意不要出现气泡，也不要让细胞悬液流入旁边凹槽中）；（3）统计4个大格中的细胞数，然后计算细胞悬液的浓度。2.2.1.4细胞冻存（1）观察细胞，当细胞汇合度达到80%以上时，进行细胞冻存；（2）弃去原培养液，加入适量的PBS溶液，清洗细胞后，弃去溶液；（3）加入500μL含0.02%EDTA的0.25%胰酶，37°C消化细胞；（4）显微镜下观察细胞收缩变圆时，吸出胰酶，加入适量细胞完全培养液以终止消化；（5）轻轻吹打细胞，使细胞完全悬浮成单细胞悬液，混合均匀；（6）1200rpm室温离心5分钟；（7）弃上清，加入预先配制好的冻存保护液（DMEM∶FBS∶DMSO=7:2:1），轻轻吹打重悬细胞，混合均匀，迅速分装至冻存管中；（8）立即将含有细胞的冻存管置于4°C冰箱中10分钟，然后置于-20°C冰箱中30分钟，再放到-80°C中过夜，最后转移到液氮中长期保存。2.2.2M细胞模型建立2.2.2.1原理在肠上皮组织中M细胞所占比例很小，并且各物种间存在这较大的种属差[46−48]异，所得到的研究结果不尽相同，因此M细胞体外模型的建立成为迫切需要。[26,49]Kerneis等研究人员首次利用小鼠派氏淋巴结细胞（PPL）与Caco-2细胞共培养，诱导分化出形态及功能特征与M细胞极其类似的M样细胞（M-like[47]cell）。Gullberg等采用人RajiB细胞代替小鼠PPL与Caco-2共培养，也成功诱导Caco-2细胞分化成为M样细胞，说明B细胞分泌的相关细胞因子和趋化因16 子是诱导Caco-2细胞分化的主要因素。利用人RajiB细胞代替小鼠PPL，模型建立的同源性更高，操作更简便。本实验利用人RajiB细胞与Caco-2细胞共培养，诱导转变为M样细胞（M-likecell）以建立M细胞体外模型。2.2.2.2方法Caco-2细胞汇合度达到80%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，用细胞完全培养液（含20%FBS、1%谷氨酰胺、100U/mL青链霉素双抗液、1%非必需4氨基酸、1mM丙酮酸钠）将细胞悬浮，血球计数板计数后按5×10个/孔接种于2Transwell板（孔径3μm，膜面积0.33cm）上，Transwell上室加0.1mL细胞悬5液（细胞密度为5×10个/mL），Transwell下室加入0.6mLDMEM完全培养基，于37°C、相对湿度90%、CO2浓度5%的培养箱中培养。隔日换培养液1次，1周后每天换培养液一次，并在接种后第6天开始测定细胞单层的跨膜电阻值（Transepithelialelectricalresistance，TEER）。培养14天待Caco-2细胞完全分化后，于BL侧加入人RajiB细胞进行共培养3天。（如图2.1所示）。以Caco-2细胞模型（BL侧不加入人RajiB细胞）作为对照。图2.1M细胞模型的建立2.2.3细胞形态学观察将生长于微孔滤膜上的细胞单层固定，经过脱水、渗透、包埋、超薄切片纵切制备铜网、醋酸铀-枸橼酸铅双染色等一系列处理后，于透射电子显微镜下观察其特征的微绒毛及细胞间紧密连接。2.2.4细胞单层的完整性应用上述Caco-2细胞培养方法培养细胞，按照细胞培养步骤逐步获得Caco-2细胞单层。用Millicell-ERS电阻仪测定跨膜电阻前，用75%酒精消毒电极15分钟，取出后室温放置1分钟，让电极自然风燥，然后置入平衡缓液中平17 衡15分钟。然后将电极两端依次插入24孔Transwell培养板各孔的上下室中检测电阻值，记录结果（Rt），同时测定空白孔电阻值（R0）。根据公式2.1计算跨膜上皮细胞电阻（transepithelialelectricalresistance，TEER）观察细胞单层紧密连接的动态形成过程。2TEER=(Rt－R0)×A(·cm)（公式2.1）其中R1（）为细胞组测量值，R0（）为空白组（未接种细胞）测量值，2A（cm）为有效膜面积。2评价细胞融合的指标是跨膜电阻值＞200·cm，表明细胞间紧密连接形成。2.2.5细胞单层的极性2.2.5.1原理Caco-2细胞能够部分分泌与小肠微绒毛相同的酶类和转运载体，细胞单层两侧这类活性物质的分泌是不均衡的，这种差别造成了两侧极性的差别。碱性磷酸酶是肠上皮细胞刷状缘的标志酶，是分析肠上皮细胞分化程度及反映其功能状态的酶。检测Caco-2细胞在不同生长时间内碱性磷酸酶的活性变化，可以确定Caco-2细胞单层极性。本实验通过比较AP及BL侧培养液ALP酶活性的差异，可清楚地了解细胞极性的形成，且极性的监测不会影响细胞单层的正常使用。而M细胞顶层膜表面绒毛退化，缺乏由紧密排列的微绒毛形成的典型刷状缘，碱性磷酸酶活性下降。2.2.5.2方法采用ALP试剂盒检测Caco-2细胞单层顶端（apicalside，AP侧，又称黏膜侧或肠腔侧）及底侧（basolateralside，BL侧，又称浆膜侧或肠内壁侧）的ALP活性，分别从Transwell小室的AP侧和BL侧吸取培养液按照试剂盒检测流程处理，在405nm处检测反应产物，计算出相应的ALP活性，观察单层形成过程中两侧的极性变化。1．检测原理18 在含有对硝基苯磷酸的碳酸盐缓冲液（pH9.8）中，对硝基苯磷酸在样品中碱性磷酸酶的作用下，分解为对硝基苯酚和磷酸。生成的对硝基苯酚为碱性，呈黄色。根据测量其405nm的吸光值，计算出样品中碱性磷酸酶的活性。2．试剂配制a.工作液：取试剂盒提供的底物溶解液（BufferSolution）5mL溶解一片底物（SubstrateTablet）。此工作液能在2-10°C环境下避光保存2周。b.系列稀释标准样品：取双蒸水将标准溶液（0.5mMp-NitrophenolSolution，对硝基苯酚）梯度稀释成浓度为0.5，0.25，0.125，0.0625mM的标准样品。3．操作过程（见下表）表2.2碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒操作步骤待测样品组空白对照组标准样品组工作液100μL100μL100μL样品待测样20μL双蒸水20μL标准样品20μL微孔板震荡器上充分振荡1分钟后，37°C孵育15分钟。终止液80μL80μL80μL微孔板振荡器上充分振荡1分钟后，用酶标仪测定样品在A405nm处的吸收值。注：a.每个样品加3个复孔，作为平行对照；b.操作过程中避免阳光直接照射。4．标准曲线的绘制根据标准样品组所测定的OD值，以对硝基苯酚浓度为X轴、OD值为Y轴绘制出标准曲线。5．待测样品的测定按照ALP检测试剂盒的测定范围，以一定比例稀释待测样品，使其OD值落在标准曲线范围内。根据待测样品所测定的OD值，对照标准曲线及稀释比例计算得出待测样品中ALP活性。活性单位的定义：在pH9.8，37°C情况下，1分钟内生成1nmol对硝基苯酚所需的酶的活性为1个活力单位（U）。ALP活性（U/μL）=Ca15（公式2.2）C：由标准曲线得到的OD值（A实验值－A空白值），计算对硝基苯酚浓度19 （mmol/L=nmol/μL）；15：反应时间（分钟）；a：样品的稀释倍数。2.2.6M细胞标志物半乳糖凝集素-9（Galectin-9）2.2.6.1原理在免疫组织（如骨髓，脾，胸腺，淋巴结）中Galectin-9高表达，Pielage等[50]证实了Galectin-9在M样细胞AP侧表面表达上调，可作为此细胞的表面标志物，且认为Galectin-9的表达依赖于RajiB细胞分泌的可溶性因子的存在，可用于派氏结的分子靶向，为药物和疫苗的研究带来了新的机遇。2.2.6.2Galectin-9的细胞免疫化学（1）取生长于微孔滤膜上的细胞单层，PBS浸洗3次，每次1分钟。（2）4%多聚甲醛固定15分钟。（3）PBS浸洗3次，每次1分钟。（4）0.25%TritonX-100透化处理10分钟。（5）PBS浸洗3次，每次1分钟。（6）1%牛血清白蛋白（BSA）4°C封闭过夜。（7）PBS浸洗3次，每次1分钟。（8）滴加一抗（anti-Galectin-9，用1%BSA1:500稀释），室温孵育2小时，进行免疫反应。阴性对照用1%BSA。（9）PBST浸洗6次，每次1分钟。（10）滴加FITC标记的二抗（FITC标记二抗，用1%BSA1:500稀释），室温避光孵育1小时进行免疫反应。（11）PBST浸洗6次，每次1分钟。（12）滴加DAPI染细胞核，室温避光孵育2分钟。（13）PBS浸洗3次，每次1分钟。（14）滴加抗荧光猝灭剂，封片。20 2.2.6.3Galectin-9的WesternBlot鉴定1．原理WesternBlot法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体（antibody）结合的待检蛋白质（抗原，antigen），将PAGE胶上的蛋白条带转移到固相载体上，如硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜或聚偏二氟乙烯（polyvinylidenedifluoride)，PVDF）膜，此过程称为转印（blotting），固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转印后，将NC膜或PVDF膜与第一抗体一起孵育，使第一抗体与待检蛋白结合，再用酶标第二抗体孵育膜，使第二抗体与第一抗体结合反应。最后用酶的显色底物或发光底物显示靶蛋白条带。2．样品制备（1）取出Transwell小室，用移液器吸走细胞培养液，并用吸水纸吸干培养液；（2）每个Transwell小室加300μL4°C预冷的PBS（pH7.2-7.4），平放轻轻晃动1分钟洗涤细胞，然后弃去洗液。重复操作两次以洗去培养液，将PBS弃净后置于冰上；（3）按1mL裂解液加10μLPMSF（100mM），摇匀置于冰上（PMSF需摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）；（4）每个Transwell小室加100μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分钟，要经常来回摇动使细胞充分裂解；（5）裂解后，用干净的细胞刮刀迅速刮下细胞（动作要快），然后将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中（尽量在冰上进行整个操作）；（6）在4°C下以12000rpm离心5分钟（提前预冷离心机）；（7）将离心后的上清分装转移倒0.5mL的离心管中放于-20°C保存。3．SDS-PAGE（1）准备玻璃板，依次用水、10%SDS和水冲洗干净，干燥，与垫片一起组装成电泳装置的玻璃夹板，并固定在灌胶支架上；（2）配制12%的分离胶，加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌均匀；将分离胶迅速注入两玻璃平板夹层中，流出浓缩胶所需空间；（3）加入2mL去离子水覆盖，让凝胶在室温聚合30~60分钟。待分离胶聚合完成后，倒出覆盖层水，为除去未聚合的丙烯酰胺，用去离子水冲洗胶的21 顶部数次，用滤纸吸去残存液体；（4）配制5%的浓缩胶，小心迅速把浓缩胶沿夹层中一条垫片的边缘加入注入分离胶上层，至凝胶距短玻璃板顶端约1cm处；（5）立刻插入干净的梳子，避免产生气泡，再加入浓缩胶溶液充盈空隙。让浓缩胶室温聚合30~45分钟；（6）用2×SDS上样缓冲液分别溶解细胞蛋白样品，于100°C变性8~10分钟；（7）待浓缩胶聚合完全后，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子，以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，并以此缓冲液充满；（7）将凝胶板放入电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入适量的1×SDS电泳缓冲液；（8）将凝胶板放入下槽中，并向上槽加入适量电泳缓冲液至刚好覆盖凝胶的加样孔。将变性后的样品及预染的蛋白质Marker依次加入到加样孔中，使其在孔的底部形成一薄层；（9）再往下槽中加入适量的1×SDS电泳缓冲液，使上槽的铂金电极完全淹没。连接电源，先在10mA恒流下由负极向正极电泳至溴酚蓝燃料从浓缩胶进入分离胶，再将电流调至15mA继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，卸下凝胶。4．WesternBlot分析（1）SDS-PAGE完成后，去除浓缩胶，用去离子水清洗分离胶以出去SDS，然后用适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30分钟；（2）利用预染蛋白Marker中的条带和目的蛋白大小将含有目的蛋白的聚丙烯酰胺凝胶切割，将胶泡至电转缓冲液中，然后将海绵、滤纸胶和PVDF膜分别铺在转移板上形成三层“夹心结构”（注意滤纸大小要小于PVDF膜），在冰浴中，连接电源，220mA恒流电转1.5小时；（3）转完后取出转印膜，并用笔在膜的正面做上记号；（4）将膜在TBST中漂洗一次，然后浸泡于blockingbuffer中室温孵育30分钟，倾去液体，将膜在TBST中漂洗一下；（5）用封闭液按照1:1000的比例稀释一抗（anti-Galectin-9）后，将膜置于稀释后的一抗中室温孵育2~3小时，或4°C孵育过夜；（6）将膜取出用TBST振荡漂洗5分钟，如此重复漂洗三次，浸入HRP标22 记的二抗溶液（二抗经封闭液按照1:1000的比例稀释）中室温孵育2小时；（7）再次将膜取出用TBST振荡漂洗5分钟，如此重复漂洗三次，吸去膜上多余水分，将膜于ECL反应液中反应1分钟，用滤纸吸去膜上多余液体，将样品膜置于凝胶成像系统中显影、定影。2.2.7rAAV基因药物跨M细胞转运以Caco-2细胞模型为对照，测定rAAV基因药物跨M细胞转运。将rAAV基因药物加入M细胞单细胞层的顶端（AP侧）孵育，采用PCR法测定rAAV基因药物在侧底层（BL侧）接受相的经时过程。2.2.7.1rAAV2-EGFP病毒载体的最低检测量109以10倍梯度稀释的rAAV2-EGFP病毒（即滴度为2×10vg/mL、2×10vg/mL、8765432×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL的rAAV2-EGFP）为模板，找出rAAV2-EGFP在实验过程中的最低检测量。按照下列组分配制PCR反应体系，设置阴性对照（模板加去离子水）及阳性对照（模板为EGFP质粒）。PCR反应体系：dNTP（2.5mM）1.6μL10×Buffer2.0μLTaq酶（5U/μL）0.3μL上游引物（EGFP-F）0.8μL下游引物（EGFP-R）0.8μLDNA模板1.0μL去离子水13.5μL总体积20μLPCR反应条件如下：95°C10min1个循环95°C15s61°C20s35个循环72°C30s4°C∝23 2.2.7.2rAAV2-EGFP跨M细胞转运操作步骤如下：吸弃培养液，在AP侧和BL侧均加入1mL预热至37°C的PBS溶液；吸弃，再加入预热的PBS溶液，37°C，5%CO2条件下培养20分钟；9吸弃，在AP侧加0.1mLrAAV2-EGFP（2×10vg/ml），BL侧加0.6mLPBS溶液，在37°C，5％CO2条件下培养，于1、2、3、4小时吸取BL侧（接受相）的转运液200μL，每次补足相应的体积，采用PCR法检测BL侧是否存在rAAV2-EGFP。2.2.8统计学分析实验中所有数据采用SPSS17.0统计学软件进行处理，计量数据以均数±标准差（x±SD）表示，多组数据间两两均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，有统计学意义。2.3实验结果与分析2.3.1细胞形态学观察和细胞单层形成2.3.1.1光学显微镜在光学倒置显微镜下观察，Caco-2细胞生长至第3，4天时达到融合，细胞排列成铺路石状（见图2.2a），生长到10天后边界清晰、细胞致密均匀，可清楚地看见细胞之间的接触（见图2.2b），表明Caco-2细胞生长到一定周期具有形成紧密的细胞单层的特性。图2.2Caco-2细胞形态学观察（100×）（a）生长至第3天的Caco-2细胞；（b）生长至第10天的Caco-2细胞24 2.3.1.2透射电镜透射电镜结果（图2.3）显示，细胞生长至14天时，整齐致密的微绒毛形成了肠上皮细胞的典型刷状缘，细胞之间的紧密连接出现在腔侧，且沿着胞间通道延伸。紧密连接的形成、微绒毛的出现形成了类似小肠上皮细胞面向肠腔的黏膜侧（AP侧），另一端分化后类似小肠上皮面向肠壁的基底膜侧（BL侧）这些均证明了细胞的分化。图2.3生长于Transwell上的Caco-2细胞单层亚显微结构特征（a）Caco-2细胞单层腔侧的微绒毛（15000×）；（b）细胞之间的紧密连接（箭头所指，10000×）2.3.2Caco-2细胞单层的完整性Caco-2细胞单层的紧密性随培养时间而逐渐增高，第14天2TEER≥200·cm，表明形成了完整与紧密的细胞单层（见图2.4）。图2.4Caco-2细胞单层TEER值经时变化图（x±s，n=12）25 2.3.3Caco-2细胞单层的极性碱性磷酸酶是小肠上皮细胞刷状缘的标志性酶，Caco-2细胞分化后，可根据测定刷状缘上此酶的活性对其极性的形成进行判断。2标准曲线见图2.5，标准曲线方程为y=0.963x+0.005，R=0.998。图2.5对硝基苯酚标准曲线AP/BL比值随培养时间逐渐上升，证明碱性磷酸酶的分布非常不对称，大部分集中于刷状缘（AP侧），细胞生长出现了明显的极化现象（见表2.2）。表2.2Caco-2细胞单层生长至2，8，14天时，AP和BL侧碱性磷酸酶的差异（x±s，n=12）ALPActivity(U/μL)2天8天14天AP侧0.030±0.0010.038±0.0020.054±0.007BL侧0.031±0.0020.026±0.0010.014±0.001AP/BL0.961.473.80Transwell上的Caco-2细胞单层生长至第8、14天时膜两侧碱性磷酸酶的活性具有极显著性差异（P<0.001），且第8、14天时AP侧的碱性磷酸酶的活性具有极显著性差异（P<0.001），说明细胞极化更趋显著（见图2.6）。26 图2.6Caco-2细胞单层AP及BL侧ALP活性检测（x±s，n=6）Caco-2细胞在Transwell上培养14天后，细胞间形成紧密连接，跨膜电阻2（TEER）大于200·cm；顶层膜表面有整齐微绒毛形成的刷状缘；肠腔侧（AP侧）碱性磷酸酶活性显著高于浆膜侧（BL侧）酶活性，表明细胞单层出现明显的极性分化。在本实验条件下构建的Caco-2细胞模型在形态上与肠上皮细胞相似，可加入人RajiB细胞进行共培养诱导分化成M样细胞。2.3.4M细胞模型特性的表征2.3.4.1细胞的亚显微结构Caco-2细胞单层的微绒毛致密均匀、长度均一，形成典型的刷状缘（见图2.7a）；加入人RajiB细胞共培养，诱导分化形成M细胞，其顶层膜表面绒毛退化，只有形态、数量不等的微绒毛，缺乏肠上皮细胞由紧密排列的微绒毛形成的典型刷状缘（见图2.7b）。27 图2.7Caco-2细胞和M细胞单层的亚显微结构（a）Caco-2细胞单层；（b）M细胞单层2.3.4.2碱性磷酸酶（ALP）活性图2.8结果表明，与Caco-2细胞模型相比，加入人RajiB细胞共培养诱导转变为M细胞后，膜两侧碱性磷酸酶的活性仍具有显著性差异（P<0.01），且AP侧的碱性磷酸酶活性下降38.6%（P<0.001）。这是由于M细胞顶层膜表面只有形态、数量不等的微绒毛，刷状缘缺失导致碱性磷酸酶活性下降。图2.8Caco-2细胞模型与M细胞模型的ALP活性比较（x±s，n=6）2.3.4.3凝集素-9（Galectin-9）的表达WesternBlot结果显示，与Caco-2细胞模型相比，M细胞模型中凝集素-9的表达上调（比值为1.3:1，见图2.9a）；免疫细胞化学染色结果图2.9（b）中M细胞模型的荧光强度较强，同样证实了凝集素-9表达上调这一结果。28 图2.9Caco-2细胞模型与M细胞模型中凝集素-9的表达（a）WesternBlot图；（b）免疫细胞化学染色图：FITC是二抗上的标记物，DAPI是细胞核染色，Merge是前两幅图重叠。通过Caco-2细胞和人RajiB细胞共培养成功诱导分化建立M细胞模型，其顶层膜表面绒毛退化，只有形态数量不等的微绒毛，缺乏肠上皮细胞由紧密排列的微绒毛形成的典型刷状缘，碱性磷酸酶活性降低，凝集素-9的表达上调。可用于rAAV基因药物的转运研究。29 2.3.5rAAV基因药物跨M细胞转运2.3.5.1rAAV2-EGFP病毒载体的最低检测量将稀释好的各梯度rAAV2-EGFP病毒载体，用根据EGFP设计的引物（EGFP-F、EGFP-R）进行普通PCR扩增，扩增片段大小为598bp。经验证，PCR扩增产物正确，且不同梯度浓度的rAAV2-EGFP病毒载体的扩增产物也依次呈梯度，从图中可看出5号样品的电泳条带清晰，而6号样品只能看到很微43弱的电泳条带，说明rAAV2-EGFP病毒载体的最低检测量在2×10vg-2×10vg之间（图2.10）。图2.10普通PCR检测rAAV2-EGFP病毒载体的最低检测量M：DNAMarkerV；1：阴性对照：模板为去离子水；2-9：依次为10倍梯度稀释的10987rAAV2-EGFP，即模板为2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、65432×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL、2×10vg/mL的rAAV2-EGFP；10：阳性对照：模板为EGFP质粒。2.3.5.2rAAV2-EGFP跨M细胞转运图2.11结果显示2-4号样品没有出现目的扩增片段条带，5号样品出现微弱的目的扩增片段条带（598bp），而6-9号样品出现了明亮的目的扩增片段条带（598bp）。电泳结果说明在Caco-2细胞模型及M细胞模型的AP侧能检测出rAAV2-EGFP，并在4小时M细胞模型BL侧（接受相）的取样中检测出少量的rAAV2-EGFP，而其他时间点在两模型的BL侧都没有检测出rAAV2-EGFP。这表明与Caco-2细胞模型相比，rAAV2-EGFP能通过M细胞模型中的细胞单层从AP侧转运至BL侧，但转运量较少。原因可能是诱导分化成功的M细胞所占比例较小，以致通过M细胞转运至接受相BL侧的rAAV2-EGFP病毒量少；或是M细胞转运并不是rAAV基因药30 物转运的主要途径，有待进一步分析跨细胞转运和细胞旁路转运对rAAV基因药物转运的影响。图2.11rAAV2-EGFP跨M细胞转运M：DNAMarkerV；1：阴性对照：模板为去离子水；2-3：模板为Caco-2细胞模型BL侧在2，4小时的取样；4-5：模板为M细胞模型BL侧在2，4小时的取样；6-7：模板为Caco-2细胞模型AP侧在2，4小时的取样；8-9：模板为M细胞模型AP侧在2，4小时的取样；10：阳性对照：模板为EGFP质粒。2.4小结（1）Caco-2细胞在Transwell上培养14天后，细胞间形成紧密连接，跨膜2电阻（TEER）大于200·cm；顶层膜表面有整齐微绒毛形成的刷状缘；膜两侧的碱性磷酸酶活性肠腔侧（AP侧）显著高于浆膜侧（BL侧），表明细胞单层出现明显的极性分化。在本实验室条件下构建的Caco-2细胞模型在形态上与小肠上皮细胞相似，已完全分化，可加入人RajiB细胞进行共培养诱导转变为M样细胞。（2）通过完全分化的Caco-2细胞和人RajiB淋巴细胞共培养，成功建立M细胞模型，其顶层膜表面绒毛退化，缺乏肠上皮细胞由紧密排列的微绒毛形成的典型刷状缘，只有形态数量不等的微绒毛，碱性磷酸酶活性降低，凝集素-9的表达上调。（3）rAAV跨M细胞转运实验中，与Caco-2细胞模型相比，rAAV2-EGFP能通过M细胞模型中的细胞单层从AP侧转运至BL侧，但转运量较少。原因可31 能是诱导分化成功的M细胞所占比例较小，以致通过M细胞转运至接受相BL侧的rAAV2-EGFP病毒量少；或是M细胞转运并不是rAAV基因药物转运的主要途径，有待进一步分析跨细胞转运和细胞旁路转运对rAAV基因药物转运的影响。32 第3章小鼠肠袢模型研究rAAV基因药物的吸收及表达原位肠袢法是在不影响血流供应及神经支配功能的情况下分离出肠段，将肠段两端结扎，在肠袢内注入供试药液，定时采集样品，是一种在体研究肠吸收的方法。本实验中建立小鼠肠袢模型，在不影响血流供应和神经支配的前提下分离出含有派氏结的肠段，将肠段两端结扎，肠袢内注入rAAV基因药物，给药后2天处死小鼠，取肠袢组织检测是否有转基因表达产物。3.1实验材料、试剂与仪器3.1.1实验材料实验小鼠：BALB/c小鼠（20±2g，雌性）购自福州吴氏动物；rAAV病毒载体（rAAV2-EGFP、rAAV2-LacZ）：由本实验室制备保存；手术器械泉州市温陵医院医疗器械中心免疫组化笔福建迈新中性树脂国药石蜡国药保湿盒福建迈新载玻片江苏世泰盖玻片江苏世泰本章涉及的其他实验材料参考第2章。3.1.2实验试剂Anti-GFPAbcamAnti-Galectin-9AbcamHE染色试剂盒碧云天HRP标记鸡抗兔二抗AbcamDAB显色试剂盒碧云天33 戊巴比妥钠庄盟乙醇国药二甲苯国药双氧水国药甲醛溶液国药EDTA国药柠檬酸三钠国药其余常用试剂国药本章涉及的其他实验试剂参考第2章。3.1.3实验仪器石蜡包埋机亚光医用电子技术有限公司组织脱水机Thermo切片机Leica（莱卡）微波炉格兰仕本章涉及的其他实验仪器参考第2章。3.1.4溶液配制（1）10%中性福尔马林：甲醛100mL，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钠6.5g，去离子水900mL，混合甲醛的操作要在通风橱中进行。（2）3%过氧化氢（H2O2）溶液：取1mL30%过氧化氢溶液，加入9mLPBS溶液混合均匀，现配现用。（3）X-gal染色液：称取0.211g三水合亚铁氰化钾，0.165g铁氰化钾，0.041六水合氯化镁，加去离子水80mL溶解，调pH为7.5定容至100mL。临用前加入X-gal，浓度为1mg/mL，现配现用。34 3.2实验方法3.2.1小鼠肠袢模型的建立及分组给药3.2.1.1原理肠袢法不阻断动物血管及神经功能，药物透过肠上皮细胞后能够被吸收，能避免消化管蠕动及胃内容物排空等对实验结果的影响；最关键的是肠袢法可以不冲洗肠道，肠道菌群不会被破坏，肠道内细菌处于厌氧环境中，整个生理状态接近于自然给药情形，能比较真实全面地反映药物在肠道的吸收情况。3.2.1.2动物模型建立取已禁食12小时（可自由饮水）的BALB/c小鼠（20±2g，雌性），术前腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.6mL/100g），麻醉后固定于手术台上，灯光照射使体温维持在37°C。在腹部左上方打开腹腔（约2cm），暴露肠道，分离出一段有派氏节的肠段（约2cm），用线将两端结扎，形成封闭的肠袢，整个过程尽量保持小肠血管血运的畅通。用注射器将0.1mlrAAV基因药物缓慢注入肠袢内，空白对照组注入相同体积的PBS溶液。将肠袢放回腹腔并将腹腔缝合，尽量避免肠扭转引起肠梗阻，保持体温37°C，肠袢结扎后一直禁食，可自由饮水。3.2.1.3动物分组11将实验小鼠随机分成3组：rAAV2-EGFP组(1×10vg/只）、rAAV2-LacZ组11（1×10vg/只）、空白对照组（等体积PBS溶液），每组3只小鼠。3.2.1.4组织取样给药2天后，脱颈处死小鼠，迅速解剖取出肠袢组织，放入10%中性福尔马林固定液中进行固定。3.2.2HE染色检测组织形态3.2.2.1石蜡包埋步骤（1）固定：将肠组织用PBS溶液清洗一下，立即投入10%中性福尔马林固35 定液中固定，固定12小时左右，不能超过24小时。（2）将固定好的组织块修整后置于广口瓶中，过夜流水冲洗，以便除去组织中的福尔马林。（3）脱水：组织块依次放入70%、80%、90%各梯度乙醇溶液进行脱水，各30分钟，再放入95%、100%乙醇各2次，每次20分钟。（4）透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15分钟，二甲苯I15分钟、II15分钟（至组织透明为止）。（5）浸蜡：组织块放入软蜡I、软蜡II透蜡各30分钟，硬蜡I、硬蜡II中40-50分钟。（6）组织包埋。3.2.2.2HE染色步骤（1）切片：用石蜡切片机进行切片，厚度一般设置为4-10μm。（2）展片：切片放入30%乙醇溶液中进行预展片30秒钟左右后，转移到40°C的水浴锅中进行展片，将平整的蜡片贴片于干净载玻片的1/3处。（3）烤片：切片放于60°C烘箱中烤片30分钟。（4）脱蜡：石蜡切片经二甲苯I、II脱蜡各5分钟。（5）复水：放入100%、95%、90%、80%、70%各梯度乙醇溶液中各3-5分钟，再放入蒸馏水中3分钟。（6）染色：放入苏木精中染色约10-30分钟。（7）水洗：用自来水流水冲洗约15分钟。使切片颜色变蓝即可，但注意流水不能过大，以防切片脱落。（8）分化：将切片放入1%盐酸乙醇溶液中分化，约二秒至数十秒钟，见切片变红，颜色较浅即可。（9）漂洗：切片放入自来水中轻轻漂洗使其恢复蓝色。（10）脱水I：切片入70%乙醇→80%乙醇中各3-5分钟。（11）复染：用0.5%伊红乙醇溶液对比染色1-3分钟。（12）脱水II：将切片放入95%乙醇溶液中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3-5分钟，最后用吸水纸吸干多余的乙醇溶液。（13）透明：切片放入纯酒精、二甲苯等量混合液，二甲苯I、II中各3-5分钟。36 （14）封片：将70%中性树胶（二甲苯稀释）滴于透明后的组织上，盖上盖玻片，封固，待中性树胶干后贴上标签，备用。（15）观察拍照：于显微镜下观察细胞形态并拍照。3.2.3免疫组织化学检测Galectin-9、EGFP的表达（1）石蜡切片，步骤同前，载玻片需要用多聚赖氨酸溶液包被，贴片后，60°C烤片60分钟使蜡熔化。（2）脱蜡：从烘箱中取出后快速放入二甲苯I、II中，各脱蜡10分钟。（3）水化：将切片放入100%、95%、90%、80%、70%各梯度乙醇溶液中复水3-5分钟，再放入蒸馏水中水化3分钟。（4）脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3分钟。（5）抗原修复：柠檬酸微波修复法，即预热柠檬酸缓冲液5分钟，放入切片，高火修复30分钟，室温冷却10分钟后取出切片自来水流水冲洗。PBS冲洗3次，每次3分钟。（6）内源性酶灭活：每张切片加1滴3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，阻断组织中内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。（7）封闭：除去PBS液，每张切片加1滴或50μL的1%BSA溶液，37°C，保湿盒中孵育10分钟，封闭非特异性结合位点。PBS冲洗3次，每次3分钟。（8）滴加一抗：除去PBS，每张切片加1滴第一抗体，保湿盒内于37°C孵育2小时或4°C孵育过夜。（9）取出4°C孵育过夜的切片，室温放置30分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟。（10）滴加二抗：除去PBS溶液，每张切片加1滴二抗，37°C，保湿盒中孵育30分钟，PBS冲洗5次，每次3分钟。（11）DAB显色：除去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察DAB染色效果确定染色时间。（12）苏木素复染：自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。（13）脱水：切片放入70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水乙醇中各3-5分钟。（14）透明：切片放入纯酒精、二甲苯等量混合溶液，二甲苯I、II分别透37 明1-2分钟。（15）封片：将70%中性树胶（二甲苯稀释）滴于透明后的组织上，盖上盖玻片，封固，待中性树胶干后贴上标签，备用。（16）观察拍照。3.2.4X-gal组织化学染色检测β-半乳糖苷酶的表达3.2.4.1原理LacZ基因是一种常用的报告基因，其表达产物β-半乳糖苷酶（β-gal）可催化底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）在特定的染色液中发生反应，产生光学显微镜下可见的蓝色产物，这可用于检测β-半乳糖苷酶的表达。3.2.4.2X-gal染色的pH条件在哺乳动物的组织中，存在内源性β-半乳糖苷酶。在一定条件下，同样可以与X-gal反应生成蓝色产物，造成染色中非特异性背景的出现，干扰对正常染色结果的分析。取小鼠的肠组织，以不同pH值（pH5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5）的X-gal染色液进行染色，从中选出能排除非特异性内源性β-半乳糖苷酶背景染色的pH值。3.2.4.3石蜡切片X-gal染色（1）切片：用石蜡切片机进行切片，厚度一般设置为4-10μm。（2）展片：切片放入30%乙醇溶液中进行预展片30秒钟左右后，转移到40°C的水浴锅中进行展片，将平整的蜡片贴片于干净载玻片的1/3处。（3）烤片：切片放于60°C烘箱中烤片30分钟。（4）脱蜡：石蜡切片经二甲苯I、II脱蜡各5分钟。（5）复水：放入100%、95%、90%、80%、70%各梯度乙醇溶液中各3-5分钟，再放入蒸馏水中3分钟。（6）吸去多余水分，滴加X-gal染色液（1mg/mLX-gal，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾和2mM氯化镁，pH7.5），于湿盒中37°C避光孵育，直至出现阳性蓝色产物。（7）染色过程中观察拍照。38 3.2.5统计学分析实验中所有数据采用SPSS17.0统计学软件进行处理，计量数据以均数±标准差（x±SD）表示，多组数据间两两均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，有统计学意义。3.3实验结果与分析3.3.1组织形态派氏结（Peyer’spatch，PPs）是沿着小肠呈纵向分布的，位于黏膜下的微小淋巴组织（见图3.1a）。在肠集合淋巴小结处，局部黏膜呈圆顶状向肠腔突起，无肠绒毛和小肠腺，其基底部有淋巴细胞。成熟的派氏结是由面积较大的B淋巴细胞滤泡区、镶嵌于滤泡区外的胸腺依赖区（thymus-dependentarea，TDA）及直接位于肠上皮下的被称为上皮下穹隆结构（subepithelialdome，SED）组成。派氏结与肠腔之间被称为滤泡相关上皮（follicle-associatedepithelium，FAE）的单细胞层隔开（见图3.1b）。图3.1派氏结（Peyer’spatch）（a）派氏结结构图；（b）派氏结HE染色（100×）3.3.2Galectin-9(半乳糖凝集素-9)的表达对肠袢组织进行Galectin-9免疫组化染色，Galectin-9阳性细胞为棕色。图3.2（b）显示的是派氏结的滤泡相关上皮（FAE）区域，FAE中的细胞出现了阳39 性棕色变化，其下的淋巴细胞区域中出现个别阳性棕色变化。图3.2（c）、（d）显示肠上皮细胞，黏膜固有层细胞都没有出现阳性棕色变化；说明Galectin-9在派氏结的滤泡相关上皮（FAE）中高表达。图3.2Galectin-9免疫组化染色（a）、（b）派氏结：FAE，滤泡相关上皮（400×），（a）为阴性对照；（c）肠隐窝（400×）；（d）肠绒毛（400×）。3.3.3EGFP的表达对肠袢组织进行EGFP免疫组化染色，EGFP阳性细胞为棕色。图3.3显示EGFP只出现在肠上皮细胞，肠绒毛中心由结缔组织组成的固有层没有出现阳性棕色变化。结果表明对肠袢组织进行rAAV2-EGFP给药2天后，能在肠上皮细胞检测到转基因EGFP的表达。40 图3.3EGFP免疫组化染色分析（a）PBS组肠绒毛的纵截面（100×）；（b）为（a）图的局部放大图（400×）；（c）rAAV-EGFP组肠绒毛的纵截面（100×）；（d）为（c）图的局部放大图（400×）3.3.4β-半乳糖苷酶的表达3.3.4.1X-gal染色pH条件由于哺乳动物组织中存在的是酸性β-半乳糖苷酶，其活性在pH值水平较高时受到抑制。从肠组织X-gal染色的结果（图3.4）可以看出，随pH增高，非特异性背景染色呈逐渐减少趋势。rAAV载体中LacZ基因的表达产物β-半乳糖苷酶的最佳pH为7.3，不同于内源性β-半乳糖苷酶，故实验过程中使用pH7.5的X-gal染色液。图3.4不同pH条件下肠组织的X-gal染色3.3.4.2肠袢组织中β-半乳糖苷酶的表达对肠袢组织进行X-gal染色，检测β-半乳糖苷酶的表达，阳性细胞为蓝色。图3.5是肠袢组织在37°C避光条件下进行X-gal染色的结果，随着孵育时间的延长，肠组织切片中并没有出现阳性蓝色变化。此结果表明对肠袢组织进行41 rAAV2-LacZ给药2天后，在肠上皮细胞未检测到转基因LacZ的表达。图3.5肠袢组织X-gal染色3.4小结（1）肠袢组织Galectin-9免疫组化染色结果说明，肠上皮细胞、黏膜固有层细胞无Galectin-9的表达，Galectin-9在派氏结的滤泡相关上皮（FAE）中高表达。（2）肠袢组织EGFP免疫组化染色结果表明，对肠袢组织进行rAAV2-EGFP给药2天后，能在肠上皮细胞检测到转基因EGFP的表达。（3）肠袢组织进行X-gal染色结果表明，对肠袢组织进行rAAV2-LacZ给药2天后，在肠上皮细胞未检测到LacZ的表达。（4）肠袢组织进行rAAV2基因药物给药2天后，在肠上皮细胞中能检测到EGFP的表达，却检测不到LacZ的表达。原因可能是LacZ的表达效率较低，X-gal染色的灵敏度不如免疫组化染色，以致无法检测转基因LacZ的表达。42 第4章rAAV基因药物在小鼠体内的口服吸收及表达本实验中对BALB/c小鼠（给药前禁食24小时）灌胃给予rAAV基因药物，给药后7天处死小鼠，取肠组织检测是否存在rAAV载体基因组与转基因表达产物，研究rAAV基因药物在小鼠体内的口服吸收及表达。4.1实验材料、试剂与仪器4.1.1实验材料本章中用到的其它实验材料见第2章和第3章。4.1.2实验试剂基因组DNA小量抽提试剂盒碧云天本章中用到的其它实验试剂见第2章和第3章。4.1.3实验仪器倒置荧光显微镜Nikon本章中用到的其它实验仪器见第2章和第3章。4.2实验方法4.2.1口服rAAV基因药物4.2.1.1小鼠灌胃给药取已禁食24小时（可自由饮水）的BALB/c小鼠（20±2g，雌性），灌胃给予rAAV基因药物，给药后再给予一定体积无菌PBS溶液，让药物能充分进入胃。4小时后恢复饮食。4.2.1.2动物分组11将实验小鼠随机分成3组：rAAV-EGFP组(1×10vg/只）、rAAV-LacZ组43 11（1×10vg/只）、空白对照组（等体积PBS溶液），每组3只小鼠。4.2.1.3组织取样给药后在3小时，6小时，1天，3天，5天，7天这6个时间点收集小鼠粪便，置于1.5mL离心管中。给药7天后，脱颈处死小鼠，迅速解剖取出肠道组织，分成2份：一份放入-80°C保存，用于提取基因组DNA；一份放入固定液中进行固定。4.2.2HE染色检测组织形态4.2.2.1石蜡包埋步骤步骤参见第3章4.2.2.2HE染色步骤步骤参见第3章4.2.3免疫组织化学检测EGFP的表达步骤参见第3章4.2.4冰冻切片4.2.4.1原理EGFP表达后发出绿色荧光，可用于做基因表达检测的报告基因，但是EGFP蛋白属于高度可溶性蛋白，在组织包埋剂切片过程中容易产生荧光淬灭或者蛋白流溢等问题，反而不能很好的观察EGFP表达的荧光，使得EGFP失去了原本作为报告基因的意义。本实验中不仅用相应抗体检测EGFP的表达，还通过一种简单的固定方法检测EGFP的表达。4.2.4.2操作步骤（1）取肠组织置于3.7%甲醛-PBS溶液中浸泡，4°C固定24小时；（2）将肠组织从3.7%甲醛-PBS溶液中取出，吸水纸控干后，置于PBS溶液中浸泡，4°C浸润24小时；44 （3）将肠组织从PBS溶液中取出，吸水纸控干后，将肠组织修整成适当大小，用OCT胶进行包埋，置于液氮中速冻后存入超低温冰箱（-80°C）；（4）调节冰冻切片机温度至-30°C，将刀片置于刀片夹中固定，预冷大约1小时；（5）从-80°C冰箱中取出包埋好的肠组织，置于切片机的冷冻室内平衡温度30~45分钟后进行切片；（6）将载玻片正面贴到切片上，使切片利用温差粘附到载玻片上；（7）封片，将组织载玻片置于显微镜下观察，拍片。4.2.5X-gal组织化学染色检测β-半乳糖苷酶的表达步骤参见第3章4.2.6rAAV病毒基因组的分布通过从小鼠粪便及肠组织中提取DNA，检测其中是否有rAAV病毒基因组的存在，了解口服rAAV基因药物的吸收、分布情况。4.2.6.1组织基因组DNA提取实验步骤如下：（1）取不超过25mg的组织，尽可能剪切成小的碎片，加入180μL样品裂解液A。注：请勿加入过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会加快裂解速度，提高裂解效果，使用新鲜或冻存的组织均可。（2）加入20μL蛋白酶K，涡旋混匀，55°C水浴孵育至完全裂解。注：在孵育期间可以取出样品涡旋以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。完全裂解后的组织可以呈黏稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。（3）清除RNA(可选做)。若想获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL100mg/mLRNaseA，涡旋混匀。室温（15-25°C）放置2分钟。（4）最高速剧烈涡旋15秒。加入200μL样品裂解液B，涡旋混匀。70°C孵育10分钟。45 注：加入样品裂解液B后需要立即涡旋混匀。加入样品裂解液B后可能会出现白色沉淀，但大多数情况在70°C孵育后会溶解。即使70°C孵育后仍有白色沉淀也不会对后续实验产生干扰。有些组织在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需要剧烈晃动或涡旋样品，以尽量破坏凝胶状物。（5）加入200μL无水乙醇，涡旋混匀。注：加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，这属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。（6）把步骤5中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g（约≥8000rpm）离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。（7）加入500μL洗涤液I，≥6000g（约≥8000rpm）离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。（8）加入600μL洗涤液II，≥18000g（约≥12000rpm）离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。（9）再≥18000g（约≥12000rpm）离心1分钟，以去除残留的乙醇。注：不能为省略本步骤而把步骤8的离心时间延长。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。（10）将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入50-200μL洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。（注：洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。）4.2.6.2抽提粪便中病毒DNA（1）取0.05g粪便，加入500μL去离子水，涡旋混匀后，12000rpm离心5分钟，取200μL上清置于1.5mL离心管中；（2）向每管样品中加入DNaseI（3U/μL）5μL，轻轻混匀，置于25°C水浴中孵育1小时；（3）向每管样品中加入200μL的2×ProteinaseK溶液，用移液枪轻轻吹打混匀，置于37°C水浴中孵育1小时；（4）按照25:24:1的比例配制酚、氯仿及异戊醇混合液。等体积（即400μL/管）向每管样品中加入配制好的酚、氯仿及异戊醇混合液。轻轻颠倒离心管4~8次混匀，12000rpm室温离心5分钟；46 （5）取出离心管，从每管样品中轻轻吸取离心后上层水相200μL，加入到新的离心管中，向每管加入0.1倍体积（20μL）的3M醋酸钠（pH5.2），涡旋振荡离心管混匀；（6）向每管样品中加入2.5倍体积（500μL）的无水乙醇，移液枪轻轻吹打混匀，置于-20°C中静置1小时，沉淀病毒DNA；（7）取出离心管，14000rpm室温离心15分钟。弃上清，将离心管倒置于吸水纸上控干；（8）向每个离心管中加入200μL的70%乙醇，轻轻吹打洗涤病毒DNA。14000rpm室温离心5分钟；（9）弃70%乙醇，将离心管倒扣吸水纸上控干后，室温静置挥发10分钟。DNA沉淀干燥后溶于一定体积的TE中，于4°C中保存。4.2.6.3PCR反应体系及条件以从肠组织或粪便中提取的基因组DNA为模板，引物根据EGFP设计，按照下列组分配制PCR反应体系，设置阴性对照（模板加去离子水）及阳性对照（模板为EGFP质粒）。PCR反应体系：dNTP（2.5mM）1.6μL10×Buffer2.0μLTaq酶（5U/μL）0.3μL上游引物（EGFP-F）0.8μL下游引物（EGFP-R）0.8μLDNA模板1.0μL去离子水13.5μL总体积20μLPCR反应条件如下：95°C10min1个循环95°C15s61°C20s35个循环72°C30s4°C∝47 4.2.7统计学分析实验中所有数据采用SPSS17.0统计学软件进行处理，计量数据以均数±标准差（x±SD）表示，多组数据间两两均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，有统计学意义。4.3实验结果与分析4.3.1肠组织形态肠道组织管壁的层次结构基本相同，由黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜组成。十二指肠的黏膜和黏膜固有层向肠腔突起，形成不规则的叶状或柱形绒毛（见图4.1a）。绒毛是由黏膜上皮及固有层向肠腔内突起而成的，故绒毛中心是固有层，表面覆以上皮，上皮间混杂存在杯状细胞。空肠绒毛呈舌状，回肠绒毛的高度较低，宽度也较小，呈指突状（见图4.1b，c）。黏膜层可见淋巴小结，空肠的淋巴小结较少，散在分布，回肠的淋巴小结发达，常聚集成集合淋巴小结（见图4.1d）。肠隐窝或称肠腺广泛分布于小肠黏膜的固有层中，是小肠黏膜上皮下陷至固有层形成的单管状腺，开口于小肠绒毛之间（见图4.1a，b，c）。构成肠腺的主要细胞是柱状细胞，其间插有杯状细胞。柱状细胞是较幼稚的细胞，约2-3天更新一次，绒毛顶部的柱状细胞上皮经常脱落。结肠黏膜层有皱襞，无绒毛，黏膜上皮为单层柱状，单层柱状上皮间嵌有大量杯状细胞，固有层内有大量肠腺，长而密，含杯状细胞多（见图4.1e）。48 图4.1肠道组织切片HE染色图（100×）（a）正常十二指肠肠壁：由黏膜层、黏膜下层及浆膜层组成，黏膜和黏膜固有层向肠腔突出，形成叶状或柱形绒毛。（b）正常空肠肠壁：空肠绒毛呈舌状。（c）正常回肠肠壁：回肠绒毛呈叶片状。（d）肠淋巴小结。（e）正常结肠肠壁：黏膜上皮为单层柱状，杯状细胞多；箭头所指为黏膜固有层淋巴小结。4.3.2病毒基因组分布图4.2电泳结果显示，在小鼠粪便中没有检测到rAAV载体基因组的存在；图4.3电泳结果显示，在rAAV-EGFP组的十二指肠、空肠中检测出rAAV载体基因组，在回肠、结肠、胃组织中没有检测到rAAV载体基因组的存在。结果表明rAAV2-EGFP口服灌胃给药后，第7天在十二指肠、空肠中检测出rAAV病毒载体基因组。49 图4.2PCR分析小鼠粪便中提取的DNAM：DNAMarkerV；1：阴性对照：模板为去离子水；2-7：模板依次为从rAAV-EGFP组的小鼠粪便中抽提的DNA（取样时间为3小时，6小时，1天，3天，5天，7天）；8：模板为从PBS组的小鼠粪便中抽提的DNA；9：阳性对照：模板为EGFP质粒。图4.3PCR分析小鼠肠组织中提取的DNAM：DNAMarkerV；1：阴性对照：模板为去离子水；2-6：模板依次为从PBS组组织（十二指肠、空肠、回肠、结肠、胃）中提取的基因组DNA；7-11：模板依次为从rAAV-EGFP组组织（十二指肠、空肠、回肠、结肠、胃）中提取的基因组DNA；12：阳性对照：模板为EGFP质粒。4.3.3EGFP的表达对肠组织切片进行EGFP免疫组化染色，EGFP阳性细胞为棕色，图4.4结果显示不仅在肠上皮细胞中有EGFP的表达，肠绒毛中心由结缔组织组成的固有层也出现了阳性棕色变化，表明rAAV2-EGFP灌胃给药7天后，能在肠上皮细胞及黏膜固有层细胞中检测到EGFP的表达。将灌胃给药后的肠组织经3.7%甲醛-PBS溶液固定后进行冰冻切片，检测绿色荧光蛋白的表达。图4.5（b）、（d）中能观察到清晰的肠绒毛，组织边界明显，荧光表达明暗分明，能反应EGFP在肠组织中的表达情况。图4.5（a）、（c）中50 PBS组小鼠肠组织存在微弱的自发荧光，rAAV2-EGFP组的荧光极显著强于PBS组（图4.5e，P<0.001），荧光集中在肠绒毛的肠上皮细胞及黏膜固有层，与免疫组化结果一致。图4.4EGFP免疫组化染色分析（a）PBS组肠绒毛（400×）；（b）rAAV-EGFP组肠绒毛（400×）51 图4.5rAAV2介导EGFP在肠组织中的表达（x±s，n=5，***：P<0.001）（a）、（b）分别是PBS组、rAAV-EGFP组的肠绒毛（40×）；（c）、（d）分别是PBS组、rAAV-EGFP组的肠绒毛（100×）；（e）肠组织中EGFP的荧光半定量分析。4.3.4β-半乳糖苷酶的表达对肠组织切片进行X-gal染色，检测β-半乳糖苷酶的表达，阳性细胞为蓝色。图4.6是肠组织在37°C避光条件下进行X-gal染色的结果，不仅肠上皮细胞出现阳性蓝色变化，黏膜固有层也出现了少量阳性蓝色细胞。表明rAAV2-LacZ灌胃给药7天后，能在肠绒毛的上皮细胞及固有层中检测到LacZ的表达。图4.6肠组织的X-gal染色（a）LacZ组肠绒毛（100×）；（a）LacZ组肠绒毛（400×）4.4小结（1）rAAV基因药物口服后，第7天能在十二指肠、空肠中检测出病毒载体基因组，而在回肠、结肠、胃及粪便中未检测到。（2）对肠组织进行EGFP免疫组化染色，结果显示不仅在肠上皮细胞中有52 EGFP的表达，肠绒毛中心由结缔组织组成的固有层也出现转基因表达，表明rAAV2-EGFP灌胃给药，7天后能在肠绒毛的上皮细胞及黏膜固有层中检测到EGFP的表达。（3）将灌胃给药后的肠组织经3.7%甲醛-PBS溶液固定后进行冰冻切片，检测绿色荧光蛋白的表达。rAAV2-EGFP组的荧光显著强于PBS组，荧光集中在肠绒毛的肠上皮细胞及固有层，与免疫组化结果一致。（4）对肠组织进行X-gal染色，检测β-半乳糖苷酶的表达，阳性细胞为蓝色。结果显示不仅肠上皮细胞出现阳性蓝色变化，肠绒毛中心由结缔组织组成的固有层也出现了少量阳性蓝色细胞。表明rAAV2-LacZ灌胃给药，7天后能在肠绒毛的上皮细胞及固有层中检测到LacZ的表达。（5）将rAAV基因药物灌胃给药，7天后能在肠绒毛的上皮细胞及固有层中检测到转基因的表达产物。53 第5章结论本实验通过构建M细胞模型、小鼠肠袢模型与小鼠口服灌胃给药这3种方法探讨了rAAV基因药物的转运、吸收及转基因表达。建立的M细胞模型符合实验要求，在rAAV基因药物跨M细胞转运实验中，rAAV能通过M细胞模型中的细胞单层从AP侧转运至BL侧，但病毒转运量较少。目前实验结果只能说明rAAV基因药物通过M细胞进行了少量转运，但此途径是否为rAAV基因药物转运的主要途径，有待进一步分析跨细胞转运和细胞旁路转运对rAAV基因药物转运的影响。小鼠肠袢模型给药2天后能在肠上皮细胞中检测到转基因EGFP的表达；小鼠口服灌胃给药7天后在十二指肠、空肠中检测出病毒载体基因组，并在肠上皮细胞与黏膜固有层细胞中检测到转基因EGFP、LacZ表达，但不同转基因的表达效率存在一定差别。实验结果表明rAAV基因药物跨M细胞进行了少量转运，并证实了rAAV基因药物口服吸收的可行性，但口服rAAV基因药物的有效表达仍面临许多困难。可以考虑药物剂型、辅料等方面进行制剂处方的优化，研究口服rAAV基因药物在肠道吸收和转运的影响因素，为排除胃肠道传递屏障、增强药物稳定性、促进药物吸收、提高rAAV基因药物的生物利用度提供思路，为今后促进口服rAAV基因药物的剂型设计和临床应用奠定基础。54 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致谢在这凤凰花开的季节，我即将踏上毕业的征程。在此论文完成之际，谨向我的导师刁勇教授表示最崇高的敬意和最衷心的感谢！在这三年的硕士研究生涯中，刁老师不仅在科研和学业上对我谆谆教诲，而且在生活上的热心关怀和无私帮助让我深深感动。刁老师严谨的治学态度，敏锐的科研思路以及阔达的人生态度都使我终生受益！感谢李招发老师、杨会勇老师以及黄晓平博士在学习及实验过程中给予我认真的指导及帮助！感谢分子药物学研究院的许瑞安教授，刘嘉老师，王晓老师、徐韬老师等老师对我的支持和鼓励！感谢同学陈婷、成志云、郭晶、张倩、汪宁卿等在实验上的帮助。感谢分子药物学研究院这个大家庭，感谢所有在学习和生活中给予我无私关怀和帮助的人，谢谢你们！最后，我要把深深的谢意献给我的父母，感谢你们这二十多年来的辛苦栽培和爱护，因为有你们，才让我的步伐走得更加的坚定！本论文是在国家自然科学基金资助项目（30973051）等资助下完成的，再次致以诚挚的谢意！李佳59 60 个人简历个人简历：姓名：李佳出生日期：1988.02.29获得学士学位的学校和时间：贵州大学，2010.06获得硕士学位的学校和时间：华侨大学，2013.06文章发表情况：李佳，苏少鹏，刁勇.降低重组腺相关病毒载体中空病毒颗粒的对策，海峡药学，2013年参编论著：腺相关病毒载体—从病毒到基因治疗药物，中国科学出版社参加会议：2010年第二届“定量药理与新药评价”国际学术会议2012年福建省药学会年度会议61